蔣志國(guó)，李 斌，*，王燕華，張海德（.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228；2.海南大學(xué)信息學(xué)院，海南?？?70228）

菠蘿蜜果皮多酚超聲微波協(xié)同提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

蔣志國(guó)1，李 斌1，*，王燕華2，*，張海德1
（1.海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228；2.海南大學(xué)信息學(xué)院，海南海口570228）

采用超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)（UMAE）對(duì)菠蘿蜜果皮中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波功率和微波時(shí)間4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，建立多酚得率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，分析各因素的顯著性和交互作用，得到多酚提取工藝的最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40、微波功率75 W、微波時(shí)間12 min，多酚得率為7.19 mg/g。在該條件下，超聲-微波協(xié)同提取方法提取效率優(yōu)于傳統(tǒng)水浴回流法（1.04 mg/g）、微波輔助法（5.23 mg/g）和超聲輔助法（5.89 mg/g）?？寡趸钚匝芯勘砻?，菠蘿蜜果皮多酚提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力，呈量效關(guān)系，其EC50值分別為101.39 μg/mL和106.60 μg/mL，表明多酚是菠蘿蜜果皮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

菠蘿蜜果皮，多酚，超聲-微波協(xié)同萃取，響應(yīng)面法，抗氧化

表1 超聲波-微波協(xié)同提取波菠蘿蜜多酚物質(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)Table1 Univariate experimrnts of UMAE for extracting polyphenols from jackfruit peel

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.）屬于?？颇静ぬ}屬，是世界著名的熱帶水果之一，大量種植于東南亞、印度大陸、中國(guó)南部、中非和拉丁美洲［1］，國(guó)內(nèi)以海南種植最多、最集中。

菠蘿蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香濃郁，營(yíng)養(yǎng)成分十分豐富，因此常被加工成果干、果汁、果酒等多種產(chǎn)品遠(yuǎn)銷各地。然而，研究者對(duì)占果實(shí)總重約42%的菠蘿蜜下腳料果皮的研究卻甚少，主要集中在果膠的提取和利用上［2-3］，但對(duì)果皮中其他活性成分的研究鮮有報(bào)道，特別是多酚類化合物。由于近年來發(fā)現(xiàn)多酚類化合物能夠延緩衰老、抑制人類腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展［4］、降血糖和降血脂［5］、抗病毒和抗氧化等作用［6］，因而激發(fā)了人們研究和開發(fā)利用多酚類化合物的極大興趣。

目前，對(duì)多酚化合物的提取常采用水浴振蕩法［7］、超聲波輔助法和微波輔助法。超聲-微波協(xié)同萃取法是固體萃取中超聲波法及微波法發(fā)展而來的新技術(shù)。此法充分利用超聲波振動(dòng)的空化作用及微波的高能作用，克服了常規(guī)超聲波和微波的萃取不足，即超聲波產(chǎn)生的振蕩和攪拌作用能有效彌補(bǔ)微波傳熱、傳質(zhì)不均等缺陷，而微波極佳的熱效應(yīng)能有效地彌補(bǔ)超聲波產(chǎn)熱不足的問題，實(shí)現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)［8-10］。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者采用超聲-微波協(xié)同萃取各種原料中的功能因子，與傳統(tǒng)提取方法相比，均發(fā)現(xiàn)萃取時(shí)間更短、得率更高、效率更好［11-12］。

目前，關(guān)于超聲-微波協(xié)同萃取法提取菠蘿蜜果皮多酚還未見報(bào)道。因此，本文以菠蘿蜜果皮為原料，利用響應(yīng)曲面法對(duì)菠蘿蜜果皮中多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)抗氧化活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為實(shí)現(xiàn)菠蘿蜜的綜合利用，提高產(chǎn)品附加值，充分發(fā)揮海南省菠蘿蜜的資源優(yōu)勢(shì)，并為尋找開發(fā)菠蘿蜜的新途徑提供一定的理論基礎(chǔ)，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 購(gòu)于?？谑腥f(wàn)福新村農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；2，2-二苯基-1-苦基肼（DPPH自由基） Sigma公司；2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS自由基） Sigma公司；沒食子酸 Sigma公司；過硫酸鉀 國(guó)藥集團(tuán)；福林酚試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

CW-2000微波超聲協(xié)同萃取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司；FW177中草藥粉碎機(jī) 成都一科儀器設(shè)備有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理 新鮮的菠蘿蜜果肉和果皮分離后，取菠蘿蜜果皮清洗干凈，并于60℃烘干、粉碎、過40目篩備用。

