秦 鵬，王 龍，趙玉卉，韓融冰，路等學(xué)（甘肅省科學(xué)院，生物研究所，甘肅蘭州730000）

響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草菌絲液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素培養(yǎng)基

秦 鵬，王 龍，趙玉卉，韓融冰，路等學(xué)*
（甘肅省科學(xué)院，生物研究所，甘肅蘭州730000）

探究利用響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的條件，以提高蟲草素積累量。以蟲草素積累量為指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率，利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選影響蟲草素積累量的關(guān)鍵因素，再以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大蟲草素積累量響應(yīng)區(qū)域，最后應(yīng)用Box-Behnken方法優(yōu)化培養(yǎng)基；對(duì)蟲草素積累量和對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：在25℃，無光照，160 r/min，pH自然，5 mL/100 mL接種量，優(yōu)化培養(yǎng)基為：KNO30.04 g/100 mL，酵母浸膏1.50 g/100 mL，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/100 mL，KH2PO40.2 g/100 mL，葡萄糖3.82 g/100 mL，ZnSO4·7H2O 0.06 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.13 g/100 mL，維生素B10.08 g/100 m，蟲草素積累量達(dá)到852.621 μg/mL；在同等條件下，利用優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵8 d+靜置10 d后，蟲草素積累量達(dá)到936.225 μg/mL。在本實(shí)驗(yàn)多組分的條件下，菌絲體產(chǎn)率小于0.857 g/100 mL時(shí)，蟲草素生成的效率較高，而菌絲體產(chǎn)率大于1.703 g/100 mL時(shí)，蟲草素積累量開始下降；發(fā)酵第8 d蟲草素積累量和菌絲體產(chǎn)率存在極顯著相關(guān)關(guān)系。

響應(yīng)面，蛹蟲草，液體發(fā)酵，蟲草素，菌絲體

蟲草素（cordycepin）即3’-脫氧腺苷（3’-deoxyadenosine），屬嘌呤類生物堿，有抗腫瘤［1-2］、抑菌抗炎和提高免疫力等功效［3-4］，療效顯著，但化學(xué)合成難度大，使其國際市場上的價(jià)格很高。蟲草素主要

通過蛹蟲草培養(yǎng)物中獲得，而天然冬蟲夏草子實(shí)體不含蟲草素，其菌絲體發(fā)酵液中含極少量的蟲草素［5］。蛹蟲草菌絲體將90%以上的蟲草素分泌到培養(yǎng)基中［6］，液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素具有周期短、發(fā)酵過程易控制等優(yōu)點(diǎn)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)提高蟲草素產(chǎn)率至關(guān)重要，雷坤等用優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的研究，產(chǎn)率比優(yōu)化前提高124%［7］，蔡水淋等用響應(yīng)面法優(yōu)化液體培養(yǎng)基，蟲草素產(chǎn)率較優(yōu)化前提高108.3%［8］；研究報(bào)道遮光［9］、搖床+靜置兩段培養(yǎng)［10］能顯著提高蟲草素積累量，本研究采用遮光培養(yǎng)方式，實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)搖床+靜置培養(yǎng)方式能提高蟲草素積累量。雖然蟲草素的研究有很多進(jìn)展，但蟲草素的產(chǎn)率和生產(chǎn)成本一直都是蟲草素工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確發(fā)酵第8 d蟲草素積累量和菌絲體產(chǎn)率之間的關(guān)系，為提高蟲草素產(chǎn)率、降低生產(chǎn)成本提供新的研究思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛹蟲草菌 購自中科院微生物研究所菌種保藏中心；蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；甲醇 色譜純，德國默克公司；KNO3、酵母浸膏、ZnSO4· 7H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、葡萄糖、維生素B1市售分析純；水 市售純凈水。

