劉丹鳳,　李　沛,　弓少龍,　安興奎,　劉玉娣,　侯茂林

(植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 北京　100193)

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溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對南方水稻黑條矮縮病毒介體獲毒率的影響

劉丹鳳,李沛,弓少龍,安興奎,劉玉娣,侯茂林*

(植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所, 北京100193)

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是由白背飛虱(Sogatella furcifera)傳播的一種新病毒。為明確白背飛虱獲毒的影響因子及南方水稻黑條矮縮病的流行規(guī)律,本文采用三因素試驗,研究溫度(22、27和32℃)、水稻生育期(三葉期、分蘗期和孕穗期)和白背飛虱若蟲齡期(3齡和5齡)對白背飛虱獲毒效率的影響。結果表明,白背飛虱在27℃和32℃下的獲毒率顯著高于22℃下的獲毒率;在不同生育期水稻上,白背飛虱在分蘗期水稻上的獲毒率高于三葉期和孕穗期;白背飛虱若蟲齡期也顯著影響獲毒率,3齡若蟲獲毒率高于5齡若蟲;但這些因素的交互作用對白背飛虱的獲毒率無顯著影響。

白背飛虱;SRBSDV;水稻;病毒傳播;溫度;介體昆蟲

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是2001年被發(fā)現(xiàn)，2008年被命名的呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)的一個新種[1]。該病毒病害已在越南及我國廣大稻區(qū)大發(fā)生,并蔓延至東南亞、日本、韓國等地[2-4]。白背飛虱[Sogatella furcifera(Horváth)]是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠傳播SRBSDV的介體[3]。傳毒介體的獲毒率和傳毒率決定著植物病毒的傳播,而介體成功獲毒是病毒傳播的前提。

溫度影響病毒的傳播是許多蟲傳病毒的共同特征。傳播水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)的灰飛虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]在17～33℃下獲毒率隨溫度升高而降低[5];傳播Cabbage mosaic virus的桃蚜[Myzus persicae(Sulzer)]在16～27℃下獲毒率較高,高于或低于此溫度范圍獲毒率均降低[6];尖音庫蚊(Culex pipiensLinnaeus)在18～30℃時對西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)的獲毒率隨溫度的升高而升高[7]。溫度對介體昆蟲獲毒率的影響,一方面是由于溫度升高增強昆蟲自身酶活性,從而使病毒降解[5],另一方面是溫度影響病毒粒子在傳毒介體內(nèi)的復制增殖,使病毒在昆蟲介體內(nèi)的循回期發(fā)生變化,從而影響介體的獲毒率[7-8]。如對馬德里約柯托病毒(Mal de Río Cuarto virus,MRCV)，同一齡期的庫氏德飛虱(Delphacodes kuscheliFennah)若蟲獲毒率隨循回期的延長而升高[9]。白背飛虱以循回增殖的方式傳播SRBSDV,循回期為6～14d[3],在26℃時循回期較短,溫度過高過低循回期均延長[8]。

寄主植物對病毒的傳播也存在影響。SRBSDV可侵染水稻、玉米及多種禾本科雜草,但以水稻的受侵染率較高[10]。不同水稻品種對SRBSDV也表現(xiàn)出不同的抗性[10-11]。寄主植物及其品種所含可溶性糖和和氨基酸種類不同,植物的表皮結構及維管束細胞壁等結構也存在差異[12-13],這些因素影響介體昆蟲的刺探、取食等行為,進而影響植物病毒的傳播。白背飛虱對SRBSDV的傳毒率隨水稻生育期而異,對三葉一心期稻苗的傳毒率高于其他生育期[8]。但水稻生育期是否影響白背飛虱對SRBSDV的獲毒率尚不清楚。

