徐顧榕，蔡 婷，林 凱，宋菲菲，張 慶，向文良（西華大學食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，西華大學古法發(fā)酵（釀造）生物技術研究所，四川成都610039）

四川泡豇豆原料表皮附生乳酸菌抗生素抗性及抗性基因污染分析

徐顧榕，蔡 婷，林 凱，宋菲菲，張 慶，向文良*
（西華大學食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，西華大學古法發(fā)酵（釀造）生物技術研究所，四川成都610039）

以鮮豇豆為研究對象，利用生理生化特征、16S rRNA、抗生素抗性和抗性基因檢測分析其表皮附生乳酸菌對氯霉素（CHL）、四環(huán)素（TET）和氨芐青霉素（AMP）的抗性與抗性基因。結果表明：從鮮豇豆表皮共分離得到182株乳酸菌，分別屬于Weissella confuse（50.0%）、Weissella cibaria（15.4%）、Enterococcus sulfurous（7.1%）和Lactococcus lactis subsp.lactis（27.5%）。32株（17.6%）乳酸菌對CHL和TET有抗性，其中，6株W.confuse（3.3%）和4株L.lactis subsp.Lactis （2.1%）對CHL單一抗性，4株W.confuse（2.1%）和5株L.lactis subsp.Lactis（2.7%）對TET單一抗性，6株W.confuse （3.2%）、2株W.cibaria（1.1%）、1株E.sulfurous（0.5%）和4株L.lactis subsp.Lactis（2.1%）對CHL和TET二重抗性；編碼外排泵基因efrA、efrB、norB、norC、norE和sugE中，efrB的檢出率最高，達31.3%，efrB和sugE的檢出率最低，為3.1%。TET被檢抗性基因tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（H）和tet（L）中，tet（C）的檢出率最高，達90.9%，tet（B）的檢出率最低，為4.5%。

豇豆，附生乳酸菌，抗生素抗性，抗生素抗性基因

抗生素抗性基因是一種新型的環(huán)境污染物，在環(huán)境介質中的持久殘留以及在不同宿主間的水平轉移往往比抗生素本身危害更大，因此其對公共健康和食品安全構成了威脅，目前已成為研究的熱點［1-3］。

研究表明，從抗生素發(fā)現(xiàn)的20世紀30年代至20世紀90年代，土壤微生物對常用抗生素的抗性明顯增加，極易污染食物資源和食品加工環(huán)境［4-5］。迄今為止，已有16種四環(huán)素類抗性基因、3種磺胺類抗性基因、10種β-內酰胺類抗性基因在河流、海洋、土壤、空氣等環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)［2，6-7］。隨著環(huán)境抗生素抗性基因污染的加劇，中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜產品中也發(fā)現(xiàn)了可轉移的抗性基因，為中國傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜的食品安全埋下了隱患。

附著在鮮豇豆表皮的乳酸菌是泡豇豆自然發(fā)酵微生物的主要來源。長期以來，發(fā)酵食品中的乳酸菌被認為是安全的，因此乳酸菌對抗生素的抗性常被忽視。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵食品中使用的乳酸菌對抗生素也產生了抗性，并有上升趨勢。豇豆在種植過程中不可避免會污染環(huán)境中的抗性基因，盡管其污染濃度很低，但一旦它們進入發(fā)酵系統(tǒng)，就可能向其他微生物水平轉移，給泡豇豆的安全埋下隱患。因此，本研究以新鮮豇豆為原料，以常用農用抗生素為篩選因子，分析其表皮附生的抗生素抗性乳酸菌，評估其抗性，并檢測抗性基因，以期為傳統(tǒng)發(fā)酵食品四川泡豇豆生產中的潛在安全風險控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豇豆 四川某泡菜企業(yè)的鮮豇豆10 kg，產地分布在西南和東南省份；MRS肉湯 杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；DH5α感受態(tài)細胞 TaKaRa Biotechnology（Dalian）；pGM-T試劑盒、MarkerⅦ 天根生化科技有限公司；氯霉素、四環(huán)素和氨芐青霉素 北京索萊寶科技有限公司，純度為98%；NEST Biotech Co.，Ltd.，96孔板 無錫耐思生物科技有限公司。

TB-214電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；Allegra X-15R冷凍離心機 貝克曼庫爾特公司；720BR/01492電泳凝膠成像分析系統(tǒng) BIO-RAD公司；Biometra T1 PCR儀 BIO-RAD公司；SGSP-02恒溫培養(yǎng)箱 黃石恒豐器械有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；Tecan Infinite F200型多功能酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離、純化與生化特征分析 隨機選取豇豆25 g，加入225 mL無菌生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器Bagmixer均質1 min。取適量均質液用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于改良MRS瓊脂培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)48 h，挑取有明顯溶鈣圈的菌落于MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線純化3次，得到純菌落。分離得到的所有菌株的生化特征按《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》中的鑒定方法進行［8］。

