殷海松，范栩嘉，湯衛(wèi)華，邊艷慧，陳 珊，喬長晟，*（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院生物工程學院，天津0050；.天津輕工業(yè)化學研究所有限公司，天津0050；.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津00457）

氨基酸對出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的影響

殷海松1，2，范栩嘉3，湯衛(wèi)華2，邊艷慧3，陳 珊2，喬長晟3，*
（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院生物工程學院，天津300350；2.天津輕工業(yè)化學研究所有限公司，天津300350；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

本文研究了添加氨基酸對出芽短梗霉A.pullulans CGMCC3337發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸（PMLA）的影響。通過單因素實驗和正交實驗分別對氨基酸種類及其添加量進行優(yōu)化。由單因素實驗可知：天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）和蘇氨酸（Thr）對菌體生長和PMLA合成最有利。由正交實驗可知：氨基酸的最優(yōu)組合為（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、纈氨酸（Val）0.4、蘇氨酸（Thr）0.4。在最優(yōu)組合條件下獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別達到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別提高了40.92%和45.20%。

出芽短梗霉，聚蘋果酸，氨基酸

聚蘋果酸（PMLA）是一種水溶性脂肪族聚酯類化合物［1-2］，由于主鏈上含有酯鍵而被稱為聚酯類化合物，在有水的環(huán)境中可以自發(fā)降解或者發(fā)生酶促反應而被降解。聚蘋果酸及其衍生物由于具有生物降解性、高度水溶性、生物相容性、可吸收性、可化學衍生性及無免疫原性［3］等優(yōu)良特性，可以用作藥物載體［4］及微膠囊材料、生物醫(yī)學材料等。PMLA的制備方法主要有化學合成法和生物發(fā)酵法2種?；瘜W法合成聚蘋果酸分子量較小；生物發(fā)酵法合成聚蘋果酸優(yōu)點突出，產(chǎn)物均為β型而且分子量高、產(chǎn)物純度高［5-6］。

生物合成聚蘋果酸（PMLA）的研究最早始于20世紀60年代，Shimada等［7］從環(huán)狀青霉（Penicillium cyclopium）中分離得到一種能夠抑制該菌的蛋白酶活性的高分子聚合物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該聚合物為PMLA。后來報道產(chǎn)PMLA的菌種主要有出芽短梗霉［8-9］、環(huán)狀青霉［7］和黏菌［10］等。在生物發(fā)酵制備聚蘋果酸的菌種

中，由于出芽短梗霉的形態(tài)比較穩(wěn)定，合成聚蘋果酸的能力相對較強［11-12］，因此研究比較多的是出芽短梗霉。出芽短梗霉又名“茁霉”、“芽生側茁霉”，分類屬于半知菌綱，是一種具有酵母型和菌絲形態(tài)的多形真菌［13-15］。目前國外對生物合成聚蘋果酸的研究較多，以生產(chǎn)菌種的研究為主。國內(nèi)對PMLA的研究較少，主要是一些優(yōu)良菌株的選育［16］和發(fā)酵條件的優(yōu)化［6］等，也有少量專利［17-18］是通過添加維生素和表面活性劑等來提高出芽短梗霉合成PMLA的效率。目前國內(nèi)外沒有關于氨基酸對PMLA產(chǎn)量，尤其是分子量的影響研究。目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)PMLA產(chǎn)量不高，成本巨大是困擾發(fā)酵法制備PMLA的主要問題。

本文旨在研究添加不同氨基酸對出芽短梗霉PMLA產(chǎn)量和分子量的影響，并通過單因素和正交實驗對提高PMLA產(chǎn)量和分子量的氨基酸組合進行優(yōu)化，為以后聚蘋果酸的大規(guī)模生產(chǎn)及應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337） 源于天津北洋百川生物技術有限公司；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖60，酵母膏3，丁二酸2，硫酸銨1，K2CO30.4，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.005，玉米漿0.1%（V/V），CaCO320（單獨滅菌）；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 蔗糖100，蛋白35，KH2PO40.1，NaNO32，MgSO4·7H2O 0.3，KCl 0.5，MnSO40.05，CaCO320（單獨滅菌）；氨基酸類：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及組氨酸（His） 均為分析純，源于美國Biotopped進口分裝；蘋果酸標準品 分析純，購于百靈威科技有限公司；葡聚糖標準品 分析純，北京奧博星生物技術有限公司。

