趙 艷，汪泓吉，張鳳枰，楊發(fā)樹，劉耀敏，范秀麗（通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

反相離子對高效液相色譜法測定豬肉中呈味核苷酸

趙 艷，汪泓吉，張鳳枰，楊發(fā)樹，劉耀敏，范秀麗
（通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610041）

建立反相離子對高效液相色譜法測定豬肉中呈味核苷酸5'-尿苷酸二鈉（5'-UMP）、5'-胞苷酸二鈉（5'-CMP）、5'-鳥苷酸二鈉（5'-GMP）、5'-肌苷酸二鈉（5'-IMP）和5'-腺苷酸二鈉（5'-AMP）含量的方法。應(yīng)用ZORBAX SB-C18色譜柱，以0.01 mol/L KH2PO4溶液（含1.45 mmol/L四丁基硫酸氫銨，pH4.0）-乙腈（97∶3，V/V）為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，紫外檢測器在254 nm處進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，5種呈味核苷酸線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.9999，回收率在92.5%～106.0%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.75%～4.26%之間，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP檢出限分別為2.0、2.0、2.0、3.0和3.0 mg/kg。該方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于豬肉中呈味核苷酸含量的測定。

反相離子對高效液相色譜法，豬肉，呈味核苷酸

核苷酸是生物體內(nèi)重要的低分子化合物，具有許多特殊的生理功能。很多食物中都含有一些天然的呈味核苷酸。5'-IMP、5'-GMP、5'-CMP、5'-AMP 和5'-UMP均具有強(qiáng)烈的呈鮮味作用，是已知能產(chǎn)生鮮美可口味道的重要化合物［1］。日本化學(xué)家Konosu等［2］對蟹肉、鮑魚、海膽等的提取物進(jìn)行了分析，認(rèn)為食物的鮮味是在特定的條件下水溶性成分的復(fù)雜組合所產(chǎn)生的綜合效應(yīng)，但是主要的呈味成分是5'-核苷酸（IMP、GMP、AMP）和谷氨酸鈉（MSG）。呈味核苷酸除了自身呈鮮味作用以外，還能與MSG協(xié)同作用，使鮮味明顯地增強(qiáng)［3］，因此，測定食品中的呈味核苷酸含量對研究食品風(fēng)味及呈味物質(zhì)之間的相互關(guān)系有著重要的意義。

目前，呈味核苷酸測定的方法有分光光度法［4-5］、離子交換色譜法［6］、毛細(xì)管電泳法［7］、高效液相色譜法［8-10］、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［11-12］等。反相離子對高效液相色譜法是目前呈味核苷酸分析常用的測定方法，其特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，可用于多種呈味核苷酸的同時(shí)分離檢測，但目前還未見其應(yīng)用于檢測豬肉中五種呈味核苷酸有關(guān)報(bào)道。本文采用離子對反相高效液相色譜法對豬肉中的呈味核苷酸進(jìn)行分離測定，并驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉（肉眼） 通威送檢樣品；5'-CMP（99.95%）、5'-UMP（99.96%） 百靈威公司；5'-GMP（99%）、5'-IMP（98%）、5'-AMP（97%） sigma-Aldrich公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；高氯酸、四丁基硫酸氫銨、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水 為Milli-Q Gradient超純水。

Alliance 2695高效液相色譜儀、2487紫外檢測器、EMPOWER色譜管理系統(tǒng) 美國Waters公司；T10均質(zhì)器 德國IKA公司；Allegra 64 R離心機(jī) BECKMAN COULTER公司；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP224S電子分析天平 德國Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取100 mg 5'-CMP、5'-UMP、5'-GMP、5'-IMP、5'-AMP，加純水定容至100 mL容量瓶，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。將5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-AMP配制成0.2、0.4、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；5'-IMP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為2.0、4.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL。

1.2.2 HPLC分析條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測器：紫外檢測器，波長為254 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。流動(dòng)相：0.01 mol/L KH2PO4（含1.45 mmol/L四丁基硫酸氫銨，K2HPO4調(diào)pH4.0）-乙腈（97∶3，V/V）。

1.2.3 供試樣品溶液的制備 稱取解凍好的豬肉2 g（精確至0.1 mg），置于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入冷的5%高氯酸10 mL，混勻，4℃冰箱放置1 h。取出后，均質(zhì)30 s，勻漿液10000 r/min冷凍離心10 min，收集上清液，所得沉淀再用5%高氯酸提取、以10000 r/min冷凍離心10 min，合并兩次上清液，用3 mol/L KOH溶液調(diào)pH至6.5，超純水定容至50 mL，0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜儀測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

在相同的液相色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液注入液相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，以試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比較定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜分析條件的選擇

