鄭生宏，繆葉旻子，嚴(yán) 芳，邵靜娜，何衛(wèi)中（浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水323000）

復(fù)合酶輔助浸提綠茶多酚工藝條件優(yōu)化

鄭生宏，繆葉旻子，嚴(yán) 芳，邵靜娜，何衛(wèi)中*
（浙江省麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水323000）

采用纖維素酶+果膠酶的復(fù)合酶法在較適溫度下輔助浸提綠茶多酚，以茶多酚浸提率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶添加量、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間等四個(gè)浸提條件因素，確定了最佳浸提工藝條件為：纖維素酶和果膠酶分別添加0.3%，料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間45 min；在此條件下茶多酚浸提率可達(dá)21.36%，明顯高于傳統(tǒng)水提法的茶多酚浸提率17.41%。

復(fù)合酶解，茶多酚，浸提，條件優(yōu)化

茶多酚（TP）是茶葉中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，約占茶鮮葉干重的18%～36%，對(duì)機(jī)體的活性氧自由基和脂類自由基具有較強(qiáng)的清除能力，其還具有防癌抗癌、殺菌抑菌、抗過(guò)敏、抗輻射等作用［1］，已被列為食品添加劑，在食品加工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、日用化工等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用［2-4］。近年來(lái)提取茶多酚的主要方法包括溶劑提取法、離子沉淀法、柱層析法、超臨界萃取法、色譜法、超聲波法、微波法、酶法等［5］。這些方法主要都是通過(guò)有機(jī)溶劑（通常為乙醇）或者水在一定的條件下將茶多酚從細(xì)胞內(nèi)浸提至溶劑中，然后采用物理或化學(xué)方法將其從浸提液中分離出來(lái)，因而茶多酚的提取可以歸納為浸提工序和分離工序兩個(gè)步驟。上述的茶多酚提取方法中，包括離子沉淀法、柱層析法以及色譜法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在分離工序，而溶劑浸提法、超臨界萃取法、超聲波法、微波法和酶法的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在浸提工序，這其中超臨界萃取法因設(shè)備成本高且浸提率較低而很少使用［6］，而超聲波法、微波法和酶法可以看成是溶劑萃取法的輔助改進(jìn)方法，能夠大大改善溶劑浸提法存在的周期長(zhǎng)、浸提率較低等不足，成為目前研究的熱點(diǎn)之一［7-11］。而相較于超聲波法和微波法，酶法輔助浸提具有反應(yīng)條件溫和，有效成分浸提率高等優(yōu)點(diǎn)，又由于酶法提取是在非有機(jī)溶劑中進(jìn)行，使得提取產(chǎn)物純度、穩(wěn)定性、活性都較高，無(wú)污染，解決了有機(jī)溶劑提取法中，有機(jī)溶劑殘留及回收困難且乙醇用量大等缺點(diǎn)；此外，酶法提取在縮短浸提時(shí)間、降低能耗、降低提取成本等方面也具有一定的優(yōu)勢(shì)。目前采用酶法提取，尤其是復(fù)合酶法提取茶多酚較少見諸報(bào)道［12-13］。基于此，本研究選用纖維素酶+果膠酶的復(fù)合酶輔助浸提綠茶中茶多酚，利用該復(fù)合酶在較適溫度下分解構(gòu)成細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的纖維素和果膠，從而提高茶多酚的溶解率和提取率。研究通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶浸提茶多酚工藝條件參數(shù)，以期最大限度提高茶多酚浸提率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

麗水香茶 麗水市碧云天茶葉有限公司；纖維素酶（酶活10萬(wàn)U/g）、果膠酶（酶活5萬(wàn)U/g） 均購(gòu)于江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、檸檬酸、福林酚、碳酸鈉等 均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JFSD-100粉碎機(jī) 上海嘉定糧油儀器公司；HH-6電熱恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司；PB-10酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；722N型可見分光光度計(jì) 優(yōu)尼科儀器有限公司；AB104-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多酚的提取 分別稱取3 g茶葉粉碎樣（精確至0.0001 g），加入若干純水和復(fù)合酶，攪拌均勻，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，復(fù)合酶選定為1∶1的纖維素酶：果膠酶。在酸度計(jì)下用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)pH 至5.0（折中選?。?，然后在一定的溫度和時(shí)間下水浴浸提，過(guò)濾，取濾液備用。

