蔡 爽，劉曉霞，申佩娟，黃 敏，孟慶恒，孫建華

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津 300387； 2.天津市動植物抗性重點試驗室 天津 300387）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp．）是一種內(nèi)源固著性寄生線蟲，是危害世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要病原物之一[1-2]。根結(jié)線蟲的入侵會使植物膜系統(tǒng)受損從而導(dǎo)致傷害產(chǎn)生，此時，植物細(xì)胞中的防御酶發(fā)揮作用，對線蟲脅迫產(chǎn)生生理生化響應(yīng)[3]。防御酶系統(tǒng)主要包括 SOD、POD、CAT、PAL、PPO 等，它們參與植株體內(nèi)的活性氧代謝，能夠直接殺死、抑制病原物生長發(fā)育等[4]。例如，在根結(jié)線蟲脅迫條件下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇能夠有效地啟動黃瓜植株抗氧化酶系統(tǒng)[5]，而SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，能夠響應(yīng)各種逆境因子造成的氧化脅迫[6]。POD和CAT在保護(hù)酶中主要起到酶促降解過氧化氫的作用，POD是防止膜脂過氧化的主要酶，CAT對細(xì)胞內(nèi)組分活性狀態(tài)有重要的保護(hù)作用[3]；PAL是植株體內(nèi)苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，其活性的高低決定了植株體內(nèi)多種次生酚類化合物、木質(zhì)素、植保素、類黃酮等抗菌物質(zhì)的合成效果，因而PAL在植物抗病代謝和次生代謝中均具有重要作用[7]。林文雄等[8]認(rèn)為逆境脅迫下，葉片的脂膜透性增加，相對電導(dǎo)率增加，SOD、CAT和POD等保護(hù)性酶的活性降低，使保護(hù)性物質(zhì)類胡蘿卜素含量降低，MDA含量增加，膜脂過氧化作用增強(qiáng)。李淑菊等[9]在水楊酸對黃瓜幾種酶活性及抗病性的誘導(dǎo)作用的研究中，發(fā)現(xiàn)水楊酸處理黃瓜后其體內(nèi)PPO、POD和PAL活性均有不同程度的提高。

目前生產(chǎn)實踐中常使用高濃度、高毒性的化學(xué)農(nóng)藥防治線蟲，不僅對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成危害，也不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[10-11]。利用真菌代謝產(chǎn)物對線蟲進(jìn)行生物防治越來越受重視[12]。來源于海洋的枝頂孢霉（Acremnium，BH0531）是已被證實的具有很好殺線蟲效果的海洋真菌，其代謝物具有分子質(zhì)量小、易溶于水等特點[13]。在已用其代謝產(chǎn)物進(jìn)行室內(nèi)殺松材線蟲和根結(jié)線蟲試驗的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將此代謝產(chǎn)物應(yīng)用于溫室盆栽試驗，以探究其對盆栽黃瓜的生理狀況和保護(hù)酶活性的影響，為該菌應(yīng)用到生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌種保藏號：CGMCC-5445，由天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室提供。供試線蟲：根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita），采自感染根結(jié)線蟲病的大棚。供試黃瓜品種：‘新津春四號’，購自天津市黃瓜研究所。

1.2 發(fā)酵液的制備

1.2.1 菌種活化 將保藏的菌種接入斜面培養(yǎng)基，26℃下靜置培養(yǎng)6～7 d。

1.2.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng) 取新培養(yǎng)的菌株斜面，加入無菌水洗下孢子，制備成1×106個·mL-1的孢子懸浮液，以2%接種量接入裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中。26℃下120r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d。

1.2.3 發(fā)酵液的制備 將培養(yǎng)好的菌液1000r·min-1離心去菌體，再經(jīng)孔徑為0.22 μm微孔濾膜真空抽濾，即為發(fā)酵濾液[14]。

1.3 根結(jié)線蟲2齡幼蟲（J2）的制備

采集大棚染病黃瓜根系，洗凈泥土，剪成1～2 cm的根段，加入1%（φ）的次氯酸鈉溶液，用粉碎機(jī)粉碎。分別過60、250、500目分樣篩，收集500目分樣篩節(jié)流物，即為根結(jié)線蟲的蟲卵粗提物。將40 mL蟲卵粗提物倒入100 mL離心管中，在離心管下層注入40 mL 40%的蔗糖溶液，使其分為2層，3 500 r·min-1離心5 min，水層和蔗糖溶液層中間的白色懸浮物就是蟲卵，用移液器吸出，用蒸餾水沖掉蔗糖溶液，得到純凈的蟲卵。將蟲卵放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待蟲卵孵化，采用貝爾曼漏斗法獲取二齡幼蟲，配制成1 000條·mL-1備用。