表1 被檢抗生素耐藥基因的PCR引物序列和退火溫度Table1 The PCR primer and anneal temperature of antibiotic resistance genes in current study

1.2.2 16S rRNA序列分析 根據(jù)Xiang等［9］的方法提取分離得到的所有菌株DNA。以細菌DNA為模板，細菌通用引物Eu27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和原核微生物特異性引物1490R（5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3'）進行16S rRNA擴增。PCR擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃變性1 min、50℃退火1 min、72℃延伸2 min，30個周期，最后72℃保持10 min。PCR產物連接到pGM-T載體后克隆入感受態(tài)細胞E.coli DH5α中，篩選陽性克隆子，提取重組質粒對16S rRNA測序，無嵌合體的序列與RDP數(shù)據(jù)庫中的模式菌株進行相似性比較，確定菌株的分類地位。

1.2.3 抗生素抗性分析 依據(jù)歐洲微生物藥物敏感委員會（http：//www.eucast.org）關于微生物對抗生素的敏感閾值X（http：//www.eucast.org/mic_distributions/），分析菌株的抗生素抗性。當分離菌株的最小抑菌質量濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）≤X μg/mL時，為敏感菌株；反之，則為抗性菌株。菌株Enterococcus faecalis ATCC 29212作為質控菌株。

最小抑菌濃度測定采用微量肉湯稀釋法［10］。分別將CHL、TET和AMP配制成2048 μg/mL的貯存液，MRS液體培養(yǎng)基2倍梯度稀釋成使用液。CHL、TET和AMP的梯度稀釋濃度為1～512 μg/mL。向96孔板中加入198 μL含不同濃度抗生素的MRS液體培養(yǎng)基后，接種2 μL菌株的培養(yǎng)液，37℃靜止培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計不同菌株的MIC。每組重復3次，并設置對照組。

1.2.4 抗生素抗性基因分析 PCR檢測菌株的氯霉素抗性基因cat（A）［11］；四環(huán)素抗性基因tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（H）和tet（L）［12-14］；編碼外排泵基因efrA、efrB、norB、norC、norE和sugE［15-18］。PCR擴增體系：PCR mixture 25 μL，ddH2O 22 μL，DNA模板1 μL，引物各為1 μL；PCR程序：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，待檢基因引物的退火溫度退火30 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)后72℃延伸5 min。引物及退火溫度見表1。1.0%的瓊脂糖電泳檢測擴增產物后，連接到pGM-T載體后，克隆入感受態(tài)E.coli DH5α中，篩選陽性克隆子測序，測序結果在NCBI中利用BlastX程序比對擴增序列，進一步判斷分離菌株是否含有上述被檢抗性基因。

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分離菌株抗性基因，含有該種抗性基因賦值為“1”、不含該種抗性基因賦值為“0”，構建分離菌株抗生素抗性基因表型的“0”和“1”的矩陣。利用NTSYS PC 2.11軟件做UPGMA聚類分析［19-20］，并以各分離菌株抗性基因構建點陣圖，黑色圖表示含有該種抗性基因，灰色圖表示不含該種抗性基因。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與生化特征

本研究從鮮豇豆表皮共分離得到182個溶鈣圈菌落，根據(jù)糖和醇發(fā)酵實驗結果，這些菌株被分成4個簇群，結果見表2。其中，菌株XC001代表的簇群最大，約占總菌落數(shù)的50.0%；菌株XC144代表的簇群最小，僅占7.1%。

表2 豇豆表皮附生乳酸菌的生理生化特征Table2 Physiological and biochemical characteristics of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of the fresh cowpea

2.2 16S rRNA分析

表3 豇豆表皮附生乳酸菌的分類地位與群落構成Table3 The community structure and classify of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of the fresh cowpea

為進一步確定乳酸菌的分類學地位，將分離得到的所有菌株進行16S rRNA序列分析，結果見表3。Stackebrandt等［21］認為：當16S rRNA序列相似性≥97%時可以認為是同一個屬，序列相似性≥98%時則可以認為是同一個種。豇豆表皮附生乳酸菌的16S rRNA序列結果表明：其中，119株乳酸菌均屬于Weissella屬，XC001和XC108群中所分析菌株的16S rRNA序列分別與W.confuse JCM1093T和W.cibaria LMG17699T 的16S rRNA序列相似性為100%和99%，對糖或醇的利用也分別與各自簇群的相似菌株相同，因此XC001 和XC108分別被鑒定為W.confuse和W.cibaria，各占50.0%和15.4%。XC144代表的3株菌屬于Enterococcus屬，16S rRNA序列與E.sulfurous ATCC49903T的16S rRNA序列相似性為100%，在糖或醇的利用方面，XC144群與ATCC49903T一致（表3），因此被鑒定為E.sulfurous，占所有附生乳酸菌的7.1%。XC156代表的50株菌屬于Lactococcus屬，16S rRNA序列皆與L.lactis subsp.lactis NCDO604T的16S rRNA序列相似性為100%，這些菌株對糖或醇的利用與NCDO604T一致（表3），因此XC156群被鑒定為L.lactis subsp.lactis，占27.5%。