1.2.2 總酚含量測(cè)定 以沒食子酸（GA）為對(duì)照品，參考Fang等采用的Folin-酚法［13］對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取物及純化物中的總酚含量進(jìn)行測(cè)定，以GA當(dāng)量表示樣品的總酚含量。GA標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0729X+0.0008，R2=0.9985，其中X為GA質(zhì)量濃度（μg/mL），Y為吸光度值。

稱取1.0 g菠蘿蜜果皮粉末，超聲-微波協(xié)同萃取得多酚提取液，經(jīng)抽濾后用蒸餾水定容至100 mL，即為樣品溶液。取1.5 mL樣品溶液于25 mL比色管中，分別加入1 mL福林-酚試劑和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的Na2CO3溶液，然后加入蒸餾水定容至25 mL，室溫避光靜置40 min，在760 nm處測(cè)定吸光值。將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和式（1）計(jì)算樣品中多酚得率。

式中，Y為多酚得率（mg/g）；C為沒食子酸含量（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 超聲-微波協(xié)同萃取菠蘿蜜果皮多酚單因素實(shí)驗(yàn) 稱取1.0 g菠蘿蜜果皮粉末，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)（表1），研究各因素對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，安排4因素3水平實(shí)驗(yàn)，確定超聲-微波協(xié)同萃取菠蘿蜜果皮多酚的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)因子及水平如表2。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table2 Factors and levels table of Box-Benhnken experimental design

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定 參照Y Liu等［14］的方法，略有改動(dòng)。取3 mL樣品溶液、0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液1 mL加入具塞試管中，混合振蕩搖勻，室溫避光放置30 min，以無(wú)水乙醇為空白在517 nm測(cè)定其吸光度Ai；取樣品液3 mL、無(wú)水乙醇1 mL同上方法測(cè)吸光度Aj；取無(wú)水乙醇3 mL、DPPH液1 mL同上方法測(cè)吸光度A0。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)均平行3次。樣品液對(duì)DPPH的清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.2.5.2 ABTS自由基清除率測(cè)定 采用Gan CY等［15］的方法，略有改動(dòng)。7.0 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液1∶1（v∶v）混合后，避光反應(yīng)16 h，用95%乙醇稀釋使其在734 nm處吸光值為0.700±0.005（95%乙醇為對(duì)照），作為工作液備用。取樣品液0.4 mL、ABTS工作液1.6 mL于具塞試管，混合振蕩搖勻，在黑暗中靜置6 min，以95%乙醇為空白在734 nm處測(cè)定吸光度Ai；取樣品液0.4 mL、95%乙醇1.6 mL吸光度Aj；取95%乙醇0.4 mL、ABTS液1.6 mL吸光度A0。以BHT為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)均平行3次。樣品液對(duì)ABTS的清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/A0］×100。

1.2.6 超聲-微波協(xié)同萃取高效作用分析 為了評(píng)價(jià)提取效率，本文將超聲-微波協(xié)同萃取與單獨(dú)超聲波輔助、單獨(dú)微波輔助和傳統(tǒng)水浴回流提取法［7］進(jìn)行比較，具體對(duì)比參數(shù)設(shè)置如表3所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響

圖1 料液比對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on polyphenols yield of jackfruit peel

在固液提取中，一般提取的活性物質(zhì)會(huì)隨著提取溶劑的增多而增多，但當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡后，活性物質(zhì)的量不再隨著溶劑的量增加而增加，而且，提取溶劑的增加還會(huì)對(duì)后續(xù)處理造成困難，因此需要選擇合適的料液比來提取目標(biāo)物。由圖1可看出，開始時(shí)菠蘿蜜果皮中的多酚類化合物得率隨溶劑量的增大而增大，當(dāng)料液比超過1∶30后，出現(xiàn)了隨著料液比的增加多酚提取量反而減小的現(xiàn)象。因此選擇的最佳料液比為1∶30。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響Fig.2 The effect of ethanol volume on polyphenols yield of jackfruit peel

溶劑提取主要是利用被提取物與提取溶劑的相似相溶原理，當(dāng)提取溶劑的極性與菠蘿蜜果皮中多酚類化合物的極性相似時(shí)，能夠最有效的將多酚類化合物提取出來［16］。由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，多酚得率呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值。超過60%后，多酚得率開始逐漸降低，這是由于溶液極性增強(qiáng)，溶劑與多酚極性的相似程度降低，導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的溶解度下降［17-18］。所以60%為最優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3 微波功率對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響

圖3 微波功率對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響Fig.3 The effect of mcrowave power on polyphenols yield of jackfruit peel

表3 超聲-微波協(xié)同萃取與其他工藝提取效率的比較Table3 Extraction efficency comparison among different processes