1.4 方法

1.4.1 試驗設(shè)計及黃瓜幼苗處理 黃瓜種子經(jīng)55℃熱水浸泡10 min后，在30℃溫水中浸泡6 h，再用吸水紙和錫箔包好，置于30℃環(huán)境中催芽24 h。待其發(fā)芽后，點種到育苗穴中，于30℃光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待其長出第二片真葉后，移栽到花盆中，共計30盆，每盆1株，分為A組（試驗組）、B組（對照組），每組15株；所用土壤配比為V大田土∶V泥炭土∶V沙子=4∶4∶1，121 ℃濕熱滅菌 1 h。待黃瓜長出 3 片真葉時（20 d），A組接種根結(jié)線蟲，接種方法：根周圍打5個孔（12.5 mm×20 mm），注入線蟲懸浮液，接種量為每盆2 000條；B組15盆注入等量清水作為對照。同時，A、B組每盆分別加入 40 mL的BH0531菌株發(fā)酵濾液，以干物質(zhì)含量計算，濃度梯度設(shè)置為：0（對照）、5、10、20、40 mg·mL-1，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)50 d后用于采樣測定。

1.4.2 黃瓜幼苗丙二醛含量的測定 接種根結(jié)線蟲30 d后，稱取剪碎的葉片1 g，加入2 mL 10%（ω）TCA和少量石英砂，研磨至勻漿，再加8mLTCA進(jìn)一步研磨，勻漿在4000r·min-1離心10min，上清液為樣品提取液。吸取離心的上清液2 mL（對照加2 mL蒸餾水），加入2 mL為0.6%（ω）TBA溶液，混勻物于沸水浴中反應(yīng)15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定450、532、600 nm波長下的吸光值[15]。

1.4.3 黃瓜幼苗脯氨酸含量的測定 接種根結(jié)線蟲30 d后，稱取0.2 g黃瓜葉片，放入研缽，加入5 mL 3%（ω）磺基水楊酸溶液研磨成勻漿，把勻漿全部轉(zhuǎn)移到離心管中，沸水浴浸提10 min，冷卻后以 3 000 r·min-1離心 10 min，吸取上清液 2 mL，加 2 mL冰乙酸和3 mL顯色液，于沸水浴中加熱40 min，取出離心冷卻后各管加入5 mL甲苯，充分震蕩，以萃取紅色物質(zhì)。靜置待分層后吸取甲苯層以空白對照在波長520 nm下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出測定液中脯氨酸含量[15]。

1.4.4 黃瓜幼苗抗氧化保護(hù)酶活力的測定 接種根結(jié)線蟲30 d后，稱取0.5 g葉片放入研缽中，加2 mL 0.05 mol·L-1、pH=7.8 的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨，勻漿倒入10 mL離心管中，再加3 mL磷酸緩沖液沖洗研缽，4℃冷凍離心20 min（若做可溶性蛋白，轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1，若不做，則10 000 r·min-1），上清液（酶液）倒入試管中，置于 0～4℃下保存待用[16]。過氧化物酶（POD）的活性參照朱廣廉[17]的方法測定，多酚氧化酶（PPO）的活性參照李靖等[18]的方法測定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性參照薛應(yīng)龍[19]的方法測定，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用 NBT法[20]，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測定[21]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0選擇Duncan多重極差法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Origen 8.0軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響

發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響如表1所示。接種根結(jié)線蟲對黃瓜葉片丙二醛含量有增加效應(yīng)，對照中A組比B組增加17.33%;丙二醛含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)，膜質(zhì)受害越嚴(yán)重丙二醛含量越高，而發(fā)酵濾液對丙二醛含量有抑制作用，尤其在受根結(jié)線蟲危害時，效果更為明顯，10、20 mg·mL-1發(fā)酵濾液降低丙二醛含量分別達(dá)到23.53%、22.99%。發(fā)酵濾液可有效緩解根結(jié)線蟲對黃瓜的毒害作用。

