安久棟,　國立耘,　朱小瓊,　宋月鳳

(中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 北京　100193)

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長期施藥果園中的蘋果輪紋病菌對戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性

安久棟,國立耘*,朱小瓊,宋月鳳

(中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院, 北京100193)

為了監(jiān)測果園中蘋果輪紋病菌對戊唑醇和甲基硫菌靈敏感水平的變化,采用菌絲生長速率法測定了采集自山東煙臺地區(qū)和北京市昌平區(qū)，有較長施藥史蘋果園中的蘋果輪紋病菌對戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果表明:戊唑醇對連續(xù)施用戊唑醇5年、每年施藥1～2次的果園中蘋果輪紋病菌的EC50為0.017 4～0.114 3 μg/mL,即該類果園中蘋果輪紋病菌對此藥的敏感性仍然保持在較高水平,與野生菌株的敏感性非常接近,沒有出現(xiàn)敏感性分化的抗藥亞群體;甲基硫菌靈對連續(xù)施用甲基硫菌靈10年、每年施藥2次的果園中蘋果輪紋病菌的EC50為0.846 4～4.677 4 μg/mL,果園中蘋果輪紋病菌與野生菌株相比EC50平均值約上升3.15倍,最低值和最高值分別是已報道敏感性基線的1.19倍和6.59倍,沒有出現(xiàn)敏感性發(fā)生顯著分化的抗藥性亞群體。

蘋果輪紋病菌;戊唑醇;甲基硫菌靈;敏感性

蘋果輪紋病分布廣泛,在我國各蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,且有逐年加重的趨勢[1]。該病是由Botryosphaeriadothidea引起的真菌病害[2],主要危害果實和枝干,在果實貯藏期仍可致病,不僅造成樹勢衰弱、枝干枯死,而且造成大量爛果[3],是制約蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的最為重要的病害之一。

目前,化學防治仍是治理蘋果輪紋病的主要措施,其中戊唑醇和甲基硫菌靈是主要推廣使用的藥劑。戊唑醇通過抑制麥角甾醇的生物合成而干擾真菌細胞膜的形成[4],具有廣譜、內(nèi)吸等特點,對蘋果輪紋病具有良好的防治效果[5]。該藥自20世紀90年代中期開始在中國蘋果樹上登記使用,由于當時戊唑醇原藥和制劑價格偏高,登記后的十幾年中在蘋果生產(chǎn)中沒有得到廣泛的推廣應用。進入21世紀后,戊唑醇首先在山東東部蘋果產(chǎn)區(qū)迅速推廣應用[6],室內(nèi)抗藥性風險評估認為蘋果輪紋病菌對戊唑醇的室內(nèi)抗藥性具有高度至中等風險[7],因此對田間病菌敏感性進行及時監(jiān)測十分重要。

以甲基硫菌靈為代表的苯并咪唑類藥劑也是防治蘋果輪紋病的高效內(nèi)吸性殺菌劑。該藥被植物體吸收后,經(jīng)過一系列生化反應最終被分解為多菌靈[8],多菌靈可以特異性地與病原真菌的β-微管蛋白結(jié)合,干擾微管裝配,進而影響有絲分裂中紡錘體的形成,使病原菌孢子萌發(fā)長出的芽管發(fā)生扭曲,從而使病菌不能正常進行有絲分裂而達到殺菌的效果[9]。室內(nèi)抗藥性風險評估認為甲基硫菌靈具有高抗藥風險性[10],國內(nèi)外已有研究表明許多病原菌對甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗性[9,11]。在我國各蘋果產(chǎn)區(qū),甲基硫菌靈的推廣較早且具有較高的施用率。但是未開展蘋果輪紋病菌對該藥敏感性水平監(jiān)測。

綜上所述,戊唑醇和甲基硫菌靈是防治蘋果輪紋病的主要藥劑,在我國蘋果產(chǎn)區(qū)已推廣使用多年,病原菌在這兩種藥劑持續(xù)的選擇壓力下有可能產(chǎn)生抗藥性菌株。因此,及時進行病原菌敏感性的監(jiān)測,對于保證防治效果是十分重要的。本研究采用菌絲生長速率法,分別測定了果園中的蘋果輪紋病病原菌對戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株:69株蘋果輪紋病菌菌株采集于山東煙臺地區(qū),其中煙臺福山區(qū)25株,煙臺蓬萊市23株,煙臺海陽市21株，果園每年施用戊唑醇1～2次,連續(xù)施用5年;34株采集于北京昌平區(qū),果園每年施用甲基硫菌靈2次,連續(xù)施用10年。所有菌株均經(jīng)過組織分離、單菌絲純化,鑒定為Botryosphaeriadothidea。