2.1.1 色譜柱的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用Waters2695高效液相色譜儀，比較了SymmetryShieldTMC18色譜柱、μBondapakTMNH2柱和ZORBAX SB-C18色譜柱對呈味核苷酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)SymmetryShieldTMC18色譜柱和氨基柱均不能很好的分離5'-GMP、5'-IMP，而使用ZORBAX SB-C18色譜柱（適用于較低pH的流動(dòng)相）取得了良好的分離效果，結(jié)果見圖1～圖3。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

2.1.2.1 離子對試劑的濃度 選用四丁基硫酸氫胺濃度分別為1.30、1.35、1.40、1.45、1.50 mmol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)濃度為1.45 mmol/L時(shí)分離效果最好，峰形對稱，樣品中的核苷酸與雜質(zhì)峰完全分開，且該濃度較低，減小對色譜柱的影響。

圖1 SymmetryShieldTMC18色譜柱分離圖Fig.1 HPLC chromatogram of SymmetryShieldTMC18column

圖2 μBondapakTMNH2柱的分離圖Fig.2 HPLC chromatogram of μBondapakTMNH2column

圖3 ZORBAX SB-C18色譜柱的分離圖Fig.3 HPLC chromatogram of ZORBAX SB-C18column

2.1.2.2 磷酸二氫鉀的用量 選用磷酸二氫鉀濃度分別為0.005、0.01、0.03、0.05 mol/L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著磷酸二氫鉀濃度的增加，保留時(shí)間縮短，分離效果差異不大。但磷酸鹽用量高時(shí)會(huì)導(dǎo)致液相色譜單向閥加速堵塞，影響檢測，而用量低至0.005 mol/L時(shí)保留時(shí)間過長，峰形拖尾，所以選擇磷酸二氫鉀濃度為0.01 mol/L。

2.1.2.3 流動(dòng)相pH的選擇 由于磷酸基與離子對試劑在適合的pH下有較強(qiáng)的作用，可以使分析物得到較好的分離，使用四丁基硫酸氫銨，5種呈味核苷酸能完全分離。核苷酸屬于酸性離子型化合物，在酸性條件下穩(wěn)定，流動(dòng)相的酸堿度決定了被分析物的解離狀態(tài)，從而影響其與離子對的結(jié)合程度。因此，改變流動(dòng)相的pH是改善分離選擇性的有效方法。比較了pH為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)pH越大，出峰時(shí)間越靠后，且IMP和GMP越難分離，而pH為4.0時(shí)，分離效果最好，五種核苷酸能完全分離，又能不受樣品中雜質(zhì)的干擾。本實(shí)驗(yàn)在所選擇的條件下，標(biāo)準(zhǔn)品分離效果見圖4。

表1 呈味核苷酸的回歸方程、檢出限和定量限Table1 Linear regression equation，LOD and LOQ of five flavor nucleotides

表2 精密度實(shí)驗(yàn)（mg/100 g）Table2 Precisions for five flavor nucleotides（mg/100 g）

圖4 呈味核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides

2.2 線性關(guān)系及檢出限的考察

按照上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后進(jìn)行樣品測定，以樣品出峰信號(hào)的3倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限。線性方程、檢出限和定量限見表1。

2.3 方法的精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

為考察方法的精密度，對樣品在相同條件下平行測定6次，結(jié)果見表2。由表2可見，樣品中5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP多次重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.61%、2.00%、1.53%、1.75% 和1.54%，表明該方法測定豬肉的呈味核苷酸，具有較高的精密度，重現(xiàn)性好。

為了研究方法的可靠性，在樣品中分別添加2個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平3個(gè)平行樣，按照1.2.3樣品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照1.2.2儀器條件進(jìn)行測定，回收率結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP的回收率在92.5% ～106.0%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.75%～4.26%之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。

表3 呈味核苷酸的回收率和測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table3 Spike recoveries and relative standard deviations for five flavor nucleotides（n=3）

2.4 豬肉中呈味核苷酸的測定

按照1.2.3樣品溶液制備方法進(jìn)行處理，對豬肉中的呈味核苷酸進(jìn)行了提取，按照1.2.2儀器條件進(jìn)行測定，得到豬肉中呈味核苷酸的HPLC圖譜，見圖5。

圖5 豬肉中呈味核苷酸的色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of five flavor nucleotides in pork

考察物質(zhì)對滋味的貢獻(xiàn)大小不是取決于其含量的高低，而是取決于其呈味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV），即呈味物質(zhì)在樣品中的含量與該化合物的味道閾值之比。如果某物質(zhì)的TAV大于1，則說明該物質(zhì)對滋味有重要貢獻(xiàn)［3］。豬肉中的三種呈味核苷酸含量及其呈味強(qiáng)度值見表4。

由表4可知，豬肉中5'-IMP的含量很高（189 mg/ 100 g），而5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP和5'-AMP含量均較低。從呈味強(qiáng)度值來看，5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP的呈味強(qiáng)度值分別為0.29、7.56和0.16，說明5'-IMP對豬肉的滋味有重要貢獻(xiàn)，而其他四種呈味核苷酸對豬肉的滋味貢獻(xiàn)較小。

