董書君，申晶晶，常耀光，薛長湖（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

巖藻聚糖硫酸酯酶提取方法比較研究及響應面優(yōu)化

董書君，申晶晶，常耀光*，薛長湖
（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

為了研究海洋細菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127產(chǎn)胞內(nèi)巖藻聚糖硫酸酯酶的高效提取方法，本研究比較了超聲破碎、化學試劑法、溶菌酶法、滲透壓作用、反復凍融等幾種方法對Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞內(nèi)巖藻聚糖硫酸酯酶的提取效果，確定超聲破碎法為最優(yōu)方法。進一步通過單因素實驗及響應面實驗考察了超聲破碎各因素對提取效果的影響，建立了預測超聲破碎法提取巖藻聚糖硫酸酯酶酶活的數(shù)學模型，并對各因素條件進行了優(yōu)化。最終確立的超聲破碎提取最佳條件為：破碎功率600 W，菌懸液濃度20 mg/mL，破碎總時長9 min，單次破碎時長為6 s，間歇時長4 s。利用優(yōu)化方法可從單位質(zhì)量（g）菌體中獲得巖藻聚糖硫酸酯酶酶活（1640.47±84.81）mU/g，提取效果較優(yōu)化前提高了56.80%。

巖藻聚糖硫酸酯酶，巖藻聚糖硫酸酯，超聲破碎法，響應面優(yōu)化，海參

糖苷酶是多糖改性研究的重要工具。巖藻聚糖硫酸酯是一類由巖藻糖和硫酸酯基構(gòu)成的多糖類物質(zhì)，廣泛存在于褐藻和一些海洋無脊椎動物（例如海參等）體內(nèi)，已經(jīng)被證明具有多種生物活性，如抗凝血［1］、抗腫瘤［2］、調(diào)節(jié)免疫［3］、抗氧化［4］等，在功能食品、藥品、化妝品開發(fā)等領(lǐng)域具有良好的應用前景。巖藻聚糖硫酸酯酶（EC 3.2.1.44）是一類能夠降解巖藻聚糖硫酸酯的酶，能夠切割巖藻聚糖硫酸酯中的糖苷鍵產(chǎn)生低分子量多糖和寡糖。目前，多種海洋微生物［5］、海參［6］及某些軟體動物的消化道［7］等都被證實能夠產(chǎn)生巖藻聚糖硫酸酯酶。

本課題組前期從近海海水中篩選得到一株細菌Flavobacteriaceae sp.CZ1127，能夠穩(wěn)定的產(chǎn)生巖藻聚糖硫酸酯酶［8］。課題組已利用該酶成功制備出巖藻聚糖硫酸酯酶解寡糖，并通過解析寡糖結(jié)構(gòu)解明了多種海參巖藻聚糖硫酸酯多糖的精細結(jié)構(gòu)［9-12］。實驗證實，利用該酶制備的巖藻聚糖硫酸酯低分子量多糖對化療引起的腸道黏膜炎具有顯著的改善效果［13］。針對Flavobacteriaceae sp.CZ1127產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化也已完成［14］。由于該酶主要產(chǎn)于胞內(nèi)，獲取具有一定的難度，因此如何實現(xiàn)該酶的高效獲取成為制約其應用的關(guān)鍵。

本研究的目的在于比較研究并優(yōu)化Flavobacteriaceae sp.CZ1127巖藻聚糖硫酸酯酶的提取方法。首先對超聲破碎法、化學試劑法（Triton、SDS、乳化劑）、滲透壓沖擊法、反復凍融法、溶菌酶法的提取效果進行比較，初步篩選較優(yōu)方法，在此基礎(chǔ)上結(jié)合單因素實驗及響應面實驗（response surface methodology）對處理條件進行進一步優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Flavobacteriaceae sp.CZ1127 分離于近海海水［8］；巖藻聚糖硫酸酯 提取自海地瓜體壁，提取方法如文獻［15］；對羥基苯甲酰肼（pHBH） Alfa Aesar公司；TritonX-100 AMRESCO公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） Sigma公司；吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80 天津博迪化工股份有限公司；溶菌酶 北京Solarbio科技有限公司；其他試劑 購于國藥集團化學試劑有限公司。

