魏 靜，陳 力，鄧亞君，鄒 祥，徐興然（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715）

液體發(fā)酵的桑黃多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響

魏 靜，陳 力，鄧亞君，鄒 祥，徐興然*
（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400715）

研究液體發(fā)酵分離純化得到的桑黃多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響。研究桑黃多糖對(duì)小鼠的免疫器官、碳廓清率以及IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)桑黃多糖能顯著提高小鼠胸腺重量和脾臟重量，增強(qiáng)小鼠碳廓清率，增加IL-2和IFN一γ的含量，降低IL-1、IL-6、TNF-α的含量。證實(shí)桑黃多糖能顯著增強(qiáng)小鼠的機(jī)體免疫力，有一定的抗炎作用。

液體發(fā)酵，桑黃多糖，小鼠，免疫，細(xì)胞因子

桑黃是一種珍貴的藥用真菌，是國(guó)際公認(rèn)抗癌效果較好的藥物，它的主要活性成分是桑黃多糖［1-3］。現(xiàn)代研究表明，桑黃多糖通過(guò)細(xì)胞調(diào)節(jié)和體液免疫等提高機(jī)體免疫力而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［4-5］。目前，國(guó)內(nèi)外有各種桑黃類(lèi)產(chǎn)品，包括抗癌藥品、提高機(jī)體免疫力的保健品等，市場(chǎng)需求量較大。

然而，桑黃的藥理研究大多使用的是桑黃子實(shí)體提取物，子實(shí)體栽培周期長(zhǎng)，容易受自然氣候和原料等的限制［6］。隨著現(xiàn)代抗生素工業(yè)的迅速發(fā)展，液體發(fā)酵技術(shù)也廣泛應(yīng)用到藥用真菌生產(chǎn)領(lǐng)域，該技術(shù)具有可大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)、周期短、產(chǎn)量高和生產(chǎn)效益高等優(yōu)點(diǎn)［7］。實(shí)驗(yàn)室利用桑黃發(fā)酵得到菌絲體［6］，通過(guò)分離純化制得桑黃多糖，本實(shí)驗(yàn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部保健食品檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003版）［8］關(guān)于增強(qiáng)免疫力功能評(píng)價(jià)，研究該桑黃多糖對(duì)小鼠的免疫器官、碳廓清率以及IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、 IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的影響，為其廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種（KM）小鼠 SPF級(jí)，雄性，13～17 g，購(gòu)自重慶中藥研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（渝）2012-0006；飼料 購(gòu)自重慶中藥研究所；桑黃多糖口服液 由桑黃液體發(fā)酵液及其菌絲體分離純化制成，成分是桑黃多糖（含量為8.8 mg/mL），桑黃菌種由西南大學(xué)藥學(xué)院制藥工程研究室篩選保藏；大腸桿菌 由本實(shí)驗(yàn)室保存；黃芪多糖口服液 艾迪森生物科技有限公司；IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-αELISA試劑盒 美國(guó)RD公司；注射用印度墨汁 Solarbio公司；0.1%Na2CO3。

ELX800型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；離心機(jī) Thermo公司；電子天平 北京賽多利斯儀器

系統(tǒng)有限公司；T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理 100只KM種小鼠，隨機(jī)分為五組：空白對(duì)照組（即為生理鹽水組，NS），黃芪多糖口服液組（陽(yáng)性對(duì)照組，3.36 mL/kg），桑黃多糖口服液低劑量組（5 mg/kg）、中劑量組（10 mg/kg）、高劑量組（20 mg/kg）。每組20只，經(jīng)灌胃給予受試樣品15 d，每天一次。給藥后間隔一定的時(shí)間補(bǔ)充飼料，不間斷給水。最后給藥1 h后進(jìn)行測(cè)定［8-9］。

1.2.2 胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定 各組分別取10只，稱(chēng)重，腹腔注射滅活的大腸桿菌，4 h內(nèi)進(jìn)行齜靜脈取血，小鼠處死后分別取出胸腺和脾臟，剝離脂肪組織，稱(chēng)重，測(cè)定胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)指標(biāo)。

胸腺指數(shù)（脾臟指數(shù)）=胸腺（脾臟）重量/體重

1.2.3 巨噬細(xì)胞功能測(cè)定 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)：各組分別取10只，稱(chēng)重，每鼠尾靜脈注入注射用墨汁（0.1 mL/10 g·bw），注入后立即計(jì)時(shí)，于注入墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中。用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)K：廓清指數(shù)K= （log OD2-log OD10）/（t10-t2）。OD2、OD10分別指注射墨汁后2 min（t2）和10 min（t10）的光密度值。

