王　騰,　閔凡祥,　郭　梅,　楊　帥,高云飛,　金光輝*,　馬　爽

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院,大慶　163319; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所,哈爾濱　150086)

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黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型及對甲霜靈敏感性測定

王騰1,閔凡祥2,郭梅2,楊帥2,高云飛2,金光輝1*,馬爽1

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院,大慶163319; 2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所,哈爾濱150086)

馬鈴薯晚疫病(late blight)是由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的馬鈴薯生產(chǎn)中最具毀滅性的病害,明確晚疫病菌的交配型及對甲霜靈敏感性狀況對制定馬鈴薯晚疫病防治策略具有重要意義。本研究對2011—2013年采自黑龍江省黑河、齊齊哈爾、綏化等馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫病菌菌株進行交配型及對甲霜靈敏感性測定,采用對峙培養(yǎng)法對153株晚疫病菌進行交配型檢測,結(jié)果表明,A1交配型79株,占51.63%,A2交配型74株,占48.37%;采用菌落直徑法對143株晚疫病菌進行甲霜靈敏感性測定，結(jié)果表明,83.92%表現(xiàn)高抗,8.39%表現(xiàn)中抗,7.69%表現(xiàn)敏感。

馬鈴薯;晚疫病菌;交配型;甲霜靈

馬鈴薯晚疫病(late blight)是由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的馬鈴薯生產(chǎn)中最具毀滅性的病害,目前在我國各地均有發(fā)生[1],尤其在我國中部和北部發(fā)生較普遍。在我國因晚疫病引起的產(chǎn)量損失每年平均達到10億美元左右[2]。

晚疫病存在A1、A2兩種交配型,兩者可通過異宗配合進行有性生殖產(chǎn)生卵孢子。卵孢子的抗逆性及適應(yīng)力更強,能在土壤中越冬,成為次年的初侵染源,而且在有性生殖的過程中會發(fā)生基因重組,導(dǎo)致生理小種變異加快,生理小種組成會日趨復(fù)雜。在我國,1996年張志銘等[3]首次報道了在內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)A2交配型,之后在我國各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)陸續(xù)報道了A2交配型的存在[4-7]。黑龍江省自2004年以來,朱小瓊等[8]、金光輝等[9-10]、張鉉哲與徐生軍[11]、閔凡祥等[12]先后對黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌進行了交配型的研究,均未發(fā)現(xiàn)黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌存在A2交配型。

甲霜靈(metalaxyl)為苯基酰胺類殺菌劑,是防治晚疫病的有效藥劑之一,于 1977 年在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用,該類藥劑對馬鈴薯晚疫病有很好防效,具有保護兼治療的作用[13]。但其連續(xù)施用多年后, 病原菌即產(chǎn)生抗藥性[14]。在國內(nèi)李煒等[15]最先報道了1994 年采自河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅等地的馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性情況,隨后朱杰華[16]、楊志輝等[17]、袁善奎等[18]、孫秀梅等[19]、徐生軍等[20]、王文橋等[21]先后進行了黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈類藥劑敏感性的研究,所有研究結(jié)果均表明在黑龍江省甲霜靈高抗菌株已普遍存在。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上繼續(xù)對黑龍江省晚疫病菌的交配型及甲霜靈敏感性進行檢測研究,以明確黑龍江省晚疫病的交配型及對甲霜靈敏感性狀況,為今后晚疫病防治提供理論依據(jù)。

1　材料及方法

1.1供試材料

供試菌株為2011—2013年采自黑龍江省黑河、綏化、齊齊哈爾等馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的晚疫病菌株,經(jīng)分離純化后保存在黑麥培養(yǎng)基斜面上。A1 交配型標準菌株來自北京，A2 交配型標準菌株來自荷蘭,均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。藥劑為98%甲霜靈原藥,由先正達公司生產(chǎn)。