供試藥劑為96.7%戊唑醇原藥(江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司),98.6%甲基硫菌靈原藥(陜西美邦農(nóng)藥有限公司)。

1.2方法

1.2.1含藥培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取0.1 g戊唑醇原藥,溶于約9 mL異丙醇(99.7%),用10 mL容量瓶定容,配成濃度為104μg/mL的母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜幣囵B(yǎng)基時,用異丙醇按一定比例將母液稀釋到所需的質(zhì)量濃度,加入培養(yǎng)基千分之一體積的稀釋液[12],得到如下終濃度的含藥PDA平板:0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 μg/mL,對照培養(yǎng)基加入等量異丙醇。

用電子天平稱取0.1 g甲基硫菌靈原藥,溶于約9 mL丙酮(99.5%),用10 mL容量瓶定容,配成濃度為 104μg/mL的母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。制備含藥培養(yǎng)基時,用丙酮按一定比例稀釋母液到所需的質(zhì)量濃度,加入培養(yǎng)基千分之一體積的稀釋液,得到如下終濃度的含藥PDA平板:0、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL,對照培養(yǎng)基加入等量丙酮。

1.2.2菌絲生長速率法測定供試藥劑對蘋果輪紋病菌的EC50

將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d左右,用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅,用接種針挑取菌餅菌絲面朝下接種于各個濃度平板的中央,26℃黑暗培養(yǎng),每個處理3次重復。3 d后,用十字交叉法測量各個平板的菌落直徑,計算平均菌落直徑,按下列公式計算菌絲生長抑制率:

抑菌率(%)=

通過Excel軟件進行藥劑濃度對數(shù)值和菌絲生長抑制率幾率值之間的線性回歸分析,將菌絲生長抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值,藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對數(shù)值,以X(藥劑濃度的對數(shù)值)和Y(抑制率幾率值)做線性回歸分析得到回歸方程Y=a+bX,當Y=5 時,求出X的反對數(shù)[5]即為供試藥劑對各供試蘋果輪紋病菌菌株的EC50。

1.2.3不同甲基硫菌靈敏感性菌株的β-tubulin基因序列分析

采用OligoCalc(Oligonucleotide Properties Calculator, http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)設計擴增蘋果輪紋病菌β-tubulin基因的特異性引物TubF：5′-GTCAGGAGTCGCAGTCAGTAATTAG-3′和TubR：5′-CTTCATTTTGTCGCATGTCTGGCTC-3′,擴增片段長度約為2.1 kb。選擇5株對甲基硫菌靈敏感性不同的蘋果輪紋病菌菌株,在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6 d,收集菌絲,用試劑盒SP Fungal DNA Kit提取DNA,用引物TubF/TubR擴增β-tubulin基因。PCR反應總體積為50 μL：10×LA PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL,TubF/TubR(20 μmol/L)各1 μL,LATaqDNA聚合酶(1.5 U/μL,TaKaRa)0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O補至50 μL。反應程序為：95℃預變性9 min；94℃變性1 min,61℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE中電泳30 min,電壓為100 V,然后用溴化乙錠染色,并用凝膠成像儀觀察、拍照。

電泳檢測后的PCR產(chǎn)物交由北京三博遠志生物技術有限責任公司用正反向引物進行序列測定。用ClustalW 1.82軟件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)對所測序列與從NCBI上下載的β-tubulin基因序列進行比對,根據(jù)NCBI上登錄的β-tubulin基因相關序列的編碼區(qū),截取所測序列的編碼區(qū),用EMBOSS軟件(http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq)將DNA序列翻譯為蛋白質(zhì)序列,用ClustalW 1.82軟件比較不同敏感性的蘋果輪紋病菌菌株β-tubulin基因?qū)牡鞍踪|(zhì)序列,確定是否有氨基酸突變。

2　結(jié)果與分析

2.1蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性

采用菌絲生長速率法測定了從山東煙臺地區(qū)施用戊唑醇5年的果園中采集的69株蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性。結(jié)果表明戊唑醇對蘋果輪紋病菌菌絲生長具有明顯的抑制作用,EC50為0.017 4～0.114 3 μg/mL,最高值約是最低值的6.57倍,EC50平均值為(0.057 8±0.018 3)μg/mL(表1)。根據(jù) EC50極差R=Xmax-Xmin=0.114 3-0.017 4=0.096 9 μg/mL,將EC50數(shù)據(jù)分成6組,EC50的頻數(shù)分布見圖1。戊唑醇對69株蘋果輪紋病菌菌株EC50的頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線,符合正態(tài)分布,表明蘋果輪紋病菌菌株對戊唑醇的敏感性沒有產(chǎn)生分化,未出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性亞群體(圖1)。王英姿等[6]采集山東地區(qū)未施用過戊唑醇的野生輪紋病菌菌株建立的敏感性基線為(0.111 5±0.048 5)μg/mL,相比可知,煙臺地區(qū)施用戊唑醇5年果園中的蘋果輪紋病菌的EC50平均值是已報道敏感性基線的0.52倍,最低值和最高值分別是已報道敏感性基線的0.16倍和1.03倍。