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)生化儀器；scientz-650E超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-2550紫外可見分光光度計 SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體發(fā)酵 從固體斜面接種Flavobacteriaceae sp.CZ1127于液體培養(yǎng)基［10］（巖藻聚糖硫酸酯0.2%，NaNO30.2%，MgSO40.5%，CaCl20.01%，F(xiàn)e2（SO4）30.001%，過膜海水配制，pH7.0）中25℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后4℃離心（10000 r/min，10 min），沉淀以20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液（含5 mmol/L MgCl2）重懸并再次離心，收集沉淀得到菌體。

1.2.2 提取方法初篩

1.2.2.1 超聲破碎法 菌體重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得20 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率500 W，單次破碎時長2 s，間歇時長2 s，工作總時長12 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.2.2 化學試劑法 將TritonX-100、SDS、吐溫20、吐溫40、吐溫60及吐溫80分別分散或溶解于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得各提取液，其濃度分別為0.75%（v/v）、0.03 mg/mL、0.2%（v/v）、0.2%（v/v）、0.2%（v/v）及0.2%（v/v）。將菌體以20 mg/mL的濃度重懸于各提取液，25℃震搖1 h后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.2.3 溶菌酶法 將菌體以20 mg/mL濃度重懸于溶菌酶溶液（10 mg/mL，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0），37℃孵育1 h后4℃離心（10000 r/min，10 min）取上清得到酶液。

1.2.2.4 滲透壓沖擊法 菌體以20 mg/mL濃度重懸于高滲透壓溶液（含0.15 g/mL蔗糖及0.5 mg/mL EDTA的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液）中，冰水浴0.5 h后4℃離心（12000 r/min，10 min），收集沉淀菌體并向其中加入與高滲透壓溶液相同體積的20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液，冰水浴0.5 h后離心收集菌體，重復上述操作，取上清作為酶液。

1.2.2.5 反復凍融法 菌體以20 mg/mL重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中，-40℃冷凍2 h后置于25℃融化，反復凍融5次，4℃離心（10000 r/min，10 min）收集上清得到酶液。

測定各酶液中的巖藻聚糖硫酸酯酶酶活，并計算各提取方法從單位質(zhì)量（g）菌體中獲得酶活總量，篩選出較優(yōu)方法。

1.2.3 超聲破碎法條件的單因素實驗

1.2.3.1 超聲破碎功率的選擇 菌體重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得20 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率分別選取300、400、500、600 W，單次破碎時長2 s，間歇時長2 s，工作總時長12 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.2 超聲破碎總時長的選擇 菌體重懸于20mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得20 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率為600 W，單次破碎時長2 s，間歇時長2 s，工作總時長選取6、9、12、15 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.3 超聲破碎菌懸液濃度的選擇 菌體重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中分別制得10、20、30、40 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率為600 W，單次破碎時長2 s，間歇時長2 s，工作總時長選取9 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.4 超聲破碎單次破碎時長的選擇 菌體重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得20 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率為600 W，單次破碎時長選取2、5、8、10 s，間歇時長2 s，工作總時長選取9 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.3.5 超聲破碎間歇時長的選擇 菌體重懸于20 mmol/L pH7.2 Tris-HCl緩沖液中制得20 mg/mL菌懸液。將菌懸液置于冰水浴中進行超聲破碎，超聲功率為600 W，單次破碎時長取5 s，間歇時長選取1、2、3、5 s，工作總時長選取9 min。處理完畢后4℃離心（10000 r/min，10 min），取上清得到酶液。

1.2.4 超聲破碎法條件的響應面法優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Central Composite Design中心組合實驗設計原理，以破碎總時長（X1）、單次破碎時長（X2）及間歇時長（X3）為自變量，以單位質(zhì)量（g）菌體中獲得的酶活總量（Y）為響應值，設計三因素五水平實驗。實驗因素及其水平的取值見表1。