1.2試驗方法

1.2.1交配型測定

采用對峙培養(yǎng)技術(shù)鑒定各菌株的交配型。將標準菌株和待測菌株分別預(yù)培養(yǎng),然后取待測菌株的菌絲塊單獨培養(yǎng),并分別與A2、A1標準菌株對峙培養(yǎng),菌絲塊之間距離1.5 cm;每個菌株3次重復(fù)(圖1a)。在18℃黑暗條件下培養(yǎng)2周后,在顯微鏡下觀察各待測菌株單獨培養(yǎng)的菌落及與標準菌株對峙培養(yǎng)的菌落交界處是否產(chǎn)生卵孢子(圖1b)。若單獨培養(yǎng)和與A2配對時不產(chǎn)生卵孢子,與A1配對時產(chǎn)生卵孢子,說明該菌株為A2交配型;反之,則為A1交配型;若待測菌株與兩個標準菌株對峙培養(yǎng)時均有卵孢子產(chǎn)生,且單獨培養(yǎng)也能產(chǎn)生卵孢子,說明該菌株自交可育。

1.2.2甲霜靈敏感性測定

采用菌落直徑法。將98%的甲霜靈原藥用滅菌的二甲基亞砜稀釋成母液,取定量的母液與定量的黑麥培養(yǎng)基混勻,使培養(yǎng)基含甲霜靈質(zhì)量濃度為0.0、5.0、100 μg/mL。將培養(yǎng)基迅速倒入培養(yǎng)皿(d=90 mm)中,對照中加入等量的二甲基亞砜,每個處理3個重復(fù)。待培養(yǎng)基凝固后在每個培養(yǎng)皿中接種直徑為5 mm的菌盤。18℃黑暗培養(yǎng)8～10 d,待對照菌落直徑至少為50 mm時,采用十字交叉法測量菌落直徑,根據(jù)含藥平板菌落直徑與空白對照平板菌落直徑的比值測定待測菌株的甲霜靈敏感性(圖2)。

圖1　馬鈴薯晚疫病菌交配型測定Fig.1　Mating type determination of Phytophthora infestans

圖2　馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈敏感性測定Fig.2　Metalaxyl sensitivity test of Phytophthora infestans

參照Oyarzun 等[22]的方法,根據(jù)菌落直徑劃分晚疫病菌對甲霜靈的敏感性和抗性等級。具體劃分標準如下:

敏感:d5/dck≤0.4;中抗:d100/dck≤0.4 0.4。

dck:CK菌落直徑;d5:含藥5 μg/mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌的菌落直徑;d100:含藥100 μg/mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌的菌落直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1交配型的測定

對2011—2013年采集的153株馬鈴薯晚疫病菌菌株進行交配型的測定,結(jié)果(表1)顯示: 153株晚疫病菌中A1交配型79株,占總菌株數(shù)的51.63%,A2交配型74株,占總菌株數(shù)的48.37%。未發(fā)現(xiàn)自育型及其他類型菌株。由各地區(qū)交配型總體情況看,各地區(qū)均發(fā)現(xiàn)有A2交配型。說明A1交配型已不是優(yōu)勢病菌群體。由年際間A2交配型情況看,2011年A2交配型占25.93%,2012年A2交配型占79.31%,2013年A2交配型占34.15%;A2交配型所占比例在3年間呈現(xiàn)由少變多又變少的現(xiàn)象。同樣,黑河、齊齊哈爾、綏化3地A2交配型在3年間所占比例也均出現(xiàn)此現(xiàn)象。

表1　2011-2013年黑龍江不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌交配型Table 1　Mating type of Phytophthora infestans in different regions of Heilongjiang Province in 2011-2013

2.2對甲霜靈敏感性測定

對2011—2013年采集的143株馬鈴薯晚疫病菌菌株進行甲霜靈敏感性測定結(jié)果表明: 143株晚疫病菌菌株中,83.92%表現(xiàn)高抗,8.39%表現(xiàn)中抗,7.69%表現(xiàn)敏感?？傮w來看,2011年敏感菌株占13.43%,抗性菌株占86.57%,2012年敏感菌株占5.56%,抗性菌株占94.44%,2013年未發(fā)現(xiàn)敏感菌株,抗性菌株占100%;晚疫病菌在3年內(nèi)對甲霜靈敏感性表現(xiàn)為敏感菌株逐漸減少，抗性菌株不斷增多的現(xiàn)象;但各地區(qū)晚疫病菌在3年內(nèi)對甲霜靈敏感性表現(xiàn)并不相同,說明各地區(qū)間施藥習慣存在差異。