植物病毒的傳播還與介體昆蟲的蟲態(tài)或齡期有關。白背飛虱日均取食量隨發(fā)育階段而異,成蟲取食量大于若蟲,若蟲取食量又隨齡期的增加而增大[14]。白背飛虱飼毒24h后,若蟲對SRBSDV的獲毒率高于成蟲[3],白背飛虱成蟲的獲毒率隨飼毒時間的延長而升高[2]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)刺吸次數(shù)和刺吸持續(xù)時間對白背飛虱能否獲毒存在影響,成功獲毒的白背飛虱刺吸持續(xù)時間顯著長于未獲毒的個體[15]。黑面葉蟬[Graminella nigrifrons(Forbes)]若蟲對玉米細條紋病毒(Maize fine streak virus,MFSV)的獲毒率高于成蟲[16],而傳播番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV)的西花薊馬[Frankliniella occidentalis(Pergande)]僅能在1齡時獲毒[17]。白背飛虱若蟲齡期對其獲毒率的影響還未見報道。

本文采用多因素試驗,測定溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對白背飛虱傳播SRBSDV的獲毒率的影響,以便進一步明確SRBSDV的流行規(guī)律,為田間南方水稻黑條矮縮病的防控提供指導。

1　材料與方法

1.1供試蟲源和稻株

帶毒稻株獲取：初始帶毒稻苗于2014年5月在云南芒市田間采集。采用盆栽感蟲水稻品種‘臺中1號’(‘TN1’)作為供試稻株。將帶毒稻苗上孵化并發(fā)育至3～5齡的白背飛虱若蟲轉移到盆栽二葉一心期(10日齡)、不帶毒的‘TN1’稻苗上置于人工氣候箱中，(27±1)℃下飼養(yǎng)5d后除去白背飛虱,并將稻苗移栽至溫室，(30±5)℃下繼續(xù)培養(yǎng),發(fā)育至相應生育期的帶毒稻苗作為供試稻株,采用一步法RT-PCR檢測稻苗帶毒狀況。

不帶毒白背飛虱若蟲獲取：將溫室盆栽、處于分蘗期的不帶毒水稻單株轉移到含有營養(yǎng)液的玻璃管內(nèi),每管接入室內(nèi)飼養(yǎng)不帶毒白背飛虱雌雄成蟲4對,置于(27±1)℃人工氣候箱內(nèi)的防蟲籠(80目,50×50×50cm)中飼養(yǎng)。待有產(chǎn)卵痕出現(xiàn)時,將白背飛虱雌蟲轉移至未被白背飛虱取食過的新稻苗上,每天轉移1次。原稻苗繼續(xù)在人工氣候箱中培養(yǎng),孵化的白背飛虱若蟲發(fā)育到3齡和5齡時作為供試昆蟲。

1.2SRBSDV檢測方法

采用一步法RT-PCR檢測稻苗和白背飛虱若蟲是否攜帶SRBSDV[17-18]。按照RNAisoPlus[TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.,Ltd]說明書提取RNA,采用SRBSDVS10(GenBank:EU523360)引物F(5′-CGCGTCATCTCAAACTACAG-3′)和R(5′-TTTGTCAGCATCTAAAGCGC-3′)[18],對所提取的RNA進行RT-PCR,瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)682bp目的條帶者視為帶毒。

1.3試驗設計

本試驗旨在測定溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對白背飛虱若蟲獲毒率的影響。試驗設置3種溫度:22、27、32℃(分別模擬春季、夏初和夏季溫度);3種水稻生育期:三葉期(30日齡)、分蘗期(45日齡)、孕穗期(65日齡);2種白背飛虱若蟲齡期:3齡(7日齡)、5齡(12日齡)。共組合為18種處理。

將不帶毒白背飛虱若蟲饑餓飼水3h[8]后,采用Parafilm(石蠟膜)小袋(4.5cm×4.5cm)將白背飛虱單頭接于盆栽帶毒稻苗的稻莖上,將小袋撐開以保證白背飛虱有充足的取食活動空間,隨后將帶蟲的稻苗隨機分配到不同溫度的人工氣候箱中,飼毒24h后,將白背飛虱若蟲單頭轉移到同一人工氣候箱中的不帶毒3葉期稻苗上。將稻苗單株置于含有15mL營養(yǎng)液的玻璃管(d=2cm,h=15cm)中,在離水稻根部約4cm處用海綿固定稻苗,玻璃管管口以海綿封口,適時補充營養(yǎng)液。15d后收集各處理白背飛虱,用液氮冷凍后保存在-80℃冰箱中,用于帶毒狀況檢測。每處理每次接蟲15頭,重復4次。計算每次處理的獲毒率,即取食帶毒稻苗的白背飛虱經(jīng)過循回期后的帶毒個體數(shù)占飼毒個體總數(shù)的比例。

