羅 娟，馬海樂(lè)，劉雪姣（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

羅 娟，馬海樂(lè)*，劉雪姣
（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇省食品物理加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

為提高枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕的效率，對(duì)發(fā)酵所用種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究種子培養(yǎng)基氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)及溫度對(duì)生物量的影響，確定種子培養(yǎng)基組成為1%酵母膏、1%玉米黃粉、1%KH2PO4，培養(yǎng)溫度36℃，其生物量、中性和堿性蛋白酶酶活較常規(guī)蛋白胨培養(yǎng)基分別提高210.10%、459.20%和67.50%。在此基礎(chǔ)上運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源量、接種量及溫度進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為20%豆粕、2%玉米黃粉、1% KH2PO4、接種量10%，培養(yǎng)溫度36℃，其生物量、可溶性蛋白及多肽含量較僅含22%豆粕的培養(yǎng)基分別提高40.90%、28.60% 和36.40%。結(jié)果表明采用優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基能夠顯著提高枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕的效率。

枯草芽孢桿菌，液態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)基優(yōu)化，豆粕

豆粕是大豆提取油脂后得到的副產(chǎn)品，我國(guó)豆粕年產(chǎn)量5000萬(wàn)噸以上，位于美國(guó)、巴西、阿根廷之后，居世界第四位。豆粕中粗蛋白含量為30%～50%，是植物性蛋白質(zhì)飼料的主要來(lái)源，占畜禽蛋白質(zhì)總用量的60%以上。雖然豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，但含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子［1］，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收、代謝產(chǎn)生不良影響。此外，大豆蛋白分子由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜［2-3］、分子量較大［4］，存在消化率和生物學(xué)效價(jià)低的問(wèn)題［5-7］，造成豆粕中優(yōu)質(zhì)蛋白資源利用困難［8-9］。

枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis，BS）是一種嗜熱好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀菌，具有很強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力，是工業(yè)生產(chǎn)堿性及中性蛋白酶的主要菌種。采用枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵來(lái)降解大分

子蛋白等物質(zhì)，不但能夠提高產(chǎn)品的生物利用度及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還可降解胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而實(shí)現(xiàn)豆粕高值化利用［10-12］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究豆粕發(fā)酵時(shí)往往只注重優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，而忽視種子液培養(yǎng)基，并且多采用如蛋白含量、多肽含量、蛋白酶活等中的單一指標(biāo)衡量發(fā)酵效果，無(wú)法全面展示優(yōu)化效果的好壞［13-19］。

本研究以發(fā)酵產(chǎn)物中菌種生物量、蛋白酶活性、可溶性蛋白及多肽含量等為指標(biāo)，對(duì)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行雙重優(yōu)化，多指標(biāo)確定枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件，以提高豆粕液態(tài)發(fā)酵效率，并為工業(yè)化發(fā)酵豆粕提供一定理論依據(jù)及技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌10160 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏；豆粕（粉碎過(guò)60目篩） 中儲(chǔ)糧鎮(zhèn)江糧油有限公司提供；玉米黃粉 山東天成生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母膏、大豆蛋白胨、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸銅、碳酸鈉、福林酚等 均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)。

IS-RDD3搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-25酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；JZ5002電子天平 上海天平儀器廠；YM30Z滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LD5-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 國(guó)華儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌的保存采用固體斜面LB培養(yǎng)基［20］，枯草芽孢桿菌生物量平板計(jì)數(shù)采用TSA培養(yǎng)基［21］（胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基）。

1.2.2 生物量的測(cè)定 按照GB/T 13093-2006進(jìn)行測(cè)定［22-23］。無(wú)菌操作下取1 mL發(fā)酵液，用無(wú)菌水稀釋為10-5、10-6、10-7濃度進(jìn)行TSA培養(yǎng)基涂布，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，每個(gè)濃度做3次平行。

1.2.3 蛋白酶活性的測(cè)定 按照GB/T 23527-2009進(jìn)行測(cè)定［24］。取發(fā)酵上清液稀釋10倍，取1 mL稀釋液加入2 mL濃度為10.0 g/L酪蛋白溶液，混勻靜置10 min，加2 mL三氯乙酸，靜置10 min后5000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入5 mL濃度為42.4 g/L的碳酸鈉溶液，1 mL福林酚試劑，混勻后靜置20 min，在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。