SPJ-150生化培養(yǎng)箱 上海君竺儀器制造有限公司；HZQ-QX臥式空氣恒溫?fù)u床 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器（2998 PDA）和在線脫氣機(jī) 美國Waters公司；0.22 μm有機(jī)相過濾器 上海密粒膜分離技術(shù)有限公司；ELGA MK2超純水器 北京格瑞恩科技發(fā)展有限公司；微波爐 美的集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng)基、平皿培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂。種子培養(yǎng)基：市售純凈水。初始培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g/100 mL，酵母浸膏1 g/100 mL，市售純凈水。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：市售純凈水。培養(yǎng)基初始pH均為自然，121℃滅菌30 min。

斜面菌種活化三次后轉(zhuǎn)接到平皿培養(yǎng)基，20℃黑暗條件下培養(yǎng)9 d，用打孔器取同一半徑上相同大?。s3 mm）的6個(gè)菌塊，分別轉(zhuǎn)接到平皿培養(yǎng)基中，置于5、10、15、20、25、30℃下黑暗培養(yǎng)9 d。

斜面菌種活化三次后轉(zhuǎn)接到裝種子培養(yǎng)基的100 mL/250 mL三角瓶中，置搖床160 r/min，25℃黑暗培養(yǎng)3 d制成種子懸液，以5 mL/100 mL接種量將種子懸液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于160 r/min、25℃黑暗條件下置搖床培養(yǎng)8 d。

1.2.2 蟲草素的提取與菌絲體產(chǎn)率的測(cè)定 微波提取方法：將發(fā)酵菌懸液用微波提?。?00 W，1 min）后于三層紗布過濾，收集濾液，用于胞內(nèi)與胞外總蟲草素的測(cè)定，該方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)后確定。

HPLC法測(cè)定蟲草素條件：Zorbax SB C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇/水（15∶85）；流速1 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長260 nm，該方法由參考文獻(xiàn)［11］并實(shí)驗(yàn)后確定；同時(shí)，將過濾得到的菌絲體置于烘箱中，于80℃下烘干至恒重，用于菌絲體產(chǎn)率的測(cè)定。

1.2.3 培養(yǎng)溫度的確定 對(duì)每個(gè)溫度下的菌落直徑測(cè)量三次，測(cè)量的夾角為60度，取均值作為溫度對(duì)菌株影響的指標(biāo)，每個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過參考相關(guān)研究［12-16］并進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，確定了Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素的水平，因素水平見表1。采用n=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響蟲草素積累量的8個(gè)因素進(jìn)行研究，同時(shí)測(cè)定對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table1 Levels of factors for Plackett-Burman design

1.2.5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)關(guān)鍵因素，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近蟲草素積累量最大值響應(yīng)區(qū)域，明確95%置信水平下的關(guān)鍵因素的設(shè)計(jì)中心點(diǎn)，關(guān)鍵因素質(zhì)量濃度依效應(yīng)值大小確定，爬坡方向?yàn)橄x草素積累量增加的方向，同時(shí)測(cè)定了對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率。其他5個(gè)因素依正效應(yīng)的取高水平質(zhì)量濃度，負(fù)效應(yīng)的取低水平質(zhì)量濃度，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表2。

表2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2 Experimental design of steepest ascent method

1.2.6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以最大蟲草素積累量為響應(yīng)目標(biāo)，3因素水平見表3，同時(shí)測(cè)定

了對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table3 Levels and factors of Box-Behnken design

1.2.7 發(fā)酵第8 d蟲草素積累量和菌絲體產(chǎn)率相關(guān)性分析 對(duì)以上實(shí)驗(yàn)得到的32對(duì)蟲草素積累量與菌絲體產(chǎn)率進(jìn)行相關(guān)性分析。將32個(gè)蟲草素積累量、菌絲體產(chǎn)率從大到小排序，探求兩者的相關(guān)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

溫度對(duì)菌株影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，繪圖軟件采用Oringin，數(shù)據(jù)處理軟件采用SPSS的LSD多重檢驗(yàn)法；Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件采用Minitab，Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件采用Design-Expert；相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)的排序、繪圖和相關(guān)性檢驗(yàn)軟件采用SPSS。