表1 響應面實驗因素編碼及水平表Table1 Experimental factor coding and levels

1.2.5 酶活測定方法 巖藻聚糖硫酸酯酶酶活的定量依據(jù)課題組前期建立的pHBH法進行［16］：將0.375 mL底物溶液（2 mg/mL巖藻聚糖硫酸酯溶于20 mmol/LpH7.2 Tris-HCl）與0.375 mL酶液混合，28℃反應0.5 h后加入0.25 mL pHBH試劑（0.2 g/mL pHBH溶于2 mol/L的HCl，反應前與2 mol/L NaOH按照體積比1∶9混合），于100℃反應5 min，冷卻后于415 nm檢測吸光值，根據(jù)單位時間內(nèi)還原糖的產(chǎn)生量計算酶活。1 mL酶液1 min內(nèi)水解巖藻聚糖硫酸酯產(chǎn)生1 μmol糖苷鍵的活力定義為1 U。以mU/g作為單位質(zhì)量（g）菌體中獲得的酶活總量的單位。

1.2.6 統(tǒng)計分析 各實驗重復3次，結(jié)果以平均值表示。方差分析采用SPSS 19.0軟件，顯著性差異分析采用LSD測試。響應面實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6.1軟件進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取方法的比較研究

利用超聲破碎法、化學試劑法（Triton、SDS、吐溫）、溶菌酶法、滲透壓沖擊法及反復凍融法處理Flavobacteriaceae sp.CZ1127菌體，所得酶液中的巖藻聚糖硫酸酯酶酶活列于表2。其中，超聲波破碎法提取效果最佳，酶活達（1046.24±58.16）mU/g。

超聲波破碎法是破碎細胞常用方法之一，其利用超聲波產(chǎn)生的與細胞震動頻率不同的高頻振動，產(chǎn)生空化現(xiàn)象引起沖擊波和剪切力，造成細胞結(jié)構(gòu)破壞，進而釋放胞內(nèi)物質(zhì)［17］。Silchenko［18］、Sakai［6］及Kim等［19］均利用該方法破碎細菌，獲取胞內(nèi)巖藻聚糖硫酸酯酶。

TritonX-100處理、SDS處理、滲透壓沖擊和反復凍融法均能不同程度釋放胞內(nèi)酶活。TritonX-100及SDS屬于表面活性劑，具有較強的親脂性，可能通過破壞細胞壁及細胞膜中脂質(zhì)分子的致密性、增加膜結(jié)構(gòu)的通透程度，實現(xiàn)胞內(nèi)酶釋放。滲透壓沖擊法利用高滲透壓及低滲透壓的轉(zhuǎn)換使細胞發(fā)生溶脹，釋放胞內(nèi)物質(zhì)。反復凍融中，細胞在冷凍條件下形成胞內(nèi)冰晶，引起細胞液濃度升高導致細胞溶脹，同時冰晶的反復形成與消融也可造成細胞膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而釋放胞內(nèi)物質(zhì)［16］。

吐溫20、吐溫40、吐溫60及吐溫80為食品工業(yè)中常用的乳化劑，表面活性相比TritonX-100較差，可能導致其提取效果較低。溶菌酶能夠破壞細菌細胞壁肽聚糖從而破壞細胞壁結(jié)構(gòu)，常用于革蘭氏陽性菌胞內(nèi)物質(zhì)的提取，由于Flavobacteriaceae sp.CZ1127屬于革蘭氏陰性菌［8］，細胞壁中肽聚糖含量較少，因此溶菌酶處理的效果較差。

基于上述結(jié)果，選擇超聲破碎法進行進一步條件優(yōu)化。

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲破碎法功率的選擇 當破碎功率300～600 W范圍內(nèi)，提取效果不存在顯著性差異（p＞0.05）（圖1），說明在選定范圍內(nèi)破碎功率對提取效果的影響較小，因此不對該因素進行后續(xù)優(yōu)化。由于破碎功率為600 W時提取效果的數(shù)值最高，選定600 W為最終條件。

圖1 功率對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.1 Influence of power on the performance of ultrasonic extraction

2.2.2 超聲破碎總時長的選擇 隨著破碎總時長增加，單位菌體中提取得到的巖藻聚糖硫酸酯酶酶活總量呈現(xiàn)先增加（6～9 min）后下降（9～12 min）的趨勢（圖2）。破碎時長不足將導致細胞破碎不完全，隨著破碎總時長的延長，細胞破碎完全，胞內(nèi)酶完全釋放，檢測到酶活升高；然而破碎總時長過度延長將導致超聲波熱效應增強，造成酶的失活。