UVmini-1240紫外/可見分光光度計 日本島津公；SKY-2102搖床 上海蘇坤實業(yè)有限公司；YJ-875S醫(yī)用超凈臺 蘇州凈化設備廠；SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LD5-10高速離心機 北京醫(yī)用離心廠；Agilent1100高效液相色譜分析儀 美國Agilent；Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）、凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm）

百靈威科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面培養(yǎng) 將保存于4℃的斜面菌種取出用接種針轉接到新鮮的斜面上，并置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4～5 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng) 取出培養(yǎng)好的新鮮斜面菌種，在無菌操作條件下，用10 mL無菌生理鹽水將培養(yǎng)基表面的孢子洗下，置于預先加好玻璃珠的無菌三角瓶內(nèi)搖勻，制成孢子懸液。將該孢子懸液按照10%（V/V）的接種量，即取5 mL接種到裝有45 mL種子培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫搖床上，轉速200 r/min培養(yǎng)40 h。

1.2.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液于無菌條件下混合均勻，按照10%（V/V）的接種量，將種子液接種到裝有45 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基并滅好菌的500 mL擋板瓶中，用八層紗布封好瓶口，置于25℃恒溫搖床，在200 r/min的轉速下培養(yǎng)6 d。

1.2.2 氨基酸添加量對PMLA產(chǎn)量的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、蛋氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）、絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）及組氨酸（His）。添加量分別為0.1～0.6 g/L，按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法培養(yǎng)，設置兩組空白對照，每組實驗做三個平行，每組數(shù)據(jù)重復三次，下同。

1.2.3 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337菌體量的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵實驗，檢測添加氨基酸發(fā)酵后A.pullulans CGMCC3337菌體量，設置兩組空白對照實驗，每組氨基酸分別做三個平行。

1.2.4 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337合成PMLA產(chǎn)量的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵實驗，檢測添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的產(chǎn)量，設置兩組空白對照實驗，每組氨基酸分別做三個平行。

1.2.5 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影響 向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中分別按1.2.2確定的最佳添加量添加各氨基酸，按搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法進行發(fā)酵實驗，檢測添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的分子量，設置兩組空白對照，每組實驗做三個平行。

1.2.6 正交實驗設計 根據(jù)單因素實驗結果，采用L18（37）正交表，選擇Asp（A）、Leu（B）、Val（C）及Thr （D）為優(yōu)選因素，以PMLA產(chǎn)量和分子量為考核指標，進行正交實驗，因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗設計各因素及水平Table1 Levels of factors used in the orthogonal experimental design

1.2.7 檢測方法

1.2.7.1 菌體量測定 取10 mL發(fā)酵液于50 mL離心管中，5000 r/min離心15 min。倒掉上清，在菌體沉淀中滴加3 mol/L的稀鹽酸溶液，中和發(fā)酵液中剩余的碳酸鈣，直到不再有氣泡產(chǎn)生為止，5000 r/min離心15 min，倒掉上清。用10 mL生理鹽水重懸菌體，

5000 r/min離心15 min，倒掉上清，將離心管置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌體干重（g/L）。

1.2.7.2 發(fā)酵液中PMLA的測定 取10 mL發(fā)酵液于15000 r/min離心10 min除去菌體，用移液管取5 mL上清液，加入等體積的1 mol/L H2SO4溶液，于90℃條件下水解12 h，將聚蘋果酸完全水解為單體蘋果酸。高效液相色譜法（HPLC）檢測水解前后的蘋果酸的含量，結合蘋果酸的標準曲線可得出樣品中蘋果酸的含量，兩者之差即為聚蘋果酸的產(chǎn)量［19］。

其中HPLC的檢測條件如下：色譜柱：Prevail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm）；柱溫：25℃；流動相：25 mmol/L KH2PO4溶液/乙睛=95/5（V/V）（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL；紫外檢測波長：210 nm。

蘋果酸標曲的制作：選取濃度在1～10 g/L的蘋果酸標準品，采用同樣的條件進行HPLC檢測，然后以蘋果酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行標準曲線的繪制。

1.2.7.3 發(fā)酵液中PMLA分子量的測定 取10 mL發(fā)酵液于15000 r/min離心10 min除去菌體，取5 mL上清液用流動相0.05 mol/L Na2SO4溶液稀釋20倍，GPC檢測PMLA分子量。

GPC測定發(fā)酵液中PMLA的分子量，采用凝膠滲透色譜法進行分子量的測定，首先使用分子量能夠覆蓋聚蘋果酸分子量的葡聚糖標準品進行標準曲線的繪制，再結合使用高效液相色譜儀和凝膠色譜柱測定發(fā)酵液中PMLA的分子量。最后根據(jù)標準曲線換算即可得出PMLA的分子量。其中GPC檢測PMLA分子量條件如下：色譜柱：凝膠色譜柱（8.0 mm×300 mm）；柱溫：25℃；參比池溫度：30℃；流動相：0.05 mol/L Na2SO4溶液，pH自然；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗共設3個平行，正交實驗部分采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，圖表生成采用Origin 7.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與討論

