程 雪，張秀玲，孫瑞瑞，劉茜茜，劉 旭，李賽男（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

熱處理輔助水酶法提取紫蘇籽油的工藝優(yōu)化

程 雪，張秀玲*，孫瑞瑞，劉茜茜，劉 旭，李賽男
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

以紫蘇籽為原料，采用熱處理輔助水酶法為提油工藝。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇酶解溫度，酶解時(shí)間，酶添加量以及酶解pH為自變量，紫蘇油的清油得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究各自變量及其交互作用對(duì)清油得率的影響。結(jié)果表明影響清油得率的強(qiáng)弱順序如下：酶添加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶解pH。確定最佳酶解條件為酶解溫度46℃、酶解時(shí)間3.0 h、酶添加量3.49%（纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2）、酶解pH6.0，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得清油得率為59.02%，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差約為1.49%，說明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是可靠的。

紫蘇籽油，熱處理，水酶法，響應(yīng)面

紫蘇（Perilla frutescen（L.）Brit.），又稱蘇子、赤蘇等，為我國衛(wèi)生部首批許可的既是食品又是藥品的60種植物之一［1］。紫蘇籽的含油量很高，能達(dá)到40%～60%，油中含有多種脂肪酸：其中含有亞麻酸56.65%，油酸16.3%，亞油酸13.1%，而棕櫚酸僅占6.61%［2］。紫蘇籽油由于富含α-亞麻酸，因此具有降低總膽固醇濃度，預(yù)防心血管疾病，抑制心肌梗塞及腦梗塞的發(fā)生，預(yù)防及抑制腫瘤形成等功效［3-4］。

我國現(xiàn)有的從紫蘇籽中提取紫蘇油的方法大多局限于冷榨，溶劑浸提法，超臨界CO2萃取法等［5］。水酶法是一種新興的植物油脂萃取技術(shù)，具有反應(yīng)條件溫和，得到的植物油純度高等優(yōu)點(diǎn)［6-7］。水酶法提油預(yù)處理方式有：機(jī)械粉碎、超聲波、擠壓膨化、熱處理等［8］。徐冰冰等研究超聲波輔助提取紫蘇油的工藝，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助未見效果［9］。賈照寶等指出，熱處理工藝這一預(yù)處理方法能有效地提高水酶法的清油提取率［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)首次嘗試選用熱處理輔助水酶法提取紫蘇籽油。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化復(fù)合酶的酶解條件，以期為紫蘇籽油的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)，并為紫蘇籽的綜合開發(fā)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇籽 黑龍江省樺南縣林業(yè)局提供；堿性蛋白酶（100 kU/g）、中性蛋白酶（80 kU/g）、高溫淀粉酶（20 kU/g）、果膠酶（100 kU/g）、纖維素酶（50 kU/g） 均購于寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；其余試劑 均為分析純。

HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；萬能粉碎機(jī) 紹興市科弘儀器有限公司；YP20002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì)

上海市彭順有限公司；低速離心機(jī) 上海安亭儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇籽粗成分分析 紫蘇籽的粗成分分析均采用國標(biāo)法。其中，粗蛋白采用GB/T 15589.2-2008測(cè)定；粗脂肪采用GB/T 14772-2008測(cè)定；粗纖維采用GB/T 5009.10-2003測(cè)定。

1.2.2 水酶法提油工藝路線 紫蘇籽→粉碎過篩（20目）→加一定的水?dāng)嚢琛鸁崽幚怼{(diào)節(jié)pH及溫度→加酶酶解→滅酶（80℃，10 min）→離心（5000×g，15 min）→得到清油Ⅰ→冷凍-解凍破乳→離心→得到清油Ⅱ→合并清油，計(jì)算清油得率［11］。