2 結(jié)果與討論

2.1 適宜培養(yǎng)溫度

圖1反映了菌株在不同溫度下的生長情況。25℃為適宜溫度，優(yōu)于其他組（p＜0.01），隨溫度增加，菌落直徑先增長達(dá)到最大值后急劇下降，30℃為菌株的致死溫度。

圖1 溫度對(duì)菌株的影響Fig.1 The effect of temperature on strain

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) 每個(gè)因素分別取高（+1）低（-1）兩個(gè)水平，根據(jù)本研究前期Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，高低水平濃度比約為1.25倍時(shí)只篩選出一個(gè)因素，故將比值增至1.5倍，結(jié)果顯示1.5倍為適宜的高低水平比，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表4。擬合模型的p= 0.029，R2為0.9723，故用該模型模擬實(shí)驗(yàn)是可靠可信的。結(jié)果顯示：對(duì)因素予以高低水平處理篩選出3個(gè)關(guān)鍵因素，依次為X7＞X2＞X6，以蟲草素積累量增加為目標(biāo)，高水平比低水平質(zhì)量濃度對(duì)蟲草素積累量影響更大的因素依次為X7＞X2＞X4＞X5＞X3，而低水平質(zhì)量濃度有較大影響的因素依次為：X6＞X8＞X1。

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化參數(shù)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中非常實(shí)用的技術(shù)［17］。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，X7、X2、X4、X5、X3分別取高水平質(zhì)量濃度，X6、X8、X1分別取低水平質(zhì)量濃度，縮小X7、X2、X6高低水平質(zhì)量濃度差后再確定適宜的步長，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，爬坡方向?yàn)橄x草素積累量的增長方向。1～5組的蟲草素積累量分別為為：552.235、566.857、626.025、835.679、685.101 μg/mL，對(duì)應(yīng)的菌絲體產(chǎn)率依次為：0.183、0.189、0.945、1.801、1.112 g/100 mL，蟲草素積累量在第4組達(dá)到極大值，故以第4組為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn) 采用N=15的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，其中12個(gè)析因點(diǎn)，其他3個(gè)中心點(diǎn)用于估計(jì)誤差，因素水平見表3，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，編碼的回歸模型如下所示。Y=835.12-7.78X7-3.03X2-11.28X6+3.62X7X2+2.32X7X6+2.67X2X6-22.05X-15.29X-23.48X

以表5誤差和實(shí)驗(yàn)值的比率作統(tǒng)計(jì)，誤差比率均在0.1%以下，證實(shí)該模型預(yù)測(cè)的可靠性。方差分析見表6。結(jié)果顯示：回歸模型R2為0.9996，說明模型可以真實(shí)反映99.96%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，矯正決定系數(shù)R2Adj為0.9989，說明在消除自由度影響的前提下，僅有0.11%的變異不能被該模型解釋。模型失擬項(xiàng)p=0.9307大于0.05，說明在三個(gè)中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，蟲草素積累量的均值和X7、X2、X6存在線性關(guān)系，可將誤差平方和、失擬平方和合并為殘差平方和以便檢驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著性。模型p值小于0.01，接受回歸系數(shù)不全為零的備擇假設(shè)，回歸模型擬合較好。因此，在本實(shí)驗(yàn)條件下，該模型是可信的，可以很好的預(yù)測(cè)和分析蟲草素積累量的變化。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table4 Design and results of analysis of Plackett-Burman design

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table5 Results of Box-Behnken design

表6 響應(yīng)面回歸分析Table6 Analysis of variance for response surface design

圖2～圖4是固定回歸模型中X2、X6、X7其中一個(gè)因素值后，Y（蟲草素積累量）關(guān)于另外兩個(gè)因素的回歸模型而繪制的3D曲面圖。在X7、X2、X6的取值區(qū)間內(nèi)，蟲草素積累量存在極大值點(diǎn)，固定值分別為3.88、1.52、0.03 g/100 mL。從圖上的等高線圖可以看出，最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)已經(jīng)比較接近最大響應(yīng)值區(qū)域，曲面的陡峭程度反映了因素間交互作用的大小，圖2曲面較其他陡峭，X2、X7交互作用明顯于其他。