2.1 氨基酸添加量對PMLA產(chǎn)量的影響

按照1.2.2的實驗方法進行實驗，檢測基礎培養(yǎng)基中添加氨基酸發(fā)酵后聚蘋果酸的產(chǎn)量，結果如表2所示。由表2可知，隨著氨基酸添加量的增加，PMLA的產(chǎn)量先增加后減小。這是由于氨基酸能夠促進聚蘋果酸的合成，參與其合成途徑，當氨基酸量達到一定時，會起到抑制作用和反饋調(diào)節(jié)作用，導致聚蘋果酸的合成量降低。表3為由表2數(shù)據(jù)得到的各種氨基酸的最佳添加量。

2.2 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337菌體量的影響

按照1.2.3的實驗方法進行實驗，檢測添加氨基酸發(fā)酵后A.pullulans CGMCC3337菌體量的變化情況，實驗結果見圖1。

由圖1可知，菌體量均勻分布在30～35 g/L之間，其中谷氨酸（Glu）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、丙氨酸（Ala）和精氨酸（Arg）和空白對照相比分別增加了2.95%、3.55%、1.18%、3.55%、2.96%、1.16%、2.96%、1.48%、4.14%、3.25%、3.54%。實驗結果表明，在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氨基酸對出芽短梗霉（A.pullulans CGMCC3337）菌體量影響不明顯，因此要繼續(xù)考察基礎發(fā)酵培養(yǎng)

基中添加氨基酸對PMLA產(chǎn)量及分子量的影響。

表2 氨基酸以及添加量對PMLA產(chǎn)量的影響Table2 Effect of the types and adding amount of the amino acids on PMLA production

表3 氨基酸添加量Table3 The table of amino acid content

圖1 不同氨基酸對菌體量的影響Fig.1 Effect of different amino acid on biomass

2.3 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337合成PMLA產(chǎn)量的影響

按照1.2.4的實驗方法進行實驗，檢測添加氨基酸發(fā)酵后PMLA的產(chǎn)量，實驗結果見圖2。

圖2 不同氨基酸對PMLA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different amino acid on PMLA

由圖2可知，培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和甘氨酸（Gly），與空白對照組41.21 g/L的產(chǎn)量相比分別提高了17.69%、12.42%、14.68%、14.54%、16.98%、 14.78%、12.86%、11.91%和12.86%。天冬氨酸對產(chǎn)物的合成影響最明顯，可能是因為天冬氨酸通過轉氨作用形成草酰乙酸，草酰乙酸再還原為蘋果酸最終合成PMLA。培養(yǎng)基中添加賴氨酸（Lys）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）時，對PMLA合成幾乎沒有影響。而添加異亮氨酸（Ile）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）及苯丙氨酸（Phe）對PMLA合成有抑制作用。

2.4 氨基酸對A.pullulans CGMCC3337合成PMLA分子量的影響

圖3 不同氨基酸對聚蘋果酸分子量的影響Fig.3 Effect of different amino acid on molecular weight

表4 正交實驗表及結果Table4 Orthogonal analysis test

按照1.2.5的實驗方法進行實驗，檢測添加氨基

酸發(fā)酵后PMLA的分子量，實驗結果見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)基中分別添加天冬氨酸（Asp）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、色氨酸（Trp）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）和亮氨酸（Leu），與空白對照組PMLA分子量6221.5 u相比分別提高了16.29%、16.19%、11.23%、16.67%、18.45%、13.85%、18.76%、19.00%、14.14%和19.58%。亮氨酸對PMLA分子量影響最明顯，可能是因為亮氨酸對蘋果酸聚合過程中某種酶有刺激作用。培養(yǎng)基中添加谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、精氨酸（Arg）及甘氨酸（Gly）對PMLA分子量的影響比較微弱，而添加絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）及丙氨酸（Ala）時，則出現(xiàn)了PMLA分子量較小的現(xiàn)象。由于分子量是評價作為藥物載體性能的重要指標，能夠用作藥物載體的聚合物分子量范圍是1.5～200 ku，在該范圍內(nèi)，適當提高聚蘋果酸分子量，可以提高其載藥量。因此，需要合成聚蘋果酸分子量不能過小。