表1　山東省煙臺地區(qū)蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性Table 1　Susceptibility of Botryosphaeria dothidea from Yantai, Shandong Province to tebuconazole

圖1　戊唑醇對山東煙臺地區(qū)蘋果輪紋病菌的 EC50頻數(shù)分布Fig.1　Frequency distribution of EC50 values of tebuconazole against isolates of Botryosphaeria dothidea from Yantai, Shandong Province

2.2蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性

采用菌絲生長速率法測定了來自北京市昌平區(qū)的34株蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果顯示,隨著甲基硫菌靈濃度升高,對蘋果輪紋病菌菌絲生長的抑制作用逐漸增強。EC50為0.846 4～4.677 4 μg/mL,最高值約是最低值的5.53倍,EC50平均值是(2.235 6±0.857 5)μg/mL(圖2,表2)。根據(jù)EC50極差R=Xmax-Xmin=4.677 4-0.846 4=3.831 μg/mL,將EC50數(shù)據(jù)分成8組,EC50的頻數(shù)分布見圖2。有94.12%的菌株集中于主峰范圍內(nèi),58.8%的供試菌株的EC50小于平均值。楊煒華等[11]采集山東泰安的野生輪紋病菌菌株建立的敏感性基線為0.710 2 μg/mL,相比可知,采集于北京昌平區(qū)施用甲基硫菌靈10年果園中的蘋果輪紋病菌的EC50平均值是已報道敏感性基線的3.15倍,最低值和最高值分別是已報道敏感性基線的1.19倍和6.59倍。

圖2　甲基硫菌靈對北京市昌平區(qū)蘋果輪紋病菌的 EC50頻數(shù)分布Fig.2　Frequency distribution of thiophanate-methyl EC50values against isolates of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing

菌株Isolate回歸方程Regressionequation相關系數(shù)CorrelationcoefficientEC50/μg·mL-1SB2-3y=2.6979x+4.29580.99051.8256LC4-2y=3.5272x+2.63750.97314.6774SB0-5y=1.9901x+4.38490.99702.0394SA0-2y=1.0625x+4.85630.94761.3665LB3-1y=2.3639x+5.17120.89270.8464

2.3β-tubulin基因序列分析結(jié)果

選擇對甲基硫菌靈敏感性不同的5株菌SB2-3、LC4-2、SB0-5、SA0-2和LB3-1,用TubF和TubR均擴增出2.1 kb的DNA片段。測序后去掉內(nèi)含子,將序列重新拼接并進行比對,發(fā)現(xiàn)不同敏感性菌株β-tubulin基因序列存在堿基的差異,菌株SA0-2第183位、第291位、第597位、第696位堿基對發(fā)生突變(圖3);將不同敏感性菌株的β-tubulin基因序列翻譯為蛋白序列,并進行比對,發(fā)現(xiàn)氨基酸序列完全相同,均沒有發(fā)生變化(圖4),說明對甲基硫菌靈敏感性不同的蘋果輪紋病菌β-微管蛋白基因未出現(xiàn)引起β-微管蛋白氨基酸序列發(fā)生變化的突變。

圖3　北京市昌平區(qū)對甲基硫菌靈不同敏感性的蘋果輪紋病菌β-微管蛋白基因序列比對結(jié)果Fig.3　Alignment of β-tubulin gene of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing with different susceptibility to thiophanate-methyl

圖4　北京市昌平區(qū)對甲基硫菌靈不同敏感性的蘋果輪紋病菌β-微管蛋白的氨基酸序列比對結(jié)果Fig.4　Alignment of β-tubulin amino acid sequences of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing with different sensibility to thiophanate-methyl

3　討論

戊唑醇為新一代三唑類殺菌劑,具有高效、廣譜、內(nèi)吸、低毒等特性,對大田作物、果樹、蔬菜和重要的經(jīng)濟作物上由子囊菌、擔子菌和半知菌引起的重要病害具有極好的治療和鏟除作用,且用量低[13]。戊唑醇結(jié)構(gòu)上與其他三唑類殺菌劑相似,但在安全性、使用范圍等方面有所提高[14]。21世紀后該藥在山東東部蘋果產(chǎn)區(qū)迅速推廣使用,給該地區(qū)的蘋果輪紋病菌造成更大的選擇壓力。王英姿等[6]的試驗結(jié)果表明,來自山東不同區(qū)域的蘋果輪紋病菌大多數(shù)仍對戊唑醇表現(xiàn)較高的敏感性,15.49%的菌株對戊唑醇產(chǎn)生了2～5倍低水平抗藥性,且抗性菌株集中在山東東部地區(qū),表明戊唑醇防治蘋果輪紋病具有一定的風險性。蘇平等[5]檢測了山東、河南和遼寧蘋果種植區(qū)的蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性,結(jié)果表明蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性呈單峰分布,未出現(xiàn)敏感性分化的亞群體,其中山東地區(qū)的蘋果輪紋病菌對戊唑醇敏感性最低,遼寧地區(qū)的蘋果輪紋病菌對戊唑醇敏感性最高,但不同地理來源的蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性差異不顯著。