由圖3可知，菠蘿蜜果皮多酚得率剛開始隨微波功率的增大而增加，這是由于微波的破壁效應(yīng)、熱效應(yīng)，超聲波的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，以及超聲波和微波的協(xié)同作用，使得菠蘿蜜果皮細(xì)胞內(nèi)的多酚可以更好地釋放、進(jìn)入溶劑并充分混合［19］。但是微波功率超過50 W，得率反而下降，可能是由于超聲-微波的熱效應(yīng)產(chǎn)生的高溫使提取物的熱不穩(wěn)定性成分發(fā)生了分解的緣故。因此選用微波功率50 W比較適宜。

2.4 提取時(shí)間對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響

圖4 超聲微波時(shí)間對(duì)菠蘿蜜果皮多酚得率的影響Fig.4 The effect of extraction time on polyphenols yield of jackfruit peel

由圖4可知，當(dāng)微波超聲時(shí)間達(dá)到9 min時(shí)，多酚得率達(dá)到最大值；之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚得率反而減少。說明微波超聲9 min時(shí)多酚已提取完全，而隨著多酚在空氣中暴露時(shí)間的增加，有部分分解，使其得率有所降低。因此，最佳微波超聲時(shí)間為9 min。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化菠蘿蜜果皮多酚提取工藝

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用時(shí)間（X1）、功率（X2）、乙醇濃度（X3）、料液比（X4）4因素3水平設(shè)計(jì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)中心組合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表4。

2.5.2 數(shù)學(xué)模型的建立和方差分析 利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚得率（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

此模型的方差分析結(jié)果見表5。由表5可知，模型p值小于0.0001，說明二次回歸模型是極顯著的。失擬項(xiàng)p值為0.077（＞0.05），差異不顯著，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾小，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起。相關(guān)系數(shù)R2為0.9944，說明二次回歸模型能夠較好的反應(yīng)響應(yīng)值的變化，模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合程度好。

從各個(gè)因素的顯著性水平差異可知，對(duì)多酚得率的影響次序?yàn)椋毫弦罕龋竟β剩疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間。其中，微波功率、乙醇濃度、液料比的一次項(xiàng)，時(shí)間與微波功率的交互項(xiàng)、時(shí)間與乙醇濃度的交互項(xiàng)、時(shí)間與料液比的交互項(xiàng)、微波功率與料液比的交互項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響都達(dá)到了極顯著水平（p＜0.01）；微波功率與乙醇濃度的交互項(xiàng)對(duì)多酚得率的影響達(dá)到了顯著水平（0.01＜p＜0.05）。其因素間交互作用的響應(yīng)面如圖5所示，與方差分析結(jié)果一致。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Experimental design and result of Box-Behnken

2.5.3 超聲-微波協(xié)同工藝的優(yōu)化組合及其驗(yàn)證 根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析以及模型擬合，利用Desig-Expert 8.0軟件分析并修正后得出菠蘿蜜果皮多酚提取的最佳工藝為：料液比1∶40，乙醇濃度70%，微波功率75 W，微波超聲時(shí)間12 min，菠蘿蜜果皮多酚得率的預(yù)期值約為7.23 mg/g。根據(jù)最佳工藝條件，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)所得的菠蘿蜜果皮多酚得率平均值為7.19 mg/g，與預(yù)期值相接近，說明該響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

2.6 抗氧化活性測(cè)定

菠蘿蜜提取物的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果如表6所示，從表6可以看出，利用超聲-微波協(xié)同萃取的菠蘿蜜果皮多酚提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力，且隨濃度的增加而增強(qiáng)，呈量效關(guān)系，其EC50值分別為101.39 μg/mL和106.60 μg/mL，抑制效果略低于陽(yáng)性對(duì)照物BHT（89.29 μg/mL）。并且，多酚提取物濃度與DPPH自由基清除率和ABTS自由基的清除率之間具有較好的線性關(guān)系，R2分別為0.9657和0.9913，表明多酚是菠蘿蜜果皮中具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表5 回歸模型的方差分析Table5 Analysis of variance of the regression model

表6 菠蘿蜜果皮多酚提取物抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table6 The antioxidant activity results of the polyphenol extracts from jackfruit peel