1.2.3 酶制劑的篩選 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，按照1.2.2工藝流程，根據(jù)紫蘇籽的成分特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的酶制劑（堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、高溫淀粉酶）各加入3%（加酶質(zhì)量/紫蘇籽質(zhì)量，v/w），反應(yīng)條件為各酶的最適條件，而后計(jì)算清油得率，選擇合適的酶進(jìn)行復(fù)配。

1.2.4 熱處理輔助提油實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［10］采用熱處理參數(shù)為溫度60℃，加熱時(shí)間20 min。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 料液比對(duì)清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度為45℃，酶解時(shí)間為3 h，酶解體系的pH為6.0，考察料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 g/mL時(shí)對(duì)總清油得率的影響。

1.2.5.2 酶解溫度對(duì)清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復(fù)合酶添加量3%，酶解體系的pH為6.0，酶解時(shí)間為3 h，料液比1∶5，考察酶解溫度分別為25、35、45、55、65℃時(shí)對(duì)總清油得率的影響。

1.2.5.3 酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復(fù)合酶添加量3%，酶解體系的pH為6.0，溫度45℃，料液比1∶5，考察酶解時(shí)間分別為2、3、4、5、6 h時(shí)對(duì)總清油得率的影響。

1.2.5.4 酶添加量對(duì)清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，酶解體系的pH為6.0，酶解溫度為45℃，酶解時(shí)間為3 h，料液比1∶5，考察復(fù)合酶添加量（v/w）分別為1%、2%、3%、4%、5%時(shí)對(duì)總清油得率的影響。

1.2.5.5 酶解pH對(duì)清油得率的影響 稱取紫蘇籽粉末10.00 g，復(fù)合酶添加量3%，酶解溫度為45℃，酶解時(shí)間為3 h，料液比1∶5，考察酶解pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5時(shí)對(duì)總清油得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，以清油得率為響應(yīng)值，選取酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量、酶解pH為影響因素，采用Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。其因素水平表如表1所示。

表1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table1 Level and code of variables for Box-Benhnken design

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)采用Origin 8.5作圖，運(yùn)用Design Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇籽粗成分分析

采用國標(biāo)分析法，測(cè)得紫蘇籽的粗成分為粗脂肪含量44.32%±0.83%，粗蛋白含量在21.48%±0.76%左右，粗纖維含量在8.42%±0.39%左右。

2.2 酶制劑的篩選

根據(jù)紫蘇籽的成分分析結(jié)果可知，其蛋白和纖維素的含量都相對(duì)較高，而水酶法提油的基本原理是通過酶的作用分解植物油料中富含粗纖維的細(xì)胞壁、脂蛋白、脂多糖，從而使油釋放出來［12］。因此，擬從堿性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶以及高溫淀粉酶中篩選出酶解效果最好的酶制劑。按照上述工藝流程，各種酶的酶解條件均按其最適條件反應(yīng)，其中堿性蛋白酶為溫度40℃，pH9.8；中性蛋白酶為溫度45℃，pH7.0；纖維素酶為溫度50℃，pH4.8；果膠酶為溫度55℃，pH3.5；高溫淀粉酶為溫度70℃，pH6.0。結(jié)果如圖1所示。

圖1 單一酶制劑對(duì)游離油得率的影響Fig.1 The effects of signal enzyme on the yield of free oil