表4 豬肉中的呈味核苷酸含量及其呈味強(qiáng)度值（n=6）Table4 Contents and TAVs of five flavor nucleotides in pork（n=6）

3 結(jié)論

利用反相離子對高效液相色譜法測定豬肉中的呈味核苷酸，5'-IMP的線性范圍為2.0～100.0 μg/mL，其他四種呈味核苷酸的線性范圍為0.2～10.0 μg/mL，5種呈味核苷酸的回收率在92.5%～106.0%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.75%～4.26%之間，5'-UMP、5'-CMP、5'-GMP、5'-IMP和5'-AMP檢出限分別為2.0、2.0、2.0、3.0和3.0 mg/kg。所建立的方法簡便快速、重現(xiàn)性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測結(jié)果可信度高，可以滿足豬肉中呈味核苷酸的檢測需要。5'-IMP對豬肉的滋味有重要貢獻(xiàn)。

［1］陳正行，狄濟(jì)樂.食品添加劑新產(chǎn)品與新技術(shù)［M］.江蘇：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

［2］Hayashi T，Yamaguchi K，Konosu S.Sensory analysis of tasteactive components in the extract of boiled snow crab meat［J］.J Food Sci，1981，46（2）：479-483.

［3］Chen D W，Zhang M.Non-volatile taste active compounds in the meat of Chinese mitten crab（Eriocheir sinensis）［J］.Food Chemistry，2007，104：1200-1201.

［4］Acebal C C，Lista A G，F(xiàn)ernández Band B S.Simultaneous determination of flavor enhancers in stock cube samples by using spectrophotometric data and multivariate calibration［J］.Food Chemistry，2008，106（2）：811-815.

［5］徐瑋，譚紅，宋光林，等.紫外光度法測定增鮮味精中呈味核苷酸二鈉的含量［J］.食品工業(yè)科技，2010，31（12）：344-348.

［6］Studzińska S，Rola R，Buszewski B.Determination of nucleotides in infant milk formulas using novel dendrimer ion-exchangers［J］.Journal of Chromatography B，2014，949-950：87-93.

［7］周文峰，袁倬斌.呈味核苷酸的高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離［J］.化學(xué)試劑，2003，25（1）：4-5.

［8］方燕，過世東.棚養(yǎng)和塘養(yǎng)甲魚肌肉中呈味核苷酸的含量變化及比較［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（8）：17-21.

［9］陳麗花，張健，陳培瓊，等.反相高效液相色譜法測定中國對蝦肉中呈味核苷酸［J］.食品科學(xué)，2009，30（10）：215-218.

［10］曹偉，許曉曦.HPLC測定不同熱處理方式對鏡鯉魚中呈味核苷酸的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（3）：136-137（203）.

［11］鄒耀洪.香菇中5'-核苷酸的高效液相色譜-質(zhì)譜分析［J］.食品科學(xué)，2005，26（1）：196-198.

［12］Yamaoka N，Kudo Y，Inazawa K，et al.Simultaneous determination of nucleosides and nucleotides in dietary foods and beverages using ion-pairing liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2010，878（23）：2054-2060.

Determination of five flavor nucleotides in pork by ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography

ZHAO Yan，WANG Hong-ji，ZHANG Feng-ping，YANG Fa-shu，LIU Yao-min，F(xiàn)AN Xiu-li
（Key Laboratory of Aquatic，Livestock，Poultry Nutrition and Healthy Culturing，Ministory of Agriculture，Tongwei Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China）

A method was established for the determination of five flavor nucleotides in pork by ion-pair reversedphase high performance liquid chromatography.Separation and quantification was achieved by using a ZORBAX SB-C18column，and a mobile phase of 0.01 mol/L KH2PO4solution（contain 1.45 mmol/L tetrabutylammonium hydrogen sulfate，pH4.0）-acetonitrile（97∶3，V/V）were used.The detection wavelength was 254 nm.The external standard calibration curves were used for quantification.There were good linear correlations for five flavor nucleotides（R2＞0.9999）.Average spike recovery of five flavor nucleotides was 92.5%～106.0%，with relative standard deviations 1.75%～4.26%，the limit of detection for 5'-UMP，5'-CMP，5'-GMP，5'-IMP and 5'-AMP being 2.0，2.0，2.0，3.0 and 3.0 mg/kg，respectively.This method was simple，sensitive，reproducible and suitable for the determination of flavor nucleotides in pork.

ion-pair reversed-phase high performance liquid chromatography；pork；flavor nucleotides

TS251.7

A

1002-0306（2016）02-0064-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.004

2015-05-06

趙艷（1983-），女，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：水產(chǎn)品營養(yǎng)評價(jià)和食品及飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測，E-mail：zhao518yan@163.com。

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011NZ0071）。