圖2 破碎總時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.2 Influence of totle ultrasonic time on the performance of ultrasonic extraction

2.2.3 超聲破碎菌懸液濃度的選擇 超聲破碎的處理效果隨著菌懸液濃度的增加呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢（圖3），當菌懸液濃度為20 mg/mL時，效果最佳。當菌懸液濃度較低時，超聲波在提取液中傳遞的過程能量損失嚴重，因此細胞破碎效果較差，提取酶活較低；菌懸液濃度的提高可能會減弱超聲破碎所形成空穴效應的強度，從而導致破碎效果減弱。

2.2.4 超聲破碎單次破碎時長的選擇 當單次破碎時長在2～5 s范圍內(nèi)，超聲破碎的提取效果隨單次破碎時長的延長而增加，在5～10 s內(nèi)基本穩(wěn)定，推測此時菌體破碎已較為充分（圖4）。

表2 不同提取方法對巖藻聚糖硫酸酯酶的提取效果Table2 Enzyme activities of fucoidanase extracted by using different methods

圖3 菌懸液濃度對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.3 Influence of bacterial concentration on the performance of ultrasonic extraction

圖4 單次破碎時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.4 Influence of single ultrasonic time on the performance of ultrasonic extraction

2.2.5 超聲破碎間歇時長的選擇 由于超聲破碎會產(chǎn)生熱效應，處理時需將菌懸液置于冰水浴環(huán)境，設置適當?shù)拈g歇時長也是消除熱效應的有效手段。在1～3s范圍內(nèi)，間歇時長的延長將提高超聲破碎的提取效果；在3～5s范圍內(nèi)，提取效果基本穩(wěn)定（圖5）。

圖5 間歇時長對超聲破碎法提酶效果的影響Fig.5 Influence of interval time on the performance of ultrasonic extraction

2.3 超聲破碎法條件的響應面法優(yōu)化

2.3.1 模型建立與顯著性分析 響應面法可在較少實驗次數(shù)的情況下，全面考察各種因素及其交互作用對結(jié)果的影響，快速、準確確定最佳條件。根據(jù)上述單因素實驗的結(jié)果，破碎總時長（X1）、單次破碎時長（X2）和間歇時長（X3）三個因素對超聲破碎的提取效果有明顯影響，且依據(jù)超聲破碎的原理預測三者可能存在交互作用，因此進一步利用響應面實驗對上述三個因素的條件進行優(yōu)化。響應面實驗各組結(jié)果見表3，利用Design Expert軟件對表3數(shù)據(jù)進行回歸擬合，建立的數(shù)學模型如下：Y=1526.26-0.045X1+42.52X2+58.87X3-1.40X1X2+3.73X1X3+17.42X2X3-32.90X-42.68X-36.42X。

表3 響應面實驗設計及結(jié)果Table3 Response surface methodology experimental design and results

模型的方差分析結(jié)果列于表4。數(shù)據(jù)顯示，擬合的模型具有高度顯著性（p=0.0027＜0.01），失擬項在α=0.05水平上不顯著（p=0.1106＞0.05），說明其他因素對實驗結(jié)果干擾小。R2=0.86，擬合度＞85%，可用來預測超聲破碎提取巖藻聚糖硫酸酯酶的效果。

表4 回歸模型方差分析Table4 Analysis of variance（ANOVA）for regression model

模型回歸系數(shù)顯著性的檢驗結(jié)果見表5。X2和X3影響顯著（p＜0.05），表明在超聲破碎提取巖藻聚糖硫酸酯酶時，單次破碎時長和間歇時長對酶提取效果具有顯著影響。

2.3.2 模型交互項的解析 破碎總時長與單次破碎時長對破碎提取酶液酶活的影響如圖6所示。隨破碎總時長或單次破碎時長的增加，酶活均呈現(xiàn)先增高后下降趨勢。在破碎總時長及單次破碎時長較短的情況下，破碎效果不充分；當總時長及單次破碎時長較長時酶液酶活下降可能與超聲波的熱效應有關(guān)。