根據(jù)圖1可知，在無酶的條件下，游離油得率僅為11.91%。單獨(dú)使用其他酶，得率有所提高，但是總體水平不高。這是因?yàn)槊冈诿附鈺r(shí)具有專一性，單獨(dú)使用效果有限，故考慮將酶復(fù)配使用，以提高提油率［11］。根據(jù)各種酶的最適反應(yīng)條件（反應(yīng)體系的pH以及溫度）、相應(yīng)酶的清油提取率，選擇兩種反應(yīng)條件接近、清油得率較高的酶進(jìn)行復(fù)配，本文選擇纖維素酶與中性蛋白酶復(fù)配。然后，在固定反應(yīng)條件的情況下，對(duì)復(fù)合酶的復(fù)配比例進(jìn)行選擇，根據(jù)紫蘇籽成分特點(diǎn)，選取纖維素酶與中性蛋白酶的比例為1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，復(fù)合酶制劑明顯的提高了清油得率，這是因?yàn)榧?xì)胞壁的組成成分主要是纖維素和多糖類物質(zhì)［6］。而且，當(dāng)纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2時(shí)，清油得率最高，為47.58%，這與紫蘇籽的成分含量有關(guān)。故以下均采用纖維素酶∶中性蛋白酶=1∶2的復(fù)合酶進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖2 復(fù)合酶制劑復(fù)配比例的實(shí)驗(yàn)Fig.2 The test on the ratio of the complex enzymes

2.3 熱處理輔助提油實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本文選擇無預(yù)處理的水酶法提油工藝為對(duì)照組，提油工藝按1.2.2進(jìn)行，結(jié)果為：對(duì)照組清油得率為32.92%，實(shí)驗(yàn)組清油得率為49.44%?？梢悦黠@的看出，熱處理這一預(yù)處理方式效果顯著。這是因?yàn)闇囟壬撸w系內(nèi)分子的布朗運(yùn)動(dòng)也相應(yīng)劇烈，因此脂肪球膜的破裂速度加快，同時(shí)，在溫度較高時(shí)，乳狀液的粘度也會(huì)降低，由此促進(jìn)了油脂的分離，小脂肪球能夠融合，進(jìn)而形成較大的油滴游離出來［13］。此外，熱處理還起到滅酶的作用，使物料中天然存在的酶（如過氧化酶、脂肪酶等）失活［14］。

2.4 水酶法提取紫蘇油單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 料液比對(duì)清油得率的影響 從圖3中可以看出，在料液比（g/mL）由1∶3～1∶5時(shí)，清油得率不斷增加，表明在水酶法提取油脂的過程中，適量增加水的比例有助于清油得率的提高，但隨著料液比繼續(xù)增加，清油得率反而降低，這說明，水分含量過高會(huì)導(dǎo)致酶的濃度降低，酶與底物接觸減少，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。因此，料液比最佳為1∶5，其清油得率為58.35%。

圖3 料液比對(duì)紫蘇籽清油得率的影響Fig.3 The effects of sample-to-solvent ratio on the yield of free oil

2.4.2 酶解溫度對(duì)清油得率的影響 根據(jù)圖4可知，溫度在25～45℃時(shí)，清油得率呈上升的趨勢(shì)，后隨著溫度的增加，清油得率逐漸下降。這是因?yàn)閷?duì)于一個(gè)酶促反應(yīng)來說，溫度影響酶的活性，只有在最適的溫度條件下，酶活才能達(dá)到最大，過高或過低都會(huì)導(dǎo)致酶失活，進(jìn)而影響清油得率。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的復(fù)合酶最適溫度為45℃，清油得率為58.21%。

圖4 酶解溫度對(duì)紫蘇籽清油得率的影響Fig.4 The effects of enzymolysis temperature on the yield of free oil

2.4.3 酶解時(shí)間對(duì)清油得率的影響 根據(jù)圖5所示，酶解時(shí)間延長，清油得率不斷增加，在酶解時(shí)間為3 h時(shí)達(dá)到最大，為58.42%，但是，酶解時(shí)間繼續(xù)增加，清油得率反而略有下降，這是因?yàn)榈孜餃p少及抑制作用增強(qiáng)等原因，油的釋放就不再進(jìn)一步增加，同時(shí)時(shí)間過長，乳狀液的乳化程度會(huì)加大，不利于油脂的提?。?5］。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇籽清油得率的影響Fig.5 The effects of enzymolysis time on the yield of free oil