2.7 超聲-微波協(xié)同萃取高效作用分析

為了評(píng)價(jià)超聲波-微波協(xié)同提取效率，本文將其與單獨(dú)超聲波輔助、單獨(dú)微波輔助和傳統(tǒng)水浴回流提取法進(jìn)行比較，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。由圖6a可知，協(xié)同最佳工藝所得多酚得率顯著高于其他三種提取工藝（p＜0.05），超聲、微波、水浴回流的多酚得率分別為協(xié)同提取物的86.87%、83.44%和14.38%，其中傳統(tǒng)水浴回流提取得率最低，為1.04 mg/g。同時(shí)由圖6 b可見，協(xié)同提取最佳工藝所得提取物DPPH、ATBS值也顯著高于其他三種提取工藝所得提取物（p＜0.05）。對(duì)比結(jié)果說明，超聲-微波協(xié)同萃取方法提取效率最高，展現(xiàn)出更高的多酚得率和抗氧化活性，原因是超聲-微波協(xié)同萃取法結(jié)合了超聲振動(dòng)的空化作用與微波的高能作用，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因而對(duì)植物的有效成分能快速高效的提取，且不破壞所萃取有機(jī)分子的的結(jié)構(gòu)［20］。陳衛(wèi)云等［21］從荔枝果肉中提取多糖時(shí)，通過比較超聲-微波協(xié)同法與傳統(tǒng)熱水法、超聲法、微波法，也得出了相似的結(jié)論。

圖5 因素交互作用對(duì)總酚含量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface for interactive effects four process parameters on polyphenols yield

圖6 超聲-微波協(xié)同萃取與其他工藝提取效率的比較Fig.6 Extraction efficency comparison among different processes

3 結(jié)論

采用超聲-微波協(xié)同技術(shù)（UMAE），通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菠蘿蜜果皮中多酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳工藝條件為料液比1∶40，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，微波功率75 W，提取時(shí)間12 min。在該條件下，多酚得率為7.19 mg/g，其提取效率優(yōu)于傳統(tǒng)水浴回流（1.04 mg/g）、微波輔助法（5.23 mg/g）和超聲輔助法（5.89 mg/g）?？寡趸钚匝芯勘砻?，菠蘿蜜果皮多酚提取物對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力，呈量效關(guān)系，其EC50值分別為101.39 μg/mL 和106.60 μg/mL，表明多酚是菠蘿蜜果皮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，該方法的應(yīng)用對(duì)進(jìn)一步開發(fā)菠蘿蜜下腳料的應(yīng)用價(jià)值具有重大的借鑒意義。

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Optimization of ultrasonic-microwave assisted extraction of polyphenols from jackfruit peel and evaluation of its antioxidant activities

JIANG Zhi-guo1，LI Bin1，*，WANG Yan-hua2，*，ZHANG Hai-de1
（1.College of Food Science，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Information，Hainan University，Haikou 570228，China）

In order to maximize the yield of polyphenols from jackfruit peel，response surface methodology（RSM）was employed to optimize the ultrasonic-microwave assisted extraction（UMAE）conditions，and the antioxidant activities of the polyphenol extracts were evaluated in vitro.On the basis of single-factor experiments，the Box-Behnken center-composite experimental design principle was used to design the experiments and the response surface analysis with 4 factors and 3 levels was adopted.A second order quadratic equation for extraction of polyphenols was created.After analyzed the significance of various factors and their interactions，the optimal extraction conditions for polyphenols from jackfruit peel were determined as follows:70%aqueous ethanol as the extraction solvent，1∶40 as solid-liquid ratio，extraction time 12 min and microwave power 75 W.The extraction yield of polyphenols was determined to be 7.19 mg/g under the optimized extraction conditions，which were above that of traditional hot water extraction，microwave assisted extraction and ultrasonic assisted extraction（1.04 mg/g，5.23mg/g and 5.89 mg/g，respectively）.These results confirmed that UMAE of polyphenols had great potential and efficiency compared with traditonal extraction technologies.Furthermore，the experiments of antioxidant activity showed that polyphenol extracts of jackfruit peel exhibited strong antioxidant activities by the DPPH and ABTS radical scavenging assays，and the EC50were 101.39 μg/mL and 106.60 μg/mL，respectively.The present study showed that the jackfruit peel were strong radical scavengers and could be considered as a good source of natural antioxidants for medicinal and commercial uses.

jackfruit peel；polyphenols；microwave-ultrasonic assisted extraction；response surface methodology；antioxidant activity

TS209

B

1002-0306（2016）02-0270-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.046

2015-07-02

蔣志國(guó)（1977-），男，博士，副教授，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：jzg6666@163.com。

*通訊作者：李斌（1966-），男，大學(xué)本科，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：lzc66@21cn.com。

王燕華（1980-），女，大學(xué)本科，講師，研究方向：統(tǒng)計(jì)分析，E-mail：wangyanhua0007@163.com。

海南省自然科學(xué)基金（20153157）；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（Hnky2015ZD-3）。