目前,蘋果輪紋病菌對戊唑醇的敏感性檢測采用的供試菌株大多針對性不強,不能體現(xiàn)出戊唑醇田間施用史對蘋果輪紋病菌敏感性的影響。本研究采集山東煙臺地區(qū)蘋果產(chǎn)區(qū)連續(xù)施用戊唑醇5年以上,每年施用1～2次,且未施用過其他三唑類殺菌劑的果園中的蘋果輪紋病菌測定其對戊唑醇的敏感性,發(fā)現(xiàn)所有蘋果輪紋病菌對戊唑醇均保持較高敏感性,與之前報道的敏感性基線非常接近,未出現(xiàn)抗藥性分化的亞群體。

甲基硫菌靈在我國登記較早,目前在各大蘋果產(chǎn)區(qū)應用普遍,是蘋果輪紋病化學防治中應用最廣泛、最重要的藥劑之一。楊煒華等[11]對我國重要蘋果產(chǎn)區(qū)的蘋果輪紋病菌進行了抗藥性檢測,結(jié)果表明,我國重要蘋果產(chǎn)區(qū)對多菌靈的抗性菌株已普遍存在,表現(xiàn)為中低水平抗藥性;對甲基硫菌靈存在低水平抗藥性菌株。李曉軍等[15]測定了山東主要蘋果產(chǎn)區(qū)蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性,發(fā)現(xiàn)多菌靈對蘋果輪紋病菌菌株的EC50呈單峰頻次分布,沒有出現(xiàn)敏感性分化的亞群體。馬志強等[16]通過檢測河北保定地區(qū)蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性,發(fā)現(xiàn)供試菌株對多菌靈的敏感性均已產(chǎn)生不同程度的分化。不同地理和施藥史來源的蘋果輪紋病菌對多菌靈的敏感性不同。由于甲基硫菌靈主要通過轉(zhuǎn)化為多菌靈對病害起到防治作用,因此兩種藥劑之間存在交互抗性[8]。本研究檢測了北京市昌平區(qū)連續(xù)施用甲基硫菌靈10年,每年施用2次的蘋果園中的蘋果輪紋病菌對甲基硫菌靈的敏感性并與之前報道的敏感性基線相比[11],沒有發(fā)現(xiàn)明顯的抗性群體,對不同敏感性的蘋果輪紋病菌β-微管蛋白基因序列的測定,也沒有發(fā)現(xiàn)對應位點氨基酸序列的變化,進一步證實了病原菌在分子水平上沒有發(fā)生抗藥性突變。綜上結(jié)果表明,按照每年施用2次的頻率,這兩種藥劑是可以長期用于蘋果輪紋病的防治。建議生產(chǎn)中將戊唑醇與苯并咪唑類殺菌劑交替使用,增強防治效果,延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生,提高殺菌劑的使用壽命。甲基硫菌靈仍然可以用于蘋果輪紋病的防治。

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(責任編輯：楊明麗)

Susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole and thiophanate-methyl

An Jiudong,Guo Liyun,Zhu Xiaoqiong,Song Yuefeng

(College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

In order to monitor the susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole and thiophanate-methyl in orchards with long history of using these two fungicides, the susceptibility ofB.dothideaisolates collected from represented orchards to these two fungicides was determined based on mycelium growth rate. The results showed that the EC50values of tebuconazole against 69 isolates collected from Yantai,Shandong Province with application of tebuconazole for 1-2 times each year for 5 years ranged from 0.017 4 to 0.114 3 μg/mL with no appeared resistant sub-populations. The EC50values of thiophanate-methyl against 34 isolates collected from Changping District, Beijing with application of thiophanate-methyl for 2 times each year for 10 years ranged from 0.846 4 to 4.677 4 μg/mL with no appeared resistant sub-populations. The maximum and minimum values were 1.19 and 6.59 times of the reported susceptible baseline, respectively.

Botryosphaeriadothidea;tebuconazole;thiophanate-methyl;susceptibility

2015-01-08

2015-06-08

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-28)

E-mail: ppguo@cau.edu.cn

S 436.611

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.034