1.2.4 細(xì)胞因子測(cè)定 由1.2.2齜靜脈取得的全血，室溫放置1 h以上，3000 r/min離心10 min，取血清，備用。按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 用SPSS 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析法，先進(jìn)行F檢驗(yàn)，再進(jìn)行多重比較分析（LSD法）。并應(yīng)用OriginPro 8作圖對(duì)結(jié)果直觀顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定

分別以不同劑量的桑黃多糖口服液、黃芪多糖口服液和生理鹽水灌胃小鼠，研究桑黃多糖對(duì)胸腺、肝臟等免疫器官的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 桑黃多糖口服液對(duì)小鼠免疫器官重量的影響（n=10）Table1 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the weight of mice’s immunity organs（n=10）

由表1多重比較可知，與生理鹽水組比較，中劑量組（10 mg/kg）的桑黃多糖口液能使小鼠胸腺指數(shù)極顯著（p＜0.01）增加，脾臟指數(shù)顯著（p＜0.05）增加，高劑量組（20 mg/kg）的桑黃多糖口服液能使小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)極顯著（p＜0.01）增加。黃芪多糖口服液在說(shuō)明書(shū)指定等效劑量下，小鼠胸腺指數(shù)極顯著（p＜0.01）增加。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能的重要參數(shù)，而桑黃多糖高劑量組的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均高于黃芪多糖口服液組。桑黃多糖說(shuō)明對(duì)小鼠的免疫功能有促進(jìn)作用，且效果優(yōu)于黃芪多糖口服液。

2.2 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

巨噬細(xì)胞吞噬功能是特異性和非特異性免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)，測(cè)定方法有兩大類(lèi)：體內(nèi)法和體外法。本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)法進(jìn)行小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力，指數(shù)越大，則說(shuō)明對(duì)異物的吞噬活性越高。其碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 桑黃多糖口服液對(duì)小鼠碳粒廓清率的影響Table2 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the carbon clearance rate of mice

由表2可知，與生理鹽水組相比，桑黃口服液高劑量組碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)顯著（p＜0.05）提高，說(shuō)明顯著提高了小鼠碳廓清能力；而黃芪多糖口服液只能極顯著（p＜0.01）提高小鼠的碳廓清指數(shù)。說(shuō)明桑黃多糖對(duì)小鼠的非特異性免疫有明顯的促進(jìn)作用。

2.3 細(xì)胞因子測(cè)定

對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的血清進(jìn)行ELISA測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖6。

圖1 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中IL-1的影響Fig.1 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-1 in serum of mice

圖2 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中IL-6的影響Fig.2 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-6 in serum of mice

圖3 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中TNF-α的影響Fig.3 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of TNF-α in serum of mice

圖1～圖3可見(jiàn)，對(duì)于IL-1、IL-6、TNF-α含量，陽(yáng)性對(duì)照組同生理鹽水組相比，能一定程度降低其含量，但無(wú)顯著性差異。而桑黃口服液低、中、高劑量組同生理鹽水組相比，均能極顯著（p＜0.01）降低IL-1的含量，并且呈劑量依賴(lài)型；低、中、高劑量組能顯著（p＜0.05）降低IL-6的含量，且呈劑量依賴(lài)型；高劑量組能顯著（p＜0.05）降低TNF-α的含量。IL-1是一種內(nèi)源性致熱源，炎癥介質(zhì)；IL-6能刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生急性期反應(yīng)蛋白，引起發(fā)熱；TNF-α是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，而在實(shí)驗(yàn)劑量和時(shí)間下，桑黃多糖能顯著降低它們的含量，證實(shí)桑黃口服液有很好的抗炎作用［10-11］。