表2　2011-2013年黑龍江省不同地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的敏感性Table 2　Sensitivity of Phytophthora infestans to metalaxyl in different regions of Heilongjiang Province in 2011-2013

3　結(jié)論與討論

自1996年張志銘等[3]首次報道了在我國內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)A2交配型后,黑龍江省學(xué)者也對晚疫病菌交配型進行了多次報道。2004年,朱小瓊等[8]測定了2000-2002年采自四川、重慶、吉林、黑龍江、福建、北京6省市的74株馬鈴薯晚疫病菌的交配型,其中黑龍江未發(fā)現(xiàn)A2交配型;2006年,金光輝等[9]測定黑龍江省8個市縣的109個菌株的晚疫病菌交配型,結(jié)果表明109個菌株均為A1交配型,未發(fā)現(xiàn)A2交配型;2010年,張鉉哲與徐生軍[11]檢測黑龍江與吉林晚疫病菌交配型,結(jié)果顯示黑龍江地區(qū)未發(fā)現(xiàn)A2交配型;2010年,閔凡祥等[12]對2004-2009年采集的124株晚疫病菌進行交配型測定,未發(fā)現(xiàn)A2交配型。這些報道顯示2010年之前黑龍江省未發(fā)現(xiàn)A2交配型,但金光輝通過對晚疫病生理小種的研究推測克山縣可能存在A2交配型[10];本研究首次證實了在黑龍江省各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均已存在A2交配型。

有關(guān)黑龍江省晚疫病菌對甲霜靈敏感性研究開展較早,甲霜靈高抗菌株在黑龍江省已普遍存在[15-21],但各地區(qū)間因施藥習慣不同,抗性菌株出現(xiàn)頻率存在差異;本研究對2011—2013年晚疫病菌總體研究表明,2013年黑龍江省晚疫病菌對甲霜靈具有抗藥性的菌株出現(xiàn)頻率自北向南呈逐步增加的趨勢,這與孫秀梅等[19]2009年的研究結(jié)果一致,但2011年與2012年的晚疫病菌并未出現(xiàn)此種趨勢,年際間晚疫病菌抗藥性頻率存在差異。

本研究通過對黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型研究發(fā)現(xiàn),黑龍江省黑河、齊齊哈爾、綏化等地區(qū)均已發(fā)現(xiàn)A2交配型,A1交配型已不是優(yōu)勢病菌群體。今后工作重點應(yīng)是加強馬鈴薯抗晚疫病育種的研究,盡快篩選出對晚疫病菌具有持久水平抗性的材料。這樣即使出現(xiàn)了A2 交配型, 也不至于因為生理小種的變異而造成品種抗性的快速喪失。通過對黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈敏感性的測定發(fā)現(xiàn),黑龍江省黑河、齊齊哈爾、綏化等地區(qū)的晚疫病甲霜靈抗性菌株均在80%以上,且呈現(xiàn)逐年增加的現(xiàn)象。因此今后不宜繼續(xù)使用苯基酰胺類殺菌劑防治馬鈴薯晚疫病,應(yīng)改用其他類型殺菌劑,并注意不同類型殺菌劑交替及混合使用,避免使用單一殺菌劑產(chǎn)生抗藥性。

[1]宋伯符, 謝開云. CIP 的全球晚疫病防治倡議與我國的參與[J]. 中國馬鈴薯, 1997, 11(1): 51-55.

[2]宋伯符, 王軍, 張志銘, 等. 我國馬鈴薯晚疫病研究的進展和建議[J]. 馬鈴薯雜志, 1996, 10(3): 138-141.

[3]張志銘,王軍.中國發(fā)生馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)A2交配型[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1996,19(4):62-65.

[4]趙志堅, 何云昆, 李成云, 等.云南省發(fā)現(xiàn)馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)A2交配型[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1999, 12(3): 1-3.

[5]Ryu K Y, Luo Wenfu, Yang Yanli, et al. Mating type, fungicide sensitivity and physiological race ofPhytophthorainfestanscollected from Yunnan Province [J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2003, 33(2): 126-131.

[6]張志銘,朱杰華,宋伯符,等.中國馬鈴薯晚疫病菌A2交配型的進一步研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,24(2):32-37.