2.3 抗生素抗性分析

根據(jù)歐洲抗微生物藥物敏感委員會對乳酸菌閾值X的規(guī)定，在182株乳酸菌株中，有32株乳酸菌具有抗性，約占總菌株數(shù)的17.6%（見表4）。其中CHL單一抗藥菌株10株（5.5%），TET單一抗藥菌株9株（5.0%），CHL和TET的二重抗藥菌株13株（7.1%），無菌株表現(xiàn)出對AMP抗藥性。在32株CHL和TET的單一或二重抗藥菌株中，同種的不同菌株對CHL或TET的MIC值不同，表現(xiàn)出抗藥多樣性。其中W.confusa XC001對CHL和TET的抗藥性最強，其對CHL和TET的MIC分別達到128 μg/mL（閾值X=4 μg/mL）和256 μg/mL（閾值X=8 μg/mL）。

表4 豇豆表皮附生的部分乳酸菌對CHL、TET和STR的MIC與抗藥性（μg/mL）Table4 The CHL，TET and STR antibiotic resistance and MICs for epibiotic lactic acid bacteria on the surface of the fresh cowpea（μg/mL）

在91株W.confuse中，有6株菌（6.6%）表現(xiàn)出對CHL的單一抗藥性，有4株菌（4.4%）表現(xiàn)出對TET的單一抗藥性，有6株菌（6.6%）表現(xiàn)出對CHL和TET的二重抗藥性；在28株W.cibaria中，有2株菌（7.1%）表現(xiàn)出對CHL和TET二重抗藥；在13株E.sulfurous中，有1株菌（7.7%）表現(xiàn)出對CHL和TET的二重抗藥性；在50株L.lactis subsp.lactis菌株中，有4株菌（8.0%）表現(xiàn)出對CHL的單一抗藥性，有5株菌（10.0%）表現(xiàn)出對TET的單一抗藥性，有4菌株（8.0%）表現(xiàn)出對CHL和TET的二重抗藥性。

2.4 抗生素抗性基因分析

在32株CHL和TET的單一或二重抗藥菌株中，除CHL單一抗藥菌株L.lactis subsp.lactis XC172未被檢出任何抗藥基因外，其他抗藥菌株都被檢出1個或多個抗藥基因，結果見圖1。L.lactis subsp.lactis XC172未檢出當前的CHL被檢抗藥基因和外排泵基因，表明XC172可能存在其他抗藥基因。在32株CHL 和TET的單一或二重抗藥菌株中，編碼外排泵基因efrB的檢出率最高，達31.3%，其次是norC，檢出率為28.1%；efrA、norB、norE和sugE的檢出率分別為12.5%、3.1%、18.8%和3.1%。在TET抗藥菌株中，tet（C）的檢出率最高，達90.9%，其次是tet（L），檢出率為36.4%，檢出率最低的是tet（B），為4.5%；tet（A）、tet（D）和tet（H）的檢出率分別為22.7%、27.3%和13.6%。

圖1 豇豆中CHL和TET抗藥附生乳酸菌的CHL、TET和外排泵基因分布Fig.1 The CHL and TET resistance gene distribution of CHL，TET and efflux pump genes resistant epibiotic LABs on the fresh cowpea

菌株W.confuse XC012、XC096和XC081檢測出攜帶的抗藥性基因種類最多，分別包括3種TET基因、3種外排泵基因和4種TET基因、2種外排泵基因；菌株W.confuse XC043、W.confuse XC131、L.lactis subsp.lactis XC148、L.lactis subsp.lactis XC151、L.lactis subsp.lactis XC156、L.lactis subsp.lactis XC157、L.lactis subsp.lactis XC158、L.lactis subsp.lactis XC168和L.lactis subsp.lactis XC171都僅被檢出1種 TET抗藥基因。

在TET抗藥W.confuse菌株中，在同種內的不同菌株被檢出抗藥基因的種內和數(shù)量不盡相同，在具有相同MIC的TET抗藥W.confuse菌株中，被檢出抗藥基因的種內和數(shù)量也不盡相同（圖1）。W.cibaria 和E.sulfureus中的不同抗藥菌株對TET的抗藥基因分布也表現(xiàn)出了與W.confuse類似的情況。上述結果表明：當前被檢菌株中，同種內的不同菌株對TET的抗藥性與相應抗藥基因的種類和數(shù)量多少無相關性。