由圖4～圖6可見(jiàn)，陽(yáng)性對(duì)照組能極顯著的升高IL-2的含量，IL-4和IFN-γ同生理鹽水組相比無(wú)顯著性差異。低劑量組的IL-2、IFN-γ含量同生理鹽水組相比無(wú)顯著性差異，中劑量組能顯著（p＜0.05）的增加IL-2、IFN-γ含量，高劑量組能極顯著的（p＜0.01）增加IL-2、IFN-γ含量。而IL-4含量，各組之間均無(wú)顯著性差異。外源性微生物刺激固有免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以活化T細(xì)胞，并促使輔助性ThO細(xì)胞分化為T(mén)hl或Th2。機(jī)體正常時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞功能處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能；當(dāng)機(jī)體受到異己抗原攻擊時(shí)，Th1和Th2細(xì)胞中某一亞群功能升高，另一亞群功能降低，該現(xiàn)象即為T(mén)h1/Th2漂移［12］。Thl分泌IL-2和IFN一γ細(xì)胞因子，而桑黃多糖能顯著性增加其含量，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫，執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)抗感染、抗病毒等；Th2細(xì)胞分泌的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-4，介導(dǎo)體液免疫，執(zhí)行細(xì)胞外抗感染、抗腫瘤，而桑黃多糖實(shí)驗(yàn)組IL-4的含量雖然高于空白對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異，說(shuō)明桑黃多糖能夠增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫，對(duì)Th1的作用較明顯。

圖4 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中IL-2的影響Fig.4 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-2 in serum of mice

圖5 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中IL-4的影響Fig.5 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IL-4 in serum of mice

圖6 桑黃多糖對(duì)小鼠血清中IFN-γ的影響Fig.6 Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius on the concentration of IFN-γ in serum of mice

3 結(jié)論與討論

免疫功能包括非特異性免疫和特異性免疫。臟器指數(shù)可從側(cè)面反應(yīng)機(jī)體免疫強(qiáng)弱，碳廓清能力反應(yīng)非特異性免疫狀況，細(xì)胞因子的測(cè)定反應(yīng)特異性免疫狀況。白細(xì)胞介素在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，亦可作為內(nèi)源性致熱原，參與敗血癥性或內(nèi)毒素性休克等。IFN-γ能防止病毒在靶細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，可激活NK細(xì)胞，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的溶菌能力。

實(shí)驗(yàn)選用13～17 g的KM種小鼠，避免隨時(shí)間的增加，胸腺退化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響［8，13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑黃多糖能顯著性提高小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增強(qiáng)小鼠碳廓清率，增加IL-2和IFN-γ的含量，降低IL-1、IL-6、TNF-α的含量，具有免疫增強(qiáng)劑的功效，能夠同時(shí)影響非特異性免疫和特異性免疫，顯著增強(qiáng)機(jī)體免疫力，并且具備一定的抗炎作用。

真菌多糖具有調(diào)節(jié)免疫力的作用，已有多種真菌多糖類(lèi)保健品藥品上市。但大多數(shù)真菌多糖都以子實(shí)體提取物入藥，成本高，有些珍貴物種難獲得，制約了其廣泛應(yīng)用。相關(guān)研究表明，桑黃發(fā)酵菌絲體提取物同桑黃子實(shí)體提取物的作用成分差別不大，甚至更多［14］。本實(shí)驗(yàn)的桑黃多糖通過(guò)桑黃發(fā)酵分離純化制得，實(shí)驗(yàn)表明，它能提高機(jī)體免疫。桑黃發(fā)酵菌絲體可替代現(xiàn)有的桑黃入藥成分，可降低成本，并且效果更顯著，為其擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of polysaccharides from Phellinus igniarius by liquid fermentation technology on mouse's immunity function

WEI Jing，CHEN Li，DENG Ya-jun，ZOU Xiang，XU Xing-ran*
（College of Pharmaceutical Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China）

To study the effect of polysaccharides from Phellinus igniarius by liquid fermetation technology on mouse's immunity function.It mainly studied the immune organs in mice，carbon clearance rate，and IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IFN-γ，TNF-α affected by P.igniarius polysaccharide.The results showed that it could significantly increase the weight of thymus and spleen，enhance carbon clearance rate，increase the content of IL-2 and IFN-γ，reduce the content of IL-1，IL-6 and TNF-α.It was confirmed that polysaccharides from Phellinus igniarius could significantly enhance immunity，and there was a certain anti-inflammatory effects.

liquid fermentation technology；polysaccharides from Phellinus igniarius；mice；immune；cytokines

TS201.4

A

1002-0306（2016）08-0344-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.064

2015-10-19

魏靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向：生物技術(shù)藥物篩選及其質(zhì)量控制，E-mail：weijingfenming@126.com。

*通訊作者：徐興然（1967-），男，博士，副教授，研究方向：生物技術(shù)藥物篩選及其質(zhì)量控制，E-mail：623475202@qq.com。

國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012F1003006）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31472170）。