表1 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片丙二醛含量的影響 （μmol·g-1）

2.2 發(fā)酵濾液對黃瓜葉片脯氨酸含量的影響

經(jīng)不同發(fā)酵液處理后，黃瓜葉片脯氨酸含量變化如表2所示。在根結(jié)線蟲脅迫條件下脯氨酸的含量顯著增加22.93%；發(fā)酵濾液對脯氨酸含量有明顯抑制作用，未接線蟲而加入不同濃度發(fā)酵液的黃瓜植株脯氨酸含量分別比對照降低了28.93%、31.58%、16.96%、49.14%，接線蟲組脯氨酸含量分別比對照降低了23.91%、10.93%、30.59%、、21.74%、40.15%，可能是發(fā)酵濾液的加入改善植物生長的環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長。施用發(fā)酵液的黃瓜植株脯氨酸含量都顯著降低，A組、B組變化趨勢一致。

2.3 保護(hù)酶活力的變化

表2 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片脯氨酸含量的影響ω/（μg·g-1）

2.3.1 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片SOD比活力的影響 SOD是植物體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，可以清除植物體內(nèi)因受害而產(chǎn)生的氧自由基，因此植物受害時酶活力升高，危害緩解時酶活力降低或沒有變化[22]。試驗結(jié)果顯示，染病黃瓜SOD的比活力（以蛋白質(zhì)計）（50.34 IU·mg-1）比對照（41.74 IU·mg-1）增加20.61%，酶活力增強(qiáng)可清除自由基，進(jìn)而減輕植物損傷。接線蟲組施用10 mg·mL-1發(fā)酵濾液對SOD比活力有顯著的增強(qiáng)作用，說明在特定濃度下發(fā)酵濾液能夠緩解根結(jié)線蟲對黃瓜植株的侵害。發(fā)酵濾液對接線蟲組SOD活性的影響趨勢表現(xiàn)為先增強(qiáng)后減弱，說明濃度是防治線蟲的關(guān)鍵因素，要選擇合適的濃度才能有效防治線蟲。未受線蟲感染組SOD活性隨施用濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，表示發(fā)酵濾液有利于提高黃瓜植株抗性，對植物有保護(hù)作用（圖1a）。

2.3.2 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片POD比活力的影響 黃瓜植株受到根結(jié)線蟲危害時POD比活力降低，POD活性降低能夠增加H2O2積累，H2O2能夠殺死侵入植物細(xì)胞的根結(jié)線蟲，增強(qiáng)植物對根結(jié)線蟲的抗性（圖1b）。未受線蟲侵染組，發(fā)酵濾液顯著降低了植株 POD 比活力（對照：427.52 IU·mg-1），分別降低38.79%、41.41%、48.26%、31.98%，說明發(fā)酵濾液對POD活性有抑制作用。

圖1 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片SOD（a）和POD（b）比活力的影響

2.3.3 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片CAT比活力的影響 CAT參與活性氧的代謝過程，可清除體內(nèi)過氧化氫，使細(xì)胞免受H2O2的毒害。如圖2所示，根結(jié)線蟲對CAT比活力有抑制作用（比清水對照降低了49.28%），和POD一樣，CAT比活力的降低使得植物體內(nèi)保持較高的活性氧水平，從而對線蟲產(chǎn)生毒害作用，殺死入侵線蟲。接線蟲組發(fā)酵濾液對CAT比活力有顯著的增加作用，分別比對照增加42.75%、19.05%、89.97%、73.01%，同樣是發(fā)酵濾液使CAT活性升到較高水平甚至是正常水平。未受線蟲感染組的CAT比活力在加入5、10、40 mg·mL-1發(fā)酵液時都顯示被抑制，在加入20 mg·mL-1發(fā)酵液時CAT比活力（18.36IU·mg-1）高于對照（16.93IU·mg-1）8.32%，發(fā)酵濾液對植株CAT活性作用比較復(fù)雜，合適的濃度才有利于加強(qiáng)植物的防御系統(tǒng)。