圖2 Y=f（X2，X7）的響應(yīng)面Fig.2 Response surface plot of Y=f（X2，X7）

圖3 Y=f（X6，X7）的響應(yīng)面Fig.3 Response surface plot of Y=f（X6，X7）

2.2.4 優(yōu)化培養(yǎng)基及模型驗(yàn)證 分別對(duì)X7、X2、X6求一階偏導(dǎo)，聯(lián)立方程可求得蟲草素積累量最大時(shí)X7、X2、X6的質(zhì)量濃度：葡萄糖3.82%，酵母浸膏1.50%，七水合硫酸亞鐵0.03%，模型預(yù)測(cè)值為837.580 μg/mL，驗(yàn)證值為852.621 μg/mL，與預(yù)測(cè)值的誤差為1.79%。在25℃、無光照、160 r/min，初始培養(yǎng)基中發(fā)酵8 d作為對(duì)照組，對(duì)照組蟲草素產(chǎn)率為457.906 μg/mL，優(yōu)化

培養(yǎng)基的蟲草素積累量比對(duì)照提高86.2%。

圖4 Y=f（X6，X2）的響應(yīng)面Fig.4 Response surface plot of Y=f（X6，X2）

利用優(yōu)化培養(yǎng)基再進(jìn)行搖床培養(yǎng)8 d+靜置培養(yǎng)10 d，蟲草素產(chǎn)率達(dá)到936.225 μg/mL，比對(duì)照組和優(yōu)化培養(yǎng)基的蟲草素積累量分別提高了104.5%和9.8%。優(yōu)化培養(yǎng)基組分為：葡萄糖3.82%，酵母粉1.50%，七水合硫酸亞鐵0.03%，KH2PO40.2%，KNO30.04%，ZnSO4· 7H2O 0.06%，MgSO4·7H2O 0.13%，維生素B10.08%。

2.3 蟲草素積累量與菌絲體產(chǎn)率相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

按菌絲體產(chǎn)率升序排列后（見圖5），蟲草素積累量亦呈上升趨勢(shì)，相對(duì)于菌絲體產(chǎn)率，蟲草素積累量的增速較為緩和；菌絲體產(chǎn)率小于0.857 g/100 mL時(shí)，菌絲體促進(jìn)蟲草素的效率較高，菌絲體產(chǎn)率高于1.703 g/100mL時(shí)，蟲草素積累量開始降低。因此，在復(fù)雜組分的實(shí)驗(yàn)條件下，低菌絲體產(chǎn)率的培養(yǎng)基促進(jìn)蟲草素的效率較高。

圖5 發(fā)酵第8 d的蟲草素積累量與菌絲體產(chǎn)率變化Fig.5 Changes of cordycepin and mycelium by cordyceps militaris at 8th day

經(jīng)分析，原因可能為較多的菌絲體產(chǎn)率在發(fā)酵前期對(duì)底物消耗更多，而蟲草素的大量合成在發(fā)酵第6 d，在蟲草素大量合成期，營養(yǎng)組分已經(jīng)消耗殆盡，蟲草素的合成受到影響；此外，另一個(gè)原因可能是菌絲體產(chǎn)率越高，對(duì)液體培養(yǎng)基中水分的消耗越大，培養(yǎng)基中菌絲體胞外水份越少，菌絲體產(chǎn)生蟲草素后直接分泌到胞外，而蟲草素不再被吸收，胞外蟲草素質(zhì)量濃度達(dá)到飽和，抑制了菌絲體合成和分泌蟲草素。

經(jīng)SPSS相關(guān)性檢驗(yàn)：發(fā)酵第8 d蟲草素積累量和菌絲體產(chǎn)率在0.01顯著性水平下存在相關(guān)關(guān)系，說明在本實(shí)驗(yàn)條件下，利用菌絲體產(chǎn)率可以間接地預(yù)測(cè)蟲草素積累量的變化趨勢(shì)，有利于減少生產(chǎn)成本。