麗水香茶→粉碎樣→過(guò)篩（40目）→酶解輔助浸提→抽濾→濾液→含量測(cè)定

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酶添加量單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取同一批次茶葉粉碎樣3 g于5個(gè)三角瓶中，料液比1∶20 g/mL，在酶解溫度50℃，浸提時(shí)間40 min的條件下，考察不同酶添加量對(duì)麗水香茶茶多酚浸提率的影響。酶添加量分別設(shè)置為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（分別表示纖維素酶和果膠酶總添加量）共五個(gè)梯度。

1.2.2.2 料液比單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%復(fù)合酶，在酶解溫度50℃，浸提時(shí)間40 min的條件下，考察不同料液比對(duì)茶多酚浸提率的影響。實(shí)驗(yàn)中，分別設(shè)置料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL共五個(gè)不同配比。

1.2.2.3 浸提溫度單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在酶添加量0.4%，料液比1∶40 g/mL的條件下，考察不同浸提溫度對(duì)茶多酚浸提率的影響，其中溫度設(shè)置為30、40、50、60、70℃共5個(gè)梯度進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4 浸提時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 精確稱取3 g茶葉粉碎樣5份置于三角燒瓶中，分別按重量比0.4%加入纖維素酶和果膠酶，在料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃的條件下，考察不同浸提時(shí)間對(duì)茶多酚浸提率的影響。浸提時(shí)間設(shè)置為30、45、60、75、90 min共5個(gè)水平。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)和尋求最佳參數(shù)組合，選擇復(fù)合酶添加量、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間共4個(gè)因素，各因素設(shè)置3個(gè)水平，按照L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

1.2.4 茶多酚含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［14］。

1.2.4.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 移取0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，加入2 mL Folin-酚試劑，反應(yīng)3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，定容至100 mL，靜置1 h，于765 nm測(cè)定吸光度。

表1 酶法浸提茶多酚正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test for TP extraction with composite-enzymolysis

1.2.4.2 茶多酚浸提率的計(jì)算 準(zhǔn)確量取樣品溶液

1 mL，加入2 mL Folin-酚試劑，反應(yīng)3 min，加4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，搖勻定容至100 mL，靜止1h，

765 nm下測(cè)定其吸光度，并按下式計(jì)算茶多酚含量。

式中：A：樣品液吸光度；V：提取液體積，mL；d：稀釋因子；SLOPEstd：沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；m：樣品干物質(zhì)含量，%；m1：樣品質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

茶多酚提取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、圖表處理在Excel 2003中進(jìn)行，正交實(shí)驗(yàn)采用DPS軟件設(shè)計(jì)分析。每次實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為：y=0.1711x+0.0004，R2=0.9993，表明沒食子酸在0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1 酶法浸提條件單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶添加量對(duì)茶多酚浸提率的影響 由圖2可知，酶添加量在0.2%～0.4%之間時(shí)，茶多酚浸提率隨著酶添加量的增加而增加。這是由于纖維素酶和果膠酶可破壞茶葉的細(xì)胞壁與細(xì)胞間質(zhì)，促使茶多酚等胞內(nèi)物質(zhì)快速擴(kuò)散溶出，提高茶多酚等有效成分的浸提率。在達(dá)到0.4%以后，隨著酶添加量的繼續(xù)增加，茶多酚浸提率基本保持不變，說(shuō)明添加量在0.4%

時(shí)，酶解反應(yīng)完全，茶多酚已充分浸提出來(lái)，繼續(xù)增加對(duì)浸提率影響不大?；诖?，選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%作為最適酶添加用量進(jìn)行后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

圖2 酶添加量對(duì)茶多酚浸提率的影響Fig.2 Effect of enzyme contents on extraction rate of TP

2.1.2 料液比對(duì)茶多酚浸提率的影響 由圖3可知，隨著料液比在1∶20～1∶60 g/mL范圍內(nèi)不斷增加，茶多酚浸提率呈現(xiàn)出先增加后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)料液比在1∶20～1∶40 g/mL之間時(shí)，隨著料液比的增加，茶多酚浸提率也相應(yīng)增加；在達(dá)到1∶40 g/mL后，隨著料液比的繼續(xù)增加，茶多酚浸提率呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢(shì)。這可能是由于隨著料液比的增加，體系中酶的濃度相應(yīng)在不斷減小，致使酶活相對(duì)降低，從而導(dǎo)致復(fù)合酶水解纖維素和果膠質(zhì)能力有所減弱，最終使得茶多酚浸提率不斷下降。因而，采取料液比1∶40 g/mL浸提效果較好。