[7]惠娜娜,李繼平, 李青青, 等.甘肅馬鈴薯晚疫病病菌交配型及對甲霜靈的敏感性[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技, 2010(10): 8-10.

[8]朱小瓊, 車興璧, 王曉鳴, 等. 六省市致病疫霉交配型及其對幾種殺菌劑的敏感性[J]. 植物保護, 2004, 30(4): 20-23.

[9]金光輝, 白雅梅, 孫秀梅, 等. 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌A2交配型的測定[J]. 中國馬鈴薯, 2006, 20(4): 212-214.

[10]金光輝, 袁善奎, 呂文河, 等. 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌生理小種類型及交配型研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 37(5): 610-614.

[11]張鉉哲, 徐生軍. 黑龍江省和吉林省馬鈴薯晚疫病菌multi-locus基因型分析[J]. 中國馬鈴薯, 2010, 24(2): 97-102.

[12]閔凡祥, 王曉丹, 胡林雙, 等. 黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型的研究[J]. 中國馬鈴薯, 2010, 24(1): 47-49.

[13]Gisi U, Cohen Y. Resistance to phenylamide fungicides: a case study withPhytophthorainfestansinvolving mating type and race structure [J].Annual Review Phytopathology,1996,34:549-572.

[14]畢朝位, 杜喜翠, 車興璧, 等. 重慶地區(qū)馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)對甲霜靈抗性及抗性水平測定[J]. 中國馬鈴薯, 2002, 16(2): 70-73.

[15]李煒, 張志銘, 樊慕貞. 馬鈴薯晚疫病菌對瑞毒霉抗性的測定[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1998, 21(2): 53-60.

[16]朱杰華. 中國馬鈴薯晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2004.

[17]楊志輝, 桂秀梅, 朱杰華, 等. 馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性及與霜脲氰和霜霉威交互抗藥性的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2008, 24(5): 335-338.

[18]袁善奎, 趙志華, 劉西莉, 等. 馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈和霜脲氰的敏感性檢測[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報, 2005, 7(3): 237-241.

[19]孫秀梅,馬顏亮,白雅梅,等.黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈藥劑的敏感性測定[J].中國馬鈴薯,2009,23(2):72-74.

[20]徐生軍,姚亮亮, 李新新, 等. 黑龍江省和吉林省馬鈴薯晚疫病菌對氟啶胺和甲霜靈的敏感性變化[J]. 植物保護, 2009, 35(5): 80-85.

[21]王文橋, 王麗, 韓秀英, 等. 北方五省(區(qū))馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈和精甲霜靈的敏感性檢測[J]. 植物保護, 2012, 38(3): 116-121.

[22]Oyarzun P J, Pozo A, Ordnez M E, et al. Host specificity ofPhytophthorainfestanson tomato and potato in Ecuador [J]. Phytopathology, 1998, 88(3): 265-271.

(責任編輯：王音)

Mating type and metalaxyl sensitivity test ofPhytophthorainfestansin Heilongjiang Province

Wang Teng1,Min Fanxiang2,Guo Mei2,Yang Shuai2,Gao Yunfei2,Jin Guanghui1,Ma Shuang1

(1. Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing163319, China; 2. Institute of Plant Virus-free Seedlings, Heilongjiang Provincial Academy of Agricultural Sciences, Harbin150086, China)

Potato late blight caused byPhytophthorainfestansis the most devastating disease in potato production. It is of great importance to clear the mating type ofP.infestansand metalaxyl sensitivity for prevention and control of potato late blight. In this study, we measured the mating type and metalaxyl sensitivity ofP.infestansstrains collected from Heihe, Qiqihar, Suihua and other main potato producing area in Heilongjiang Province during 2011-2013.Mating type determination by dual culture method demonstrated that, among 153 strains, 79 strains were A1 mating type, accounting for 51.63%; 74 strains were A2 mating type, accounting for 48.37%. Metalaxyl sensitivity test by colony diameter method showed that 83.92% were highly resistant among all the 143 tested strains, 8.39% were moderate resistant and 7.69% were sensitive.

potato;Phytophthorainfestans;mating type;metalaxyl

2014-12-29

2015-02-05

科技部國際合作項目(2014DFG32260)；國家科技支撐計劃項目(2012BAD06B02)

E-mail:ghjin1122@163.com

S 435.32

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.033