2.4 討論

蟲草素分子由一個(gè)腺嘌呤基團(tuán)和一個(gè)3’脫氧五碳糖基團(tuán)構(gòu)成，蟲草素的分子結(jié)構(gòu)、腺嘌呤核苷、脫氧腺嘌呤核苷和ATP類似，腺嘌呤核苷酸的合成代謝途徑為從頭合成和補(bǔ)救合成，從頭合成為主要的途徑，蟲草素的合成機(jī)理尚不明確，其合成途徑是否與腺嘌呤核苷酸的相似或者蟲草素只是腺嘌呤核苷酸合成的副產(chǎn)物，目前，文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)腺嘌呤、腺苷為蟲草素合成的前體物質(zhì)。此外，蟲草素對(duì)于蛹蟲草菌的意義方面的研究很少，文獻(xiàn)報(bào)道真菌激發(fā)子可以提高蟲草素產(chǎn)率［18］，是否因?yàn)槠渌婢募尤爰せ盍四承┟庖叻磻?yīng)而促進(jìn)蟲草素合成和分泌，這方面的研究將對(duì)蟲草素積累量的提高產(chǎn)生較好的意義。

對(duì)于蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素，研究報(bào)道胞外的蟲草素積累量占總量的70%以上，菌絲體含量很少［19］。而不同液體培養(yǎng)方式對(duì)蟲草素積累量的影響也很大［20-21］，靜置培養(yǎng)較搖床培養(yǎng)產(chǎn)蟲草素效率高，本實(shí)驗(yàn)較低菌絲體產(chǎn)率有利于蟲草素的積累結(jié)果亦間接支持了上述結(jié)論；對(duì)于培養(yǎng)基組分，蟲草素的合成前體［22-23］、激發(fā)子等能較大程度的促進(jìn)蟲草素的合成，NH4+離子亦能顯著地促進(jìn)蟲草素的合成［24］，硫酸亞鐵能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平，從而提高蟲草素合成，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FeSO4·7H2O低濃度對(duì)蟲草素積累量的影響較大，F(xiàn)an等的實(shí)驗(yàn)的亞鐵離子的添加量與本實(shí)驗(yàn)相近［25］，但本實(shí)驗(yàn)所用組分中的硫酸根離子質(zhì)量濃度較高，據(jù)此推測(cè)，高質(zhì)量濃度的硫酸根離子抑制了蟲草素生成。此外，國內(nèi)液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的產(chǎn)量較低，不同菌株液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的產(chǎn)量不同，但一般在1 g/L以下［26］，利用本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基生產(chǎn)得到蟲草素積累量接近1 g/L，且8種培養(yǎng)基組分價(jià)格低，而且，在本實(shí)驗(yàn)多組分培養(yǎng)基條件下，蟲草素積累量和菌絲體產(chǎn)率呈極顯著相關(guān)關(guān)系，故可用菌絲體產(chǎn)率作為間接指標(biāo)預(yù)測(cè)蟲草素積累量變化趨勢(shì)，有利于生產(chǎn)成本的控制。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的條件為：25℃，無光照，160 r/min，pH自然，液體發(fā)酵培養(yǎng)8 d；經(jīng)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出三個(gè)關(guān)鍵因素，葡萄糖、酵母浸膏和FeSO4·7H2O，前兩個(gè)組分的高質(zhì)量濃度對(duì)蟲草素積累量的影響較大，F(xiàn)eSO4·7H2O低質(zhì)量濃度影響較大；經(jīng)優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖3.82%，酵母浸膏1.50%，七水合硫酸亞鐵0.03%，KH2PO40.2%，KNO30.04%，ZnSO4·7H2O 0.06%，MgSO4·7H2O 0.13%，維生素B10.08%，經(jīng)搖床發(fā)酵8 d+靜置培養(yǎng)10 d后，蟲草素積累量達(dá)到936.225 μg/mL。在本實(shí)驗(yàn)復(fù)雜組分的條件下，菌絲體產(chǎn)率小于0.857 g/100mL時(shí)，菌絲體促進(jìn)蟲草素的效率較高，菌絲體產(chǎn)率高于1.703 g/100mL時(shí)，蟲草素積累量開始降低，因此，較低菌絲體產(chǎn)率促進(jìn)蟲草素分泌，較高菌絲體產(chǎn)率抑制蟲草素的分泌。

