顧玲玲田玉平/ 1.上海交通大學(xué)； .上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院

防腐劑3，5-二氯苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)*

顧玲玲1，2田玉平2/ 1.上海交通大學(xué)； 2.上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院

采用制備色譜法對3，5-二氯苯甲醇原料進(jìn)行提純，通過質(zhì)譜（MS）、核磁共振譜圖（NMR）等對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。差示掃描量熱法（DSC）、液相色譜法（LC）測定該原料純度達(dá)到99.0%。采用重量-容量法制備3，5-二氯苯甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)F檢驗(yàn)法及數(shù)學(xué)模型驗(yàn)證其均勻性和穩(wěn)定性。分別采用紫外法和示差法對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值進(jìn)行驗(yàn)證。該研究成果表明，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值為99.0 μg/mL，不確定度評定結(jié)果為U= 1.0 μg/mL（k= 2）。

二氯苯甲醇；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；均勻性；穩(wěn)定性；特性量值；不確定度

0 引言

3，5-二氯苯甲醇為白色或淡黃色晶體狀固體，主要用作化妝品中的水溶液、護(hù)膚乳液和膏霜、凝膠制品的防腐劑。低濃度的3，5-二氯苯甲醇能抑制化妝品中營養(yǎng)成分的細(xì)菌生長與生成，避免化妝品產(chǎn)生變質(zhì)現(xiàn)象，但過量使用會對人體造成多種急性或慢性危害。各大化妝品生產(chǎn)廠商及監(jiān)管機(jī)構(gòu)均通過嚴(yán)格檢測化妝品中防腐劑含量來控制產(chǎn)品的質(zhì)量。目前主要采用的檢測方法有：GC-FID、GCNPD、GC-ECD、GC-MS、GC-MS/MS、HPLC-DAD、HPLC-FLD、HPLC-MS、HPLC-MS/MS等，但這些檢測方法均為相對法，都需要相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。為完善該分析方法的標(biāo)準(zhǔn)體系，需研制3，5-二氯苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

3，5-二氯苯甲醇粗提品（純度97%，上海國藥集團(tuán)）；乙腈（色譜純，默克公司）；甲醇（色譜純，Thermo Fisher公司）

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國珀金埃爾默公司Clarus 500，美國瓦里安1200 L，美國安捷倫公司5975）；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Quattro Premier XE VAB430）；核磁共振儀（美國瓦里安500 MHz）；傅立葉變換紅外光譜儀（PE Spotlight300）；差示掃描量熱儀（DSC）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；卡爾?費(fèi)休水分測定儀（Metrohm 841 Titrando）；等離子體質(zhì)譜儀（ELAN DRC-e）；液相色譜儀（Agilent1100）。

1.3 原料提純

3，5-二氯苯甲醇原料經(jīng)乙腈溶解成500 mg/mL的溶液，注射2 mL進(jìn)入制備色譜儀，以乙腈：0.1%甲醇水溶液= 60∶40為制備液相色譜的流動相，5 mL/min淋洗，收集器在2.5～3.5 min收集經(jīng)制備色譜柱分離的3，5-二氯苯甲醇溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至近干，控制氮吹儀溫度約40 ℃，氮?dú)獯蹈桑瑢⑵浞旁谡婵崭稍锵鋬?nèi)，控制真空度≤0.02 MPa、溫度40 ℃保持12 h，得到3，5-二氯苯甲醇純物質(zhì)。重復(fù)上述步驟數(shù)次制備目標(biāo)添加物。

1.4 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

紅外光譜測定條件：采用傅立葉變換紅外光譜儀，用KBr壓片法得到紅外光譜圖。質(zhì)譜測定條件：采用超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜，電噴霧電離源，負(fù)離子掃描方式；離子源溫度200 ℃；霧化氣25 mL/min；氣簾氣50 mL/min。

核磁共振波譜測定條件：采用400 MHz核磁共振譜圖，DMSO-d6（含TMS）氘代試劑，25 ℃條件下測得氫譜和碳譜。

氣相色譜質(zhì)譜測定條件：氣相色譜進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比1∶20，DB-5色譜柱30 m×0.25 mm ×0.25 μm，程序升溫條件100 ℃（保持1 min），20 ℃/min升至250 ℃（保持2 min）。質(zhì)譜測定條件：EI離子源，70 eV，傳輸線溫度220 ℃，掃描范圍45～400 amu。

1.5 純度測定

1.5.1 差示掃描量熱儀（DSC）法

差示掃描量熱儀平行測定純度9次。

1.5.2 高效液相色譜儀測定

高效液相色譜儀平行測定純度9次。純度測定條件：流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：乙腈。流動相梯度條件：0 min時(shí)流動相A為90%；10 min內(nèi)流動相A降低至70%，并保持2 min。流速：0.6 mL/min；檢測波長：260 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5.3 卡爾?費(fèi)休法水分測定

采用卡爾?費(fèi)休水分測定儀（Metrohm 841 Titrando），并參照GB/T 606-2003《通用方法-卡爾?費(fèi)休法》測定水分含量3次。