2.4.4 酶添加量對(duì)清油得率的影響 根據(jù)圖6所示，復(fù)合酶添加量（v/w）在1%～3%時(shí)清油得率不斷上升，繼續(xù)增加酶的用量，清油得率不再增加。這是因?yàn)閺?fù)合酶的酶解能力與底物量已經(jīng)達(dá)到平衡，復(fù)合酶繼續(xù)增加也不會(huì)提高其酶解底物的能力，所以綜合以上情況及考慮實(shí)際成本，選擇復(fù)合酶用量為3%，此時(shí)，清油得率為56.37%。

2.4.5 酶解pH對(duì)清油得率的影響 根據(jù)圖7所示，隨著pH的增加，清油得率不斷上升，在pH為6.0時(shí)清油得率達(dá)到最大，為57.25%；pH繼續(xù)增加而清油得率下降。這是因?yàn)閜H的大小會(huì)影響酶的活性，可知復(fù)合酶的活性在pH6.0時(shí)活性最高。水酶法提取油脂的過程是將蛋白質(zhì)、纖維素溶解的過程，pH會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)適當(dāng)溶解有利于油脂釋放，但蛋白質(zhì)溶解度過大會(huì)增加乳化程度，使得提油率下降［16］。同時(shí)，pH的大小也會(huì)對(duì)酶的活力產(chǎn)生影響，過高或過低都會(huì)導(dǎo)致酶失活，進(jìn)而影響提油率。

圖6 酶添加量對(duì)紫蘇籽清油得率的影響Fig.6 The effects of enzyme loading on the yield of free oil

圖7 酶解pH對(duì)紫蘇籽清油得率的影響Fig.7 The effects of pH on the yield of free oil

2.5 響應(yīng)面法分析數(shù)學(xué)模型的建立

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以清油得率為響應(yīng)值，選取酶解溫度（X1）、酶解時(shí)間（X2）、酶添加量（X3）、酶解pH（X4）為影響因素，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。使用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到預(yù)測(cè)模型如下：

對(duì)該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，如表3所示，可以看出該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，且R2=0.9268，R=0.8536，說明該模型與實(shí)際擬合度較好，自變參數(shù)與響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，因此可以用于水酶法提取紫蘇油的工藝預(yù)測(cè)。根據(jù)F檢驗(yàn)可以得到各個(gè)因素影響的大小順序?yàn)椋篨3＞X1＞X2＞X4，即酶添加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶解pH。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面分析圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素之間的相互作用。

2.5.2 各因素的交互作用 根據(jù)表3的方差分析表，可以看出X3、X的偏回歸系數(shù)差異極度顯著，說明酶添加量對(duì)清油得率有極顯著的影響。X1的偏回歸系數(shù)差異高度顯著，X2、X4、X1X2、X2X3、X2X4的偏回歸系數(shù)差異顯著，說明因素之間存在交互作用，因此因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。得到的二次回歸方程的響應(yīng)曲面交互作用顯著的響應(yīng)面3D分析圖。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Box-Benhnken design and results

圖8 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)清油得率交互影響的曲面圖Fig.8 The 3-D surface plot of enzymolysis temperature and time interaction on yield of free oil

根據(jù)圖8可知，當(dāng)復(fù)合酶添加量為3.0%，酶解pH 為6.0時(shí)，隨著酶解溫度的增加，酶解時(shí)間的延長，清油得率增加。圖8中的等高線圖表現(xiàn)為橢圓形，故酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用極為顯著。

表3 方差分析Table3 Variance analysis of experimental result

圖9 酶解時(shí)間和酶添加量對(duì)清油得率交互影響的曲面圖Fig.9 The 3-D surface plot of enzymolysis temperature and enzyme loading interaction on yield of free oil

根據(jù)圖9可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為6.0時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，復(fù)合酶添加量的增加，清油得率增加。圖9中的等高線圖表現(xiàn)為橢圓形，故酶解時(shí)間和酶添加量的交互作用極為顯著。