［1］Lin Y W，Chiang B H.Anti-tumor activity of the fermentation broth of Cordyceps militaris cultured in the medium of Radix

astragali［J］.Process Biochemistry，2008，43（3）：244-250.

［2］Chen Y，Yang S H，Hueng D Y，et al.Cordycepin induces apoptosis of C6 glioma cells through the adenosine 2A receptorp53-caspase-7-PARP pathway［J］.Chemico-Biological Interactions，2014，216（5）：17-25.

［3］Lee J H，Hong S M，Yun J Y，et al.Anti-cancer effects of cordycepin on oral squamous cell carcinoma proliferation and apoptosisinvitro［J］.Journal of Cancer Therapy，2011，（2）：224-234.

［4］Ren Z H，Cui J H，Huo Z R，et al.Cordycepin suppresses TNF-α-induced NF-κB activation by reducing p65 transcriptional activity，inhibiting IκBα phosphorylation，and blocking IKKγ ubiquitination［J］.International Immunopharmacology，2012，14 （4）：698-703.

［5］DONG Caihong，YAO Yijian.Comparison of some metabolites among cultured mycelium of medicinal fungus Ophiocordyceps sinensis（Ascomycetes）from different geographical regions［J］.International Journal of Medicinal Mushrooms，2010，12（3）：287-297.

［6］Masuda M，Urabe E，Sakurai A，et al.Production of cordycepin by surface culture using the medicinal mushroom Cordyceps militaris ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，39（4）：641-646.

［7］雷坤，柯軼，毛寧.蛹蟲草Fjnu-01高產(chǎn)蟲草素的液體培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.藥物生物技術(shù)，2011，18（6）：504-508.

［8］蔡水淋，鄭永標(biāo)，王明茲，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)菌絲及蟲草素的發(fā)酵工藝［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013，（6）：13-18，21.

［9］溫魯.提高蛹蟲草培養(yǎng)物中蟲草素含量的研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（6）：118-120.

［10］Shih I L，Tsai K L，Hsieh C.Effects of culture conditions on the myceliuml growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，33（3）：193-201.

［11］鐘思敏，杜梅，陳往濱，等.蛹蟲草菌絲產(chǎn)蟲草素液體培養(yǎng)條件的研究［J］.菌物學(xué)報(bào)，2011，30（2）：229-234.

［12］岳翠翠，沈健增，蔡宇杰，等.蛹蟲草Cordyceps militaris JN168產(chǎn)蟲草素液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（2）：135-141.

［13］湯佳鵬，柳依婷.蛹蟲草靜置發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（20）：225-229，245.

［14］阮元，馬進(jìn)川，薛元，等.維生素B_1、B_6和生長激素2，4-D對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵蟲草素產(chǎn)量的影響［J］.菌物學(xué)報(bào)，2014，33 （2）：477-482.

［15］Das S K，Masuda M，Hatashita M，et al.A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquid culture of Cordyceps military is using high-energy ion beam irradiation［J］.Letters in Applied Microbiology，2008，47（6）：534-538.

［16］Das S K，Masuda M，Hatashita M，et al.Optimization of culture medium for cordycepin production using Cordyceps militaris mutant obtained by ion beam irradiation［J］.Process Biochemistry，2010，（45）：129-132.

［17］Joyce A P，Leung S S.Use of response surface methods and path of steepest ascent to optimize ligand-binding assay sensitivity ［J］.Journal of Immunological Methods，2013，392（1-2）：23-23.