1.2.4 可溶性蛋白含量測(cè)定 采用福林酚法［25-26］測(cè)定。取發(fā)酵上清液稀釋10倍，取1 mL加入試劑A ［a：10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500 mL蒸餾水中；b：0.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100 mL蒸餾水中；每次使用前，現(xiàn)將50體積a與1體積b混合，即為試劑A］，混勻后靜置10 min，加入0.5 mL福林酚試劑，立刻混勻靜置30 min，在680 nm處測(cè)吸光值。

1.2.5 多肽含量測(cè)定 采用雙縮脲法［27］測(cè)定。用15%三氯乙酸等體積沉淀發(fā)酵液，5000 r/min離心5 min，取上清液稀釋5倍，取1 mL稀釋液，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻靜置30 min后540 nm處測(cè)定吸光值。

1.2.6 枯草芽孢桿菌的活化 取枯草芽孢桿菌10160保藏菌種，挑取一環(huán)接入固體斜面LB培養(yǎng)基36℃活化，1 d后將活化好的菌種接入液體LB培養(yǎng)基中，在160 r/min、36℃進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。待培養(yǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，吸取一定體積的菌液接入待篩選種子液培養(yǎng)基中。

1.2.7 種子液培養(yǎng)基的篩選 采用單因素逐步優(yōu)化的方式，按表1所示，取適量活化后的枯草芽孢桿菌于不同氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽（以上物質(zhì)濃度均為1%）及培養(yǎng)溫度下，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h后平板計(jì)數(shù)及蛋白酶活性測(cè)定，篩選種子液培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

1.2.8 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 按表2進(jìn)行單因素逐步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在36℃、200 r/min轉(zhuǎn)速的搖床中培養(yǎng)4 d后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并測(cè)定可溶性蛋白及多肽含量。

1.2.9 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素所篩選的對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕有明顯影響的碳源量（玉米黃粉）、接種

量及培養(yǎng)溫度進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，其他條件為20%豆粕、1%KH2PO4、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。以可溶性蛋白、多肽含量及生物量為指標(biāo)，確定枯草芽孢桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，各因素和水平的選擇見(jiàn)表3。

表1 種子培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Different factors and levels of seed culture optimization

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表Table2 Different factors and levels of fermentation culture optimization

表3 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)Table3 Factors and levels of orthogonal test Design

1.2.10 優(yōu)化與對(duì)照實(shí)驗(yàn) 優(yōu)化出來(lái)的種子液最優(yōu)單因素組合與培養(yǎng)細(xì)菌常用的LB培養(yǎng)基作指標(biāo)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)得到的最優(yōu)組合與僅含22%豆粕培養(yǎng)基做各指標(biāo)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 種子培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 氮源的選擇 從圖1可以看出，枯草芽孢桿菌能較好地利用有機(jī)氮產(chǎn)生中性及堿性蛋白酶，而在無(wú)機(jī)氮中基本不能生存。由于無(wú)機(jī)氮源被快速代謝，酶的合成會(huì)受到抑制，因此只能產(chǎn)生少量的蛋白酶［28］。酵母膏作為氮源時(shí)，生物量及產(chǎn)生的堿性蛋白酶酶活最高，分別達(dá)到1.96×109cfu/mL及60.5 U/mL；中性蛋白酶酶活也較高為63.3 U/mL，故選擇1%酵母膏作為種子培養(yǎng)基氮源。

圖1 種子培養(yǎng)基氮源的選擇Fig.1 The selection of the nitrogen source of the seed culture

2.1.2 碳源的選擇 從圖2可以看出，枯草芽孢桿菌對(duì)有機(jī)碳的利用率較無(wú)機(jī)碳高，此時(shí)生物量和蛋白酶酶活都能達(dá)到理想效果。當(dāng)使用玉米黃粉作為碳源時(shí)，生物量達(dá)到最高2.06×109cfu/mL，中性及堿性蛋白酶酶活分別達(dá)到86.8及54.9 U/mL。故選擇1%玉米黃粉作為種子培養(yǎng)基碳源。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽的選擇 從圖3可以看出，無(wú)機(jī)鹽對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)、中性及堿性蛋白酶的分泌有較大影響。其中K+、PO能促進(jìn)蛋白酶酶活的提高，當(dāng)使用磷酸二氫鉀作為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，生物量能達(dá)到最大1.45×109cfu/mL；Na+及Mg2+無(wú)明顯促進(jìn)效果；而Fe3+對(duì)酶活有抑制作用，且不利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)。故選擇1%KH2PO4作為種子培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽。