1.4數(shù)據(jù)分析

白背飛虱獲毒率數(shù)據(jù)經(jīng)平方根反正弦轉換后,采用FACTORIALANOVA(SAS9.2)分析溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對白背飛虱獲毒率的影響,運用Tukey’sHSD多重比較法確定各水平間的差異顯著性。

2　結果與分析

在溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期的組合試驗中,白背飛虱若蟲取食帶SRBSDV水稻24h后的獲毒率介于4.6%～48.7%。溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對白背飛虱若蟲的獲毒率均存在顯著影響(溫度F=3.60,df=2,88,P=0.032 3;水稻生育期F=8.54,df=2,88,P=0.000 5;白背飛虱若蟲齡期F=9.97,df=1,89,P=0.002 3),溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期之間的交互作用對白背飛虱若蟲獲毒率均沒有顯著影響(F<1.80,P>0.171 9;圖1a)。

在不同溫度(22、27、32℃)下,白背飛虱若蟲獲毒率在22℃最低(15.4%),顯著低于32℃下的獲毒率(P=0.0323);22與27℃、27與32℃下的獲毒率之間沒有顯著差異(P>0.109;圖1b)。在不同生育期(三葉期、分蘗期、孕穗期)水稻上,白背飛虱若蟲在分蘗期稻苗上的獲毒率最高(32.2%),顯著高于其在三葉期和孕穗期稻苗上的獲毒率(P<0.05),而在三葉期與孕穗期稻苗上的獲毒率之間沒有顯著差異(P=0.319;圖1c)。從白背飛虱若蟲齡期之間來看,3齡若蟲的獲毒率(28.8%)高于5齡若蟲(16.5%)(圖1d)。

圖1　溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期對白背飛虱若蟲取食感染SRBSDV稻苗24 h后的獲毒率的影響Fig.1　Virus acquisition rate by WBPH nymphs (3rd and 5th instars)from infected rice plants at different stages under varying temperatures

3　討論

本試驗中,白背飛虱在27℃和32℃下的獲毒率均高于22℃。這與尖音庫蚊對西尼羅河病毒的獲毒情況[7]、玉米縊管蚜[Rhopalosiphum padi]對大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV)的獲毒情況[20]類似,即在較高溫度下獲毒率高;與香蕉交脈蚜[Pentalonia nigronervosa(Coquerel)]對香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的獲毒情況[21-22]、桃蚜對Cabbage mosaic virus的獲毒情況[6]不同,這些介體昆蟲的獲毒率隨溫度升高先升高后降低。介體昆蟲獲毒率隨溫度變化呈現(xiàn)出不同變化規(guī)律的現(xiàn)象可能是由于介體昆蟲適宜生存的溫度范圍不同,溫度的變化影響昆蟲的生長發(fā)育,進而影響病毒粒子在介體昆蟲體內(nèi)的復制增殖,使不同溫度下的介體表現(xiàn)出不同的獲毒率。白背飛虱若蟲的適宜生長溫度為25～30℃,高于或低于此溫度范圍均不利于若蟲的生長[23]。白背飛虱在27℃和32℃時具有較高的獲毒率,這可能是因為這些溫度下病毒易于侵染白背飛虱,完成侵染循環(huán)。隨著全球氣候變暖的加劇,SRBSDV的傳播能力或許更強,南方水稻黑條矮縮病在已發(fā)病地區(qū)的病情可能加重,其發(fā)病區(qū)域也可能向北擴展。