根據(jù)圖10可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，復(fù)合酶添加量為3.0%時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，酶解pH的增加，清油得率增加。圖10中的等高線圖表現(xiàn)為橢圓形，故酶解時(shí)間和酶解pH的交互作用極為顯著。

2.5.3 最佳提取條件的確定 利用Design Expert 7.0軟件，對(duì)擬合的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得出水酶法提取紫蘇油的最佳提取條件為：酶解溫度（X1）45.93℃、酶解時(shí)間（X2）2.95 h、酶添加量（X3）3.49%、酶解pH （X4）6.03，此時(shí)清油得率為59.91%?？紤]實(shí)際操作，選擇酶解溫度（X1）46℃、酶解時(shí)間（X2）3.0 h、酶添加量（X3）3.49%、酶解pH（X4）6.0，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得清油得率為59.02%，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為1.49%，說明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是可靠的。

圖10 酶解時(shí)間和酶解pH對(duì)清油得率交互影響的曲面圖Fig.1 0 The 3-D surface plot of enzymolysis time and pH interaction on yield of free oil

3 結(jié)論

采用熱處理的方法輔助水酶法提取紫蘇籽油，清油得率由32.92%提高到49.44%，效果明顯。說明用熱處理輔助提取紫蘇籽油是可行的。通過單因素實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面分析法對(duì)水酶法提油工藝進(jìn)行優(yōu)化。擬合了酶解溫度、酶解時(shí)間、酶添加量以及酶解pH這4個(gè)因素對(duì)紫蘇清油得率的回歸模型，得出影響清油得率的強(qiáng)弱順序如下：酶添加量＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞酶解pH。確定最佳酶解條件為酶解溫度46℃、酶解時(shí)間3.0 h、酶添加量3.49%、酶解pH6.0，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得清油得率為59.02%，與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差為1.49%，說明實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的技術(shù)參數(shù)是可靠的，能較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)水酶法提取紫蘇油。水酶法提取紫蘇籽油對(duì)比于其他方法，其優(yōu)勢(shì)在于反應(yīng)的條件溫和，油脂得率較高、品質(zhì)好，且提油后的餅粕中蛋白質(zhì)變性小，有利于副產(chǎn)物的綜合利用。該工藝所需的生產(chǎn)設(shè)備簡(jiǎn)易，有利于工廠在機(jī)械壓榨的基礎(chǔ)上推廣使用。

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Optimizing techniques of Perilla seed oil by aqueous enzymatic extraction assisted with heat treatment

CHENG Xue，ZHANG Xiu-ling*，SUN Rui-rui，LIU Qian-qian，LIU Xu，LI Sai-nan
（School of Food College，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China）

Perilla seed was used as raw material，aqueous enzymatic extraction assisted with heat treatment as the technique.On the basis of one factor test，enzymolysis temperature，time，enzyme loading and pH were chosen as independent variable，the yield of free oil as response value.Then the response surface methodology was applied to test，the effects of every independent variable as well as their interaction on the yield of free oil were researched.The results showed the orders which influenced the free oil yield were as follows:enzyme loading＞enzymolysis temperature＞enzymolysis time＞pH.And the optimized enzymolysis conditions were enzymolysis temperature 46℃，enzymolysis time 3.0 h，enzyme loading 3.49%（cellulase∶neutral protease=1∶2），pH6.0.The proof test gained the free oil yield was 59.02%，and compared with predicted value，the relative error was 1.49%.It suggested that the technical parameters optimized by test were reliable.

Perilla seed oil；heat treatment；aqueous enzymatic extraction；response surface methodology

TS224.4

A

1002-0306（2016）02-0223-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.037

2015－06－10

程雪（1990-），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程，E-mail：15046685797@163.com。

*通訊作者：張秀玲（1968-），女，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工，E-mail：zhangxiuling1118@sina.com。

黑龍江省森工總局項(xiàng)目（sgzjy2013018）。