圖2 種子液培養(yǎng)基碳源的選擇Fig.2 The selection of carbon source for the seed culture

圖3 種子培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的選擇Fig.3 The selection of inorganic salt for the seed culture

2.1.4 溫度的選擇 從圖4可以看出，枯草芽孢桿菌生物量和中性蛋白酶酶活隨著溫度的升高先上升后下降，堿性蛋白酶活性略微上升。中性蛋白酶活性在32℃達(dá)到最高值331.2 U/mL；生物量在36℃達(dá)到最大值1.98×109cfu/mL?？紤]到種子液用于發(fā)酵接種，在保持高蛋白酶活性的情況下，為保證生物量達(dá)到一定數(shù)量，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇36℃培養(yǎng)。

圖4 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度的選擇Fig.4 The selection of temperature for the seed culture

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

篩選出枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件后，進(jìn)一步利用其對(duì)豆粕進(jìn)行發(fā)酵制備生物活性肽。為提高枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕的利用率，因此對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 氮源量的選擇 氮源為豆粕粉，其添加量能夠影響到培養(yǎng)基的組成，進(jìn)而影響微生物的生長(zhǎng)。由圖5可以看出，隨著豆粕量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白及多肽含量增加，在20%處達(dá)到最大，且生物量也達(dá)到最大。故選擇氮源量為20%。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源量的選擇Fig.5 The selection of the nitrogen source quantity of the fermentation culture

2.2.2 碳源量的選擇 從圖6可看出，當(dāng)采用玉米黃粉為碳源時(shí)，碳源添加量能夠顯著影響發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量、可溶性蛋白及多肽含量。當(dāng)玉米黃粉添加量為2%時(shí)，生物量、可溶性蛋白及多肽含量都達(dá)到最高，分別為2.15×109cfu/mL、51.8 mg/mL及13.6 mg/mL。

圖6 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源量的選擇Fig.6 The selection of the carbon source quantity of the fermentation culture

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽量的選擇 從圖7可以看出，當(dāng)KH2PO4添加量增加到1%時(shí)，培養(yǎng)基中可溶性蛋白及多肽含量達(dá)到最高；當(dāng)KH2PO4添加量增加到1.5%時(shí)，生物量達(dá)到最大，但是可溶性蛋白及多肽含量下降，可能是高鹽環(huán)境抑制蛋白酶酶活力導(dǎo)致?？紤]到發(fā)酵是為了獲得蛋白及多肽，故選擇KH2PO4添加量為1%。

2.2.4 溫度的選擇 從圖8可看出，隨著培養(yǎng)溫度升高，培養(yǎng)基中可溶性蛋白含量先升后降，在36℃達(dá)到最高值82.2 mg/mL；但生物量呈下降趨勢(shì)，在28℃時(shí)最大為6.64×109cfu/mL；36℃時(shí)為2.87×109cfu/mL，多肽含量變化不明顯。36℃時(shí)生物量雖然有所下降，但和28℃處于同樣數(shù)量級(jí)，為了保證蛋白及多肽產(chǎn)量，選擇36℃進(jìn)行發(fā)酵。

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽量的選擇Fig.7 The selection of inorganic salt quantity for fermentation culture

圖8 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度的選擇Fig.8 The selection of temperature for the fermentation culture

2.2.5 接種量的選擇 接種量是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一，接種量過(guò)低則底物轉(zhuǎn)化率低，接種量過(guò)高又會(huì)影響微生物生長(zhǎng)及代謝。從圖9可看出，接種量為10%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白及多肽含量最高，分別為81.5、16.6 mg/mL，說(shuō)明接種量為10%時(shí)枯草芽孢桿菌發(fā)酵活力最大。

圖9 枯草芽孢桿菌接種量的選擇Fig.9 The selection of inoculation quantity of Bacillus subtilis

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)以確定枯草芽孢桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可以看出，影響枯草芽孢桿菌生物量的各因素順序是：B＞C＞A；影響可溶性蛋白含量的各因素順序是：C＞B＞A；影響多肽含量的各因素順序是：C＞B＞A。