水稻生育期亦影響白背飛虱的獲毒率。白背飛虱在帶毒的分蘗期稻苗上取食24h后的獲毒率顯著高于三葉期和孕穗期稻苗,在孕穗期稻苗上取食的白背飛虱獲毒率最低。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能與不同生育期稻苗的營養(yǎng)狀況有關,也可能與稻苗中病毒粒子的含量變化有關。分蘗期稻苗能夠為白背飛虱提供較好的營養(yǎng)條件,而孕穗期稻苗為白背飛虱提供的營養(yǎng)較分蘗期和三葉期稻苗差,不適于白背飛虱生長發(fā)育[24]。稻苗被SRBSDV侵染后,mRNA表達水平在第20天高于第14天,第30天有所下降,第40天上升至最高水平,第50天與第40天持平[25],這說明稻苗內(nèi)的病毒量隨時間而變化。取食接毒后不同時間的稻苗時,白背飛虱獲得的病毒量可能不同,導致白背飛虱表現(xiàn)出不同的獲毒率,這需要進一步經(jīng)RT-qPCR測定病毒粒子滴度進行驗證。

白背飛虱3齡若蟲獲毒率顯著高于5齡若蟲。傳播MRCV的庫氏德飛虱1齡若蟲的獲毒率高于3齡若蟲[9],作者推測不同齡期若蟲獲毒能力的差異與若蟲抗病毒侵染的生理狀態(tài)有關,高齡若蟲合成天然免疫因子的脂肪體發(fā)育較成熟,因此抗病毒侵染的能力也較強。西花薊馬只能在1齡時獲毒TSWV,其他齡期均不能獲毒,這種現(xiàn)象可能與西花薊馬不同齡期內(nèi)部結構發(fā)育有關[17]。灰飛虱之所以不能成為SRBSDV的傳播介體是因為病毒粒子不能穿越灰飛虱的中腸屏障完成侵染循環(huán),而病毒粒子在白背飛虱體內(nèi)能夠穿越屏障到達唾液腺[26]。本研究中5齡若蟲的獲毒率低于3齡若蟲,可能是因為5齡若蟲中腸屏障與唾液腺屏障距離較3齡若蟲長,不利于SRBSDV粒子成功完成侵染循環(huán)。

同時本研究還表明,溫度、水稻生育期和白背飛虱若蟲齡期之間的交互作用均不影響白背飛虱的獲毒率,這與香蕉束頂病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的傳播不受溫度和介體發(fā)育階段交互作用影響的結論相近[21]。這表明,田間白背飛虱傳播SRBSDV雖然受到多種因素(如溫度、水稻生育期、白背飛虱蟲態(tài))的共同作用,但是白背飛虱的獲毒率僅隨單個因素的影響而變化。

由此看來,適度高溫能夠提高白背飛虱的獲毒率,白背飛虱在帶毒分蘗期稻苗上的獲毒率較高,低齡白背飛虱若蟲更易于獲毒,同時白背飛虱的獲毒率僅隨單個因素的影響而變化。

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(責任編輯：楊明麗)

Effectsoftemperature,ricegrowthstagesandnymphinstarontheacquisitionrateofSouthern rice black-streaked dwarf virusbySogatella furcifera

LiuDanfeng,LiPei,GongShaolong,AnXingkui,LiuYudi,HouMaolin

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Southern rice black-streaked dwarf virus (SRBSDV)isanewlydiscoveredvirustransmittedbythewhite-backedplanthopper, Sogatella furcifera (WBPH).ToelucidatetheepidemiologyofSRBSDVandthefactorsinfluencingitsacquisitionratebyWBPH,a3×3×2factorialexperimentwasconductedtoinvestigatetheeffectsoftemperature(22, 27and32℃),ricegrowthstages(three-leafstage,tilleringstageandbootingstage)anddifferentinstarnymphs(3rdand5th)onthevirusacquisitionrateofWBPH.Theresultsshowedthatthevirusacquisitionratewashigherat27℃and32℃thanthatat22℃,andhigherattilleringstagethanatothergrowthstages.The3rdinstarnymphshavehighervirusacquisitionratethanthe5thinstars.Theinteractionsbetweentemperature,ricegrowthstagesandvectorstadiumshowednosignificantinfluenceonthevirusacquisitionrate.

Sogatella furcifera;SRBSDV;rice;virusacquisition;temperature;vectorinsect

2014-12-15

2014-12-31

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2010CB951503)

E-mail:mlhou@ippcaas.cn

S435.112,S435.111

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.023