1.5.4 等離子體質(zhì)譜儀測定

使用ELAN DRC-e等離子體質(zhì)譜儀，并參照EPA 6020A-2007《電感耦合等離子體質(zhì)譜法》對鉀、鈣、鎂、銅、鐵、猛、鋅等72種無機(jī)離子進(jìn)行測定。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

在超凈實(shí)驗(yàn)室，控制室溫在（20±4）℃范圍，稱取3，5-二氯苯甲醇0.024 99 g于250 mL的棕色容量瓶中，緩慢加入甲醇約50 mL，渦旋2 min。待3，5-二氯苯甲醇全部溶解后繼續(xù)加入甲醇，并定容至刻度，渦旋2 min后轉(zhuǎn)移至1 mL的棕色安瓿瓶中，在低溫4 ℃下避光保存并熔封。

1.7 均勻性檢驗(yàn)

采取隨機(jī)抽樣的方式抽取15瓶，用高效液相色譜法對每個(gè)樣品平行測定3次。

1.8 穩(wěn)定性考察

連續(xù)監(jiān)測1 a，在儲存條件下以先密后疏的原則，間隔15 d、30 d、60 d、90 d的時(shí)間抽取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行長期穩(wěn)定性監(jiān)測。

連續(xù)監(jiān)測15 d，在室溫20～35 ℃條件下分別間隔0.5 d、1 d、2 d、3 d的時(shí)間抽取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行短期穩(wěn)定性監(jiān)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提純方式比較

比較重結(jié)晶和制備液相色譜兩種提純方式，結(jié)果顯示，經(jīng)過重結(jié)晶方式提純獲得的3，5-二氯苯甲醇很難除去同分異構(gòu)體，因此選擇通過制備色譜的方法對3，5-二氯苯甲醇進(jìn)行提純。

2.2 定性結(jié)果

通過質(zhì)譜、核磁、紅外、紫外等譜圖與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比較，以及將采集的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫檢索，與NIST譜庫中標(biāo)準(zhǔn)譜圖的匹配超過90%，如圖1所示。由此可以看出，提純的3，5-二氯苯甲醇結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確。

2.3 純度結(jié)果分析

2.3.1 采用差示掃描量熱儀法測試9次，結(jié)果為99.0%、98.9%、99.3%、99.1%、99.0%、98.8%、98.9%、99.1%、99.0%。測定結(jié)果的平均值為99.0%，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2%。

圖1 提純的3，5-二氯苯甲醇掃描質(zhì)譜圖與NIST譜庫標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對

2.3.2 采用高效液相色譜儀測試9次，結(jié)果為99.3%、99.0%、99.1%、98.8%、99.3%、99.5%、98.7%、99.4%、98.9%。測定結(jié)果的平均值為99.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%。

2.3.3 由于水分、無機(jī)離子等在色譜儀中沒有響應(yīng)，所以另外測定其含量?？?費(fèi)休水分儀測定提純物的水分含量為0.02%，ELAN DRC-e等離子體質(zhì)譜儀測定無機(jī)金屬元素總含量小于0.001%。按照面積歸一化計(jì)算，P= （100%- p1- p2） p3

式中：P —— 固體物質(zhì)的純度，%；

p1—— 水分的含量，%；

p2—— 無機(jī)雜質(zhì)的含量，%；

p3—— 液相色譜儀測得的色譜純度，

通過計(jì)算得到：P= 99.0%。

取差示掃描量熱儀和液相色譜儀等測定結(jié)果的平均值作為純度測定值，測定純度為99.0%。

2.4 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)顯著性水平在α= 0.05時(shí)，由F分布臨界值表查得，F(xiàn)0.05= 2.04。3，5-二氯苯甲醇均勻性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。F值小于臨界的Fα值，即均勻性符合F檢驗(yàn)規(guī)則。

表1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性考察結(jié)果

表2和表3分別為長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)。

表2 長期穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)

表3 短期穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)

根據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》，表2數(shù)據(jù)表明，所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在儲存條件下穩(wěn)定期為1 a。表3數(shù)據(jù)同理表明，所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在室溫條件20～35 ℃下短期穩(wěn)定性超過15 d。

2.6 特性量值的驗(yàn)證

采用高效液相色譜儀的紫外法和示差法兩種不同原理的方法測定研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行測定9次。使用安捷倫Zorbax-C18 色譜柱，型號4.6 mm ×250 mm ×5 μm。流動相測定條件與1.5.2液相條件相同，測定結(jié)果見表4。

對測定結(jié)果用格拉布斯（Grubbs）準(zhǔn)則進(jìn)行組內(nèi)可疑值的檢驗(yàn)、科克倫（Cochrane）準(zhǔn)則進(jìn)行組間數(shù)據(jù)等精度檢驗(yàn)、狄克遜（Dixon）準(zhǔn)則進(jìn)行平均值的離群值檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果表明，高效液相色譜紫外及高效液相示差兩種不同原理的檢測方法對研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的驗(yàn)證數(shù)據(jù)組間無差異，組內(nèi)數(shù)據(jù)亦無差異，各組平均值之間也無差異。