3 結論

傳統(tǒng)意義上合格的蔬菜主要關注農藥殘留和重金屬含量等這些理化指標，卻很少關注其中的微生物指標，特別是微生物對抗生素抗性指標［1］。因此，當蔬菜表面存在抗性菌株的蔬菜作為四川泡菜原料時，將會給不經(jīng)二次滅菌即可直接食用的四川泡菜帶來潛在的安全風險。本研究從鮮豇豆表皮共分離得到182株乳酸菌，主要屬于W.confuse（50.0%）、W.cibaria（15.4%）、E.sulfurous（7.1%）和L.lactis subsp.lactis（27.5%）。在182株乳酸菌株中，無AMP抗藥菌株，有32株乳酸菌表現(xiàn)出了對CHL和TET的抗藥性，約占總菌落數(shù)的17.6%。其中CHL單一抗藥菌株10株（5.5%），TET單一抗藥菌株9株（5.0%），CHL和TET的二重抗藥菌株13株（7.1%）。在91株W.confuse中，6株CHL單一抗藥，4株TET單一抗藥性，6株CHL和TET二重抗藥；在28株W.cibaria中，2株CHL和TET二重抗藥；在13株E.sulfurous中，1株CHL和TET的二重抗藥；在50株L.lactis subsp.lactis菌株中，4株CHL單一抗藥，5株TET單一抗藥，4株CHL和TET二重抗藥。

抗生素抗性基因分析發(fā)現(xiàn)，除CHL單一抗藥菌株L.lactis subsp.lactis XC172未檢出任何抗藥基因和外排泵基因外，其他31株CHL和TET單一或二重抗藥菌株中，都有1個或多個相應抗藥基因被檢測。其中編碼外排泵基因efrA、efrB、norB、norC、norE和sugE中，efrB的檢出率最高，達31.3%；efrB和sugE的檢出率最低，為3.1%。TET被檢抗藥基因tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（H）和tet（L）中，tet（C）的檢出率最高，達90.9%；tet（B）的檢出率最低，為4.5%。

四川泡豇豆原材料豇豆中抗生素抗藥菌的發(fā)現(xiàn)為四川泡菜的原料安全敲響了警鐘。因此，對于用于四川泡豇豆的豇豆原料，需建立抗生素抗藥性附生乳酸菌的檢測與防控體系，確保未經(jīng)二次滅菌即可直接食用的四川泡菜的食品安全，維護廣大消費者的健康權益。

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Investigation of antibiotic resistance and resistant genes of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of Sichuan pickled cowpea

XU Gu-rong，CAI Ting，LIN Kai，SONG Fei-fei，ZHANG Qing，XIANG Wen-liang*
（College of Food and Bioengineering，Xihua University，Institute of Ancient Brewing，Xihua Uniwersity，Chengdu 610039，China）

The epibiotic lactic acid bacteria（LABs）on the fresh cowpea，which resist to chloramphenicol（CHL）tetracycline（TET）and ampicillin（AMP），were investigated by the physiological and biochemical characteristics，16S rRNA，antibiotic resistance and resistant genes.182 isolates in current study were assigned to Weissella confuse（50.0%），Weissella cibaria（15.4%），Enterococcus sulfurous（7.1%）and Lactococcus lactis subsp.lactis （27.5%），respectively.And 32 isolates（17.6%）were found to be against CHL and TET with one or two resistance，including 6 W.confuse（3.3%）and 4 L.lactis subsp.lactis（2.1%）with resistance to CHL，and 4 W.confuse（2.1%）and 5 L.lactis subsp.lactis（2.7%）with resistance to TET.6 W.confuse（3.2%），2 W.cibaria （1.1%），1 E.sulfurous（0.5%）and 4 L.lactis subsp.lactis（2.1%）with resistances to CHL and TET.In the effux pump genes efrA，efrB，norB，norC，norE and sugE，efrB had the highest detection rate with 31.3%，but efrB and sugE with only 3.1%.Among the TET resistant genes tet（A），tet（B），tet（C），tet（D），tet（H）and tet（L），tet（C）had the highest detection rate，90.9%，and tet（B）was found with 4.5%lowest detection rate.

cowpea；epibiotic lactic acid bacteria；antibiotic resistance；antibiotic resistant genes

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.026

2015－07－02

徐顧榕（1992-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物分子生態(tài)，E-mail：xuluffy@sina.com。

*通訊作者：向文良（1973-），男，博士，教授，研究方向：中國西南地區(qū)特色發(fā)酵食品微生物過程學，E-mail：xwllm7687@sina.com。

國家自然科學基金（31571935）；教育部春暉計劃（Z2014061）；四川省應用基礎（2014JY0045）；四川省教育廳重點（14ZA0110）。