以可溶性蛋白、多肽含量、生物量為指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)培養(yǎng)基組合分別為：C2B2A3、C2B2A2、B3C1A1。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都不包括最優(yōu)組合，故做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表5。多肽是最重要發(fā)酵產(chǎn)物，表5中在最佳組合C2B2A2條件下發(fā)酵，多肽含量達(dá)23.6 mg/mL，另兩項(xiàng)指標(biāo)可溶性蛋白含量為83.0 mg/mL，生物量為8.30×109cfu/mL，生物量?jī)?yōu)于實(shí)驗(yàn)最優(yōu)處理組，可溶性蛋白略低于最優(yōu)處理組。故可以選擇C2B2A2為最優(yōu)發(fā)酵組合，即20%豆粕、2%玉米黃粉、1%KH2PO4、接種量10%及培養(yǎng)溫度36℃。

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)直觀分析圖Table4 The visual analysis chart of orthogonal test of fermentation culture

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基驗(yàn)證結(jié)果Table5 Verification results for the fermentation culture

2.4 優(yōu)化對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表6可以看出，優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基較常規(guī)蛋白胨培養(yǎng)基的生物量、中性和堿性蛋白酶活性分別提高210.10%、459.20%和67.50%。從表7可以看出，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和僅含22%豆粕培養(yǎng)基（因?yàn)閮?yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基含有22%的干物質(zhì)）相比其生物量、可溶性蛋白及多肽含量分別提高40.90%、28.60%和36.40%。由此可見(jiàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著提高發(fā)酵效率。

表6 種子液培養(yǎng)基優(yōu)化對(duì)照Table6 The comparison of the optimation and control experiment for the seed culture

表7 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化對(duì)照Table7 The comparison of the optimation and control experiment for the fermentation culture

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)豆粕發(fā)酵種子培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果為：1%酵母膏、1%玉米黃粉、1%KH2PO4，培養(yǎng)溫度為36℃，與LB培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基中生物量、中性及堿性蛋白酶酶活分別提高210.10%、459.20%及67.50%。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，綜合考慮生物量、可溶性蛋白及多肽含量三種指標(biāo)，豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果為：20%豆粕，2%玉米黃粉，1%KH2PO4，10%接種量，培養(yǎng)溫度36℃。與僅含22%豆粕的發(fā)酵培養(yǎng)基相比，該最優(yōu)使得發(fā)酵產(chǎn)物中的生物量、可溶性蛋白含量及多肽含量分別提高40.90%、28.60%及36.40%。優(yōu)化后的培養(yǎng)基能顯著提高枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆粕的效率。

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Study on the optimization of the seed and fermentation culture for fermenting soybean meal by Bacillus subtilis

LUO Juan，MA Hai-le*，LIU Xue-jiao
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products，Zhenjiang 212013，China）

In order to improve the efficiency of soybean meal fermentation in liquid state by Bacillus subtilis，the seed and fermentation culture were optimized.Through the single factor experiments to study the seed culture nitrogen sources，carbon sources，inorganic salts and temperature influence on biomass，it was concluded that the best seed culture was composed of 1%yeast extract，1%corn powder，1%KH2PO4and 36℃fermentation temperature.The biomass，neutral and alkaline protease activity was enhanced 210.10%，459.20%and 67.50% compared to conventional peptone medium.Then on this basis，by using orthogonal experiment to optimize the fermentation culture of carbon source quantity，inoculation size and temperature，the optimal fermentation conditions were 20%soybean meal，2%maize powder，1%KH2PO4，10%inoculation size and 36℃culture temperature.The biomass，soluble protein and peptide content was 40.90%，28.60%and 36.40%higher respectively，compared to the culture medium containing 22%soybean meal.The results showed that the optimized seed culture and fermentation culture could significantly improve the efficiency of the soybean meal liquid state fermentation by Bacillus subtilis.

Bacillus subtilis；liquid state fermentation；culture medium optimization；soybean meal

TS201.3

A

1002-0306（2016）08-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.039

2015-08-19

羅娟（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：469846196@qq.com。

*通訊作者：馬海樂(lè)（1963-），男，教授，研究方向：功能食品與食品物理加工，E-mail：mhl@ujs.edu.cn。

國(guó)家863計(jì)劃課題（2013AA102203）。