圖3 料液比對(duì)茶多酚浸提率的影響Fig.3 Effect of solid-to-liquid rate on extraction rate of TP

2.1.3 浸提溫度對(duì)茶多酚浸提率的影響 從圖4可以看出，在所選的實(shí)驗(yàn)溫度30～50℃范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的不斷提高，茶多酚浸提率也在不斷提高，且在50℃達(dá)到最大值，因而該溫度是整個(gè)酶體系最適作用溫度。50℃以后，隨著溫度繼續(xù)增加，茶多酚浸提率不斷下降。該結(jié)果說(shuō)明在未達(dá)到最適作用溫度之前，升高溫度能促進(jìn)酶解作用，使酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用加強(qiáng)，進(jìn)一步促使有效成分向細(xì)胞外擴(kuò)散，升溫還能提供酶解反應(yīng)所需能量，因而茶多酚浸提率在該溫度段不斷提高。之后，繼續(xù)提高溫度，致使具有蛋白質(zhì)屬性的部分乃至全部酶超過(guò)其最適作用溫度而逐漸失活，從而酶促反應(yīng)受到抑制。綜上，在溫度為50℃時(shí)，酶的活性能夠得到充分發(fā)揮，茶多酚浸提率達(dá)到最大，因此，選取50℃為最適浸提溫度。

圖4 浸提溫度對(duì)茶多酚浸提率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of TP

2.1.4 浸提時(shí)間對(duì)茶多酚浸提率的影響 由圖5可知，在所選時(shí)間段內(nèi)，茶多酚浸提率隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出先增加后下降而后基本保持不變的變化趨勢(shì)，在45 min中范圍內(nèi)，茶多酚浸提率呈直線上升，說(shuō)明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活力充分得到發(fā)揮，酶解反應(yīng)進(jìn)行得較完全；45 min后，茶多酚浸提率有一定程度的下降，其原因可能是由于體系中已溶出的部分茶多酚發(fā)生了氧化聚合反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)，導(dǎo)致茶多酚含量減少；同時(shí)一些復(fù)合酶解產(chǎn)物，如花色素、單寧等本身就是纖維素酶的天然抑制劑，在溶液中濃度的累積也會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)造成抑制。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并非浸提時(shí)間越長(zhǎng)越好，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到45 min時(shí)，茶多酚浸提率達(dá)到最大，因此，45 min為最佳酶解時(shí)間。

圖5 浸提時(shí)間對(duì)茶多酚浸提率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of TP

2.2 酶法浸提茶多酚正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由極差結(jié)果分析可知，料液比對(duì)茶多酚浸提率影響最大，其后依次為浸提時(shí)間、酶添加量和浸提溫度，最優(yōu)參數(shù)組合為A3B2C2D2，即在酶添加量0.6%、浸提溫度50℃、料液比1∶40 g/mL、浸提45 min條件下，茶多酚浸提率最高。在此條件下對(duì)酶解法浸提茶多酚進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)以傳統(tǒng)水提法［15］為對(duì)照，3次平行，結(jié)果表明（表3）在最佳參數(shù)組合下，茶多酚浸提率達(dá)21.36%，均高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明此工藝具有一定的合理性。同時(shí)，與對(duì)照的傳統(tǒng)水提法相比，酶法茶多酚浸提率高出22.7%，且其條件溫和高效，操作簡(jiǎn)單，因此復(fù)合酶解提取茶多酚是一種安全可靠的提取方法，具有很好的應(yīng)用前景。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal test by enzymolysis-assisted extraction

3 結(jié)論

選用纖維素酶和果膠酶的復(fù)合酶系對(duì)麗水香茶這一大宗綠茶進(jìn)行茶多酚浸提實(shí)驗(yàn)，通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶法輔助浸提茶多酚條件參數(shù)，得到的最佳浸提條件為：復(fù)合酶添加量0.6%，料液比1∶40 g/mL，浸提溫度50℃，浸提時(shí)間45 min；在此條件下，茶多酚浸提率可達(dá)21.36%，明顯高于傳統(tǒng)水浸提法的茶多酚浸提率17.41%，且與傳統(tǒng)水提法相比，本復(fù)合酶解法還具有如下兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)，一是復(fù)合酶解法具有高效溫和、節(jié)能環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，完全可以克服傳統(tǒng)水提法因在相對(duì)高溫長(zhǎng)時(shí)條件下2次浸提茶葉中的茶多酚，致使浸提不充分、茶多酚尤其是兒茶素易氧化生成茶色素，與體系中咖啡堿、蛋白質(zhì)生成茶乳酪，影響茶多酚的生物活性等不足。二是酶解法能促進(jìn)茶葉內(nèi)不利及無(wú)效成分的有益轉(zhuǎn)化，改善茶湯的色、香、味、形及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等綜合品質(zhì)，因而使得該法不僅局限于茶多酚的提取，而且可以作為改善風(fēng)味和品質(zhì)的方法之一應(yīng)用于茶飲料生產(chǎn)，其應(yīng)用前景可觀。