2.5 正交實驗優(yōu)化氨基酸添加量

正交實驗結果見表4，聚蘋果酸產(chǎn)量及分子量方差分析結果分別見表5和表6。

表5 聚蘋果酸產(chǎn)量方差分析表Table5 The anova table of yield of PMLA

表6 聚蘋果酸分子量方差分析表Table6 The anova table of molecular weight of PMLA

由表4～表6可以看出，氨基酸對PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量的影響大小順序分別為A＞B＞D＞C和A＞D＞B＞C，其中A因素對PMLA產(chǎn)量和分子量均有顯著影響，B因素對PMLA產(chǎn)量有一定影響，D因素對PMLA分子量有一定影響。以PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量為參考指標，確定添加氨基酸最優(yōu)組合分別為A1B1C3D1和A1B1C2D1。由于C因素對PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量的影響均最小，從節(jié)約成本考慮選擇C因素最小添加量，因此確定添加氨基酸最優(yōu)組合為A1B1C1D1，即：天冬氨酸（Asp）0.4 g/L、亮氨酸（Leu）0.4 g/L、纈氨酸（Val）0.4 g/L、蘇氨酸（Thr）0.4 g/L，在此培養(yǎng)基條件下PMLA產(chǎn)量為58.42 g/L，PMLA分子量為8932 u。

2.6 驗證實驗

按最優(yōu)組合方案中的氨基酸添加條件進行驗證實驗，重復實驗3次，得到PMLA產(chǎn)量為57.89 g/L，PMLA分子量為8879 u，與預測值中PMLA產(chǎn)量58.42 g/L及PMLA分子量8932 u非常接近，產(chǎn)量和分子量與預測值分別相差0.9%和0.6%，較未添加氨基酸發(fā)酵所得PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量分別提高了40.92%和45.20%。

3 結論

通過單因素實驗，確定天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及蘇氨酸對菌體生長及PMLA合成最有利。通過正交實驗優(yōu)化得到的添加氨基酸最優(yōu)組合為（g/L）：天冬氨酸（Asp）0.4、亮氨酸（Leu）0.4、纈氨酸（Val）0.4、蘇氨酸（Thr）0.4。在最優(yōu)組合條件下獲得的PMLA產(chǎn)量和分子量分別達到了57.89 g/L和8879 u，比未添加氨基酸發(fā)酵所得PMLA產(chǎn)量和PMLA分子量分別提高了40.92%和45.20%。

本論文首次就氨基酸對聚蘋果酸產(chǎn)量、尤其對PMLA分子量的影響進行研究。添加氨基酸提高聚蘋果酸產(chǎn)量，有利于促進PMLA進一步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，為進一步解決困擾發(fā)酵制備PMLA產(chǎn)量不高、成本大的主要問題有著重要意義。提高PMLA的分子量，為其能更好的應用于醫(yī)藥載體方面起到了推動性作用。本論文在搖瓶發(fā)酵研究的基礎上，會進一步進行發(fā)酵罐的擴大實驗，并對氨基酸對聚蘋果酸合成以及分子量影響的機理進行更深層次的研究。

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Effects of amino acids on poly malic acid fermentation by Aureobasidium pullulans

YIN Hai-song1，2，F(xiàn)AN Xu-jia3，TANG Wei-hua2，BIAN Yan-hui3，CHEN Shan2，QIAO Chang-sheng3，*
（1.School of Bioengineering，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350，China；2.Tianjin Light Industrial Chemical Rresearch Institute of Co.，Ltd.，Tianjin 300350，China；3.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The effects of added amino acids on poly malic acid（PMLA）fermentation by A.pullulans CGMCC3337 were studied，the types and adding amount of the amino acids were optimized by single factor experiment and orthogonal experiments.Single factor experiment showed that aspartic acid（Asp），leucine（Leu），valine（Val）and threonine（Thr）were favorable for the synthesis of PMLA and cell growth.Orthogonal experiment showed that the optimal combination of amino acids added（g/L）：Asp 0.4，Leu 0.4，Val 0.4，Thr 0.4.Under the optimizing condition，the production and molecular weight of PMLA achieved 57.89 g/L and 8879 u，respectively.Compared with the previous，the production and molecular weight of PMLA were increased by 40.92%and 45.20%，respectively.

Aureobasidium pullulans；poly malic acid；amino acid

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0242-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.042

2015－10－26

殷海松（1980-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：yinhaisong1980@163.com。

*通訊作者：喬長晟（1969-），男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。

天津市科技支撐計劃重點項目（14ZCZDTG00025）。