表4 特性量值驗(yàn)證數(shù)據(jù)及數(shù)理統(tǒng)計(jì) 單位：μg?mL-1

2.7 不確定度評定

所研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)通過質(zhì)量-容量法制備而成。量值是基于目標(biāo)添加物的純度、稱重值及定容體積計(jì)算而得，因此不確定度由三部分組成：（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性差異引起的不確定度；（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度；（3）目標(biāo)添加物的純度、容量瓶及天平稱重引入的不確定度。

2.7.1 均勻性差異引起的不確定度

各瓶間的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sbb等同于均勻性差異導(dǎo)致的不確定度分量ub，

2.7.2 穩(wěn)定性引起的不確定度

參照J(rèn)JF 1006-1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)》和JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》，uT= s（β1）X

式中：s（β1） —— 斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

X —— 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定期限

穩(wěn)定性引入的不確定度可由長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性引入不確定度合成，計(jì)算公式為

2.7.3 目標(biāo)添加物的純度、容量瓶及天平稱重引入的不確定度

目標(biāo)添加物純度由兩種不同原理的方法測定獲得，純度引入的不確定度由兩種方法不確定度進(jìn)行合成，uchar1= 0.12%。

制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用的是體積為250 mL的A級容量瓶，根據(jù)JJG 196-2006 《常用玻璃容器》，250 mL 的A級容量瓶最大允許誤差為±0.15 mL。假設(shè)其為三角分布，則有：

溫度變化引起的不確定度（uchar3）：在超凈實(shí)驗(yàn)室制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)室的溫度范圍為20 ℃±4 ℃。在該溫度范圍，容量瓶體積由于溫度變化而產(chǎn)生的變化可以忽略不計(jì)。制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基體甲醇（體積膨脹系數(shù)為1.20×10-3/℃）隨溫度變化其體積變化大。假設(shè)為均勻分布，以甲醇為基體的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于溫度引起的不確定度為

天平稱重引入的不確定度（uchar4）有幾部分不確定度分量組成：（1）測量重復(fù)性引入的不確定度；（2）目標(biāo)添加物測量不準(zhǔn)確引入的不確定度；（3） 天平分辨力引入的不確定度。根據(jù)天平校準(zhǔn)證書，測量重復(fù)性引入的不確定度為0.029 mg。電子天平最大允許誤差為±0.03 mg，假設(shè)其為均勻分布，該部分引入的不確定度分量為0.017 mg。電子天平分辨力0.01 mg，假設(shè)服從均勻分布，該部分引入的不確定度分量為0.002 9 mg。

因此天平稱重引入的不確定度為上述幾部分的合成，uchar4= 0.035 mg。

目標(biāo)添加物的純度、容量瓶及天平稱重等引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

式中：P —— 目標(biāo)添加物的純度，%；

V —— 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的體積，mL；

M —— 目標(biāo)添加物的質(zhì)量，g

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度有uT、ub、uchar三部分合成，由此標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3，5-二氯苯甲醇的擴(kuò)展不確定度為U= kuCRM= 1.0 μg/mL（k= 2）。

3 結(jié)語

研制了3，5-二氯苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，特性量值為99.0 μg/mL，擴(kuò)展不確定度為1.0 μg/mL（k= 2）。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程量值準(zhǔn)確可靠，且符合均勻性穩(wěn)定性要求。本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制能夠嚴(yán)格、準(zhǔn)確、可靠地監(jiān)控相關(guān)產(chǎn)品中3，5-二氯苯甲醇防腐劑含量，為日化用品的產(chǎn)品質(zhì)量把好質(zhì)量關(guān)，從而保障人民生活健康。同時(shí)為各檢測實(shí)驗(yàn)室提供可靠的檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將有效促進(jìn)我國相關(guān)產(chǎn)品的行業(yè)檢測規(guī)范。

［1］ 全國標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)委員會（SAC/TC118）.GB/T 150000.1～3-2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品 定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

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Certified reference material for preservative 3， 5- dichlorbenzyl alcohol

Gu Lingling1，2， TianYuping2
（1.Shanghai Jiao Tong University； 2.Shanghai Institute of Measurement and Testing Technology）

Preparative chromatography was applied to purify the raw material of 3， 5- dichlorbenzyl alcohol， whose structure was confirmed by mass spectrometry （MS）and nuclear magnetic resonance （NMR）.The purity of the raw material reached 99.0%， which was determined by differential scanning calorimetry（DSC） and liquid chromatography （LC）.The certified reference material for 3， 5- dichlorbenzyl alcohol was prepared by weight-capacity method.The homogeneity and stability were verified by F test and mathematical model.Ultraviolet and differential spectrophotometry were respectively adopted to verify the property value.The research results indicated that the property value of the certified reference material for 3， 5- dichlorbenzyl alcohol was 99.0 μg/mL with an uncertainty of 1.0 μg/mL （k= 2）.

dichlorbenzyl alcohol；reference material； homogeneity；stability；property value； uncertainty

上海市技術(shù)性貿(mào)易措施應(yīng)對專項(xiàng)（12TBT003）；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011QK094）