表5 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table5 Significance test of regression coefficients

圖6 破碎總時長及單次破碎時長對破碎效果的交互影響Fig.6 The interaction effect of total ultrasonic time and single ultrasonic time on ultrasonic results

破碎總時長與間歇時長對破碎提取酶液酶活的交互影響如圖7所示。隨間歇時長的延長，酶液中的酶活呈現(xiàn)增加的趨勢。隨破碎總時長的延長，酶液中酶活呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。

圖7 破碎總時長及間歇時長對破碎效果的交互影響Fig.7 The interaction effect of total ultrasonic time and internal time on ultrasonic results

單次破碎時長和間歇時長對破碎提取酶液酶活的影響如圖8所示。超聲破碎的提取效果隨著單次破碎時長和間歇時長的增加逐漸提高。

2.3.3 最優(yōu)條件預測及模型驗證 根據(jù)響應面實驗所得結(jié)果及二次多項方程，利用Design Expert軟件預測并修正后得到最優(yōu)超聲破碎條件為：破碎總時長9 min，單次破碎時長6 s，間歇時長為4 s，此條件下預測的單位質(zhì)量菌體酶活為1569.83 mU/g。

圖8 單次破碎時長及間歇時長對破碎效果的交互影響Fig.8 The interaction effect of single ultrasonic time and single ultrasonic time on ultrasonic results

為檢驗模型預測的準確性，按最優(yōu)條件進行實驗，結(jié)果表明該條件下的提取酶活為（1640.47± 84.81）mU/g，實測值與預測值相近且更高（誤差4.50%），證實模型的準確性高。優(yōu)化條件下的提取效果相較初篩時提高了56.80%，表明本實驗的優(yōu)化取得了較為理想的效果。

3 結(jié)論

超聲破碎法是從Flavobacteriaceae sp.CZ1127胞內(nèi)提取巖藻聚糖硫酸酯酶的較優(yōu)方法。超聲破碎的單次破碎時長與間歇時長是影響處理效果的主要因素。本研究成功建立了以單位菌體酶活為響應值，以破碎總時長、單次破碎時長和間歇時長為自變量的數(shù)學模型。確定最佳破碎條件組合為：破碎總時長9 min，單次破碎時長6 s，間歇時長4 s，破碎功率600 W，菌懸液濃度20 mg/mL。在優(yōu)化條件下，單位質(zhì)量（g）菌體破碎后可得到（1640.47±84.81）mU/g酶活，較優(yōu)化前提高了56.80%。研究結(jié)果可為該巖藻聚糖硫酸酯酶的高效提取提供指導，也為下一步對該酶的作用方式進行研究以及利用該酶制備巖藻聚糖硫酸酯寡糖奠定了基礎(chǔ)。

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The study of extraction methods for fucoidanase and optimization using response surface methodology

DONG Shu-jun，SHEN Jing-jing，CHANG Yao-guang*，XUE Chang-hu
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In order to obtain high efficiency methods of extracting fucoidanase from Flavobacteriaceae sp.CZ1127，this study compared several kinds of methods，and ultrasonic method was selected as the best method.The single factor experiments and response surface methodogy were adopted to search optimalizing conditions of extraction fucoidanase.And a second order quadratic equation was established.Results indicated that the optimalizing conditions of ultrasonic were as follows:ultrasonic power 600 W，bacterial concentration 20 mg/mL，total ultrasonic time 9 min，single ultrasonic time 6 s and internal time 4 s.After optimization，the enzyme activity of fucoidanase by ultrasonic method was improved to（1640.47±84.81）mU/g，and the enzyme activity increased by 56.80%.

fucoidanase；fucoidan；ultrasonic method；response surface methodogy；sea cucumber

TS201.3

B

1002-0306（2016）02-0249-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.042

2015－06－10

董書君（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品酶學，E-mail：dongshujun927@163.com。

*通訊作者：常耀光（1985-），男，副教授，研究方向：海洋食品碳水化合物，E-mail：changyg@ouc.edu.cn。

國家自然科學基金（31471684）；高等學校博士學科點專項科研基金（20110132120015）。