圖2 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片CAT比活力的影響

2.3.4 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片PAL比活力的影響 PAL是植物苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，當(dāng)細(xì)胞受侵時能促進(jìn)抗菌物質(zhì)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)屏障物質(zhì)合成，減輕植物病害。如圖3a所示，根結(jié)線蟲對PAL比活力有降低的作用（降低了27.96%）；施用發(fā)酵濾液能夠顯著提高 PAL 比活力（對照：0.72 IU·mg-1），有利于增強(qiáng)黃瓜植株對根結(jié)線蟲的抗性，隨著發(fā)酵濾液濃度的增加，增強(qiáng)效應(yīng)逐漸減弱（試驗組：0.92、0.92、0.88、0.84 IU·mg-1）；未受線蟲感染組施用發(fā)酵濾液對PAL比活力有顯著的降低效應(yīng)（對照：0.99 IU·mg-1），且隨著濃度的增加效果越顯著（試驗組：0.88、0.83、0.79、0.89 IU·mg-1）。

圖3 不同濃度發(fā)酵濾液對黃瓜葉片PAL（a）及PPO（b）比活力的影響

2.3.5 發(fā)酵濾液對黃瓜幼苗葉片PPO比活力的影響 PPO是酚類物質(zhì)氧化的主要酶，其活性與植物抗病性密切相關(guān)，活性高說明抗性越高。未受根結(jié)線蟲感染組發(fā)酵濾液對黃瓜葉片PPO比活力有顯著的抑制作用，比對照（2.29 IU·mg-1）分別降低了18.95%、46.81%、55.44%、29.04%，作用效果隨著施用濃度的增加愈加明顯。黃瓜受根結(jié)線蟲侵害時，發(fā)酵濾液顯著增強(qiáng)了黃瓜葉片PPO比活力，比對照（0.88 IU·mg-1）分別增加 84.09%、65.09%、92.54%、68.19%，清水對照組植物受害相當(dāng)嚴(yán)重，施用發(fā)酵濾液明顯緩解了根結(jié)線蟲對植物的侵害，提高了植株對根結(jié)線蟲的抗性（圖3b），這與SOD、POD、CAT和PAL表現(xiàn)趨勢類似。

3 討論

丙二醛（MDA）是膜質(zhì)被氧化的產(chǎn)物，MDA含量可以作為細(xì)胞膜受害程度和植物抗病評價標(biāo)準(zhǔn)[23]。試驗結(jié)果顯示不同濃度發(fā)酵濾液均可降低MDA含量，對根結(jié)線蟲的危害起到緩解作用。脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗逆過程中可以維持原生質(zhì)體與環(huán)境的滲透平衡[24]，可以作為植物抗逆性的生理指標(biāo)。健康植株游離脯氨酸含量較低，植株受到脅迫后脯氨酸活力升高，以提高細(xì)胞滲透勢。發(fā)酵濾液能夠降低脯氨酸含量，可能是在一定程度內(nèi)改善了植物生長的環(huán)境。

SOD、POD和CAT都與植物體內(nèi)O2-的代謝有關(guān)，它們相互協(xié)調(diào)作用以維持植物體內(nèi)O2-的正常水平，避免因過多氧自由基的存在而使植物受害。黃瓜受根結(jié)線蟲浸染，POD、CAT比活力均下降，植物體內(nèi)的超氧陰離子不斷積累，對線蟲產(chǎn)生毒害作用，減輕線蟲對植物的損害。施用發(fā)酵濾液后，對根結(jié)線蟲產(chǎn)生毒害作用，減輕了線蟲對植株的侵染，致使POD比活力增強(qiáng)，可能是其在土壤中殺死根結(jié)線蟲，減輕其對黃瓜植株的侵染，降低了H2O2含量，起到保護(hù)植物的目的。SOD和CAT活性增強(qiáng)，且隨著施用發(fā)酵濾液濃度的增加，防御酶的比活力呈上升的趨勢，說明發(fā)酵濾液可提高植物的抗性，對植物起到了保護(hù)的作用。根結(jié)線蟲侵染黃瓜植株，PAL比活力下降，施用發(fā)酵濾液能夠提高PAL比活力，對根結(jié)線蟲表現(xiàn)出顯著的抑制作用。同樣，PPO活力與PAL活力表現(xiàn)出一致性，都是通過提高防御酶的活力來提高植株對根結(jié)線蟲的抗性。BH0531發(fā)酵濾液通過提高保護(hù)酶的活性來防治根結(jié)線蟲對植株的侵害，至于該菌是通過何種機(jī)制來影響保護(hù)酶活力進(jìn)而實現(xiàn)殺線蟲作用的，還有待深入研究。