表3 復(fù)合酶浸提法與傳統(tǒng)水提法比較Table3 Comparison on extraction rate of TP between enzymolysis and boiling water

［1］宛曉春.茶葉生物化學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，319-330.

［2］陳鐿文.茶多酚粗品的精制及兒茶素單體分離的工藝研究［D］.西安：西北大學(xué)，2005.

［3］J D Lambert，C S Yang.Cancer chemopreventive activity and bioavailability of tea polyphenols［J］.Mutation Research，2003，523（1）：201-208.

［4］劉軍海，李志洲.茶葉中有效成分應(yīng)用及其浸提工藝研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（3）：173-177.

［5］徐芳芳，朱蓓德，姜國(guó)偉，等.茶多酚浸提方法與藥理作用研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28（7）：1033-1035.

［6］付勇，李萬(wàn)林，張哲，等.茶多酚浸提方法的研究進(jìn)展［J］.飲料工業(yè)，2013，16（5）：15-17.

［7］宋傳奎，肖斌，王艷麗，等.超聲波輔助浸提茶多酚工藝條件的優(yōu)化［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，39 （5）：133-139，146.

［8］郭樹琴，吳勝舉，牛春玲，等.超聲浸提綠茶茶多酚研究［J］.陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（7）：36-38.

［9］李剛鳳，汪輝喜，陳仕學(xué)，等.微波法浸提低檔綠茶多酚工藝研究［J］.糧食與油脂，2015，28（1）：60-62.

［10］謝藍(lán)華，肖南，張嘉怡，等.復(fù)合酶解輔助乙醇浸提茶多酚工藝研究［J］.茶葉科學(xué)，2013，33（1）：27-33.

［11］劉軍海，楊海濤，刁宇清，等.復(fù)合酶法浸提茶多酚工藝條件研究［J］.食品與機(jī)械，2008，24（3）：74-77，80.

［12］張衛(wèi)紅.復(fù)合酶解法浸提茶葉中有效成分的過(guò)程研究［D］.西安：西北大學(xué)，2005.

［13］王元鳳，魏新林，王登良，等.金花茶葉酶法浸提工藝條件研究［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20（6）：582-587.

［14］GB/T 8313-2008茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［15］龔志華，李麗，陳大海，等.綠茶無(wú)熱浸提技術(shù)研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，35（5）：558-560，579.

Optimizing of composite-enzymolysis assisted extraction process of green tea polyphenols

ZHENG Sheng-hong，MIAOYE Min-zi，YAN Fang，SHAO Jing-na，HE Wei-zhong*
（Lishui Academy of Agricultural Sciences，Lishui 323000，China）

Using cellulase and pectase as a mean of stimulus，composite-enzymolysis assisted extraction process of polyphenols from green tea was optimized in this investigation.The effects of factors as enzyme content，solid-to-liquid ratio，enzymolysis temperature，extraction time on the extraction rates of tea polyphenols were explored through single-factor and orthogonal test.The results showed that the optimal conditions were addition of 0.3%of cellulase and pectase respectively，solid-to-liquid ratio 1∶40 g/mL，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 45 min.Under such optimum conditions，extraction rate of green tea polyphenols reached up to 21.36%which was much higher than 17.41%obtained from traditional water extraction.

composite-enzymolysis；tea polyphenols；water extraction；condition optimization

TS272.2

A

1002-0306（2016）08-0211-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.035

2015－09－08

鄭生宏（1985-），男，碩士，助理研究員，研究方向：茶葉加工和茶生物化學(xué)，E-mail：zheng19851021@163.com。

*通訊作者：何衛(wèi)中（1973-），男，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：茶葉加工技術(shù)，E-mail：Jnhwz@126.com。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-23）；麗水市茶葉產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2012cxtd05）。