［18］步嵐，朱振元，梁宗琦，等.真菌激發(fā)子對(duì)提高蛹蟲草蟲草菌素的作用［J］.菌物系統(tǒng)，2002，21（2）：252-256.

［19］王蕾，羅巍，胡瑕，等.蟲草素高產(chǎn)菌株的篩選及不同添加物對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響研究［J］.菌物學(xué)報(bào)，2012，31（3）：382-388.

［20］Hung L T，Keawsompong S，Hanh V T，et al.Effect of temperature on cordycepin production in Cordyceps militaris［J］.Thai Journal of Agricultural Science，2009，42（4）：219-225.

［21］Shih I L，Tsai K L，Hsieh C Y.Effects of culture conditions on the myceliuml growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris［J］.Biochemical Engineering Journal，2007（33）：193-201.

［22］康超，文庭池，康冀川，等.不同培養(yǎng)條件和前體對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響［J］.菌物學(xué)報(bào)，2012，31（3）：389-397.

［23］文庭池，康冀川，雷幫星，等.前體及營養(yǎng)物提高蛹蟲草蟲草菌素產(chǎn)量的研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（5）：175-179.

［24］MAO Xianbing，ZHONG Jianjiang.Significant effect of NH4+on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris［J］.Enzyme and Microbial Technology，2006，38（3-4）：343-350.

［25］FAN Dandan，WANG Wei，ZHONG Jianjiang.Enhancement of cordycepin production in submerged cultures of Cordyceps militaris by addition of ferrous sulfate［J］.Biochemical Engineering Journal，2012，60：30-35.

［26］劉艷芳，唐慶九，顧俊杰，等.北冬蟲夏草深層發(fā)酵高產(chǎn)蟲草素工藝的優(yōu)化［J］.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（3）：26-30.

Liquid fermentation media for promoting cordycepin production by Cordyceps militaris mycelium using response surface methodology

QIN Peng，WANG Long，ZHAO Yu-hui，HAN Rong-bing，LU Deng-xue*
（Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China）

Liquid fermentation media was optimized for promoting the yield of cordycepin by cordyceps militaris mycelium using response surface methodology and the corresponding yield of mycelium were measured.Firstly，factors playing important roles in the cordycepin production were selected based on Plackett-Burman design.Then the path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the cordycepin production.Finally，the optimal levels of those main factors were further optimized by using Box-Behnken design.All above experiments were repeated to analize the correlation between cordycepin and mycelium production.Fermentation conditions were temperature 25℃，dark，rotation speed 160 r/min，natural pH，inoculating amount 5 mL/100 mL.Optimal media was KNO30.04 g/100 mL，yeast extract 1.50 g/100 mL，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/100 mL，KH2PO40.2 g/100 mL，Glucose 3.82 g/100 mL，ZnSO4·7H2O 0.06 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.13 g/100 mL，Vitamin B10.08 g/100 mL.Cordycepin production reached 852.621 μg/mL.Then，using the optimal media on the same conditions，cordycepin production was optimized with 8 days'shaking-flask and 10 days'static culture and reached 936.225 μg/mL.The results of relationship between the yield of cordycepin and mycelium showed that when the yield of mycelium was less than 0.857 g/100 mL，it was more efficient that mycelium produced cordycepin.When the yield of mycelium was more than 1.708 g/100mL，the yield of cordycepin started descending.Production of cordycepin and mycelium at 8th day had significant correlations.

response surface method；cordyceps militaris；liquid fermentation；cordycepin；mycelium

TS201.3

A

1002-0306（2016）08-0185-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.030

2015－07－24

秦鵬（1984-），男，碩士，助理研究員，研究方向：食（藥）用蕈菌學(xué)，E-mail：kingkerberos@163.com。

*通訊作者：路等學(xué)（1962-），男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：食用蕈菌學(xué)，E-mail：ludengxue@126.com。

甘肅省科學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014QN-07）；甘肅省科學(xué)院與中科院合作項(xiàng)目（2012HZ-02）。