張水英,　蔣春和,　蘭平秀,3,　張雪峰,　李　凡*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲(chóng)害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明　650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處,昆明　650201; 3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明　650201; 4. 紅河學(xué)院,蒙自　661199)

?

應(yīng)用RT-PCR和dot-ELISA方法檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒

張水英1,蔣春和2,蘭平秀1,3,張雪峰4*,李凡1*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲(chóng)害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)教務(wù)處,昆明650201; 3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明650201; 4. 紅河學(xué)院,蒙自661199)

本文比較了RT-PCR和dot-ELISA兩種方法對(duì)單頭灰飛虱攜帶水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)的檢出率、檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)成本。結(jié)果表明,兩種方法均能檢測(cè)到單頭灰飛虱體內(nèi)的RSV,RT-PCR檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的陽(yáng)性檢出率比dot-ELISA方法低11.79%～15.77%,但RT-PCR的檢測(cè)靈敏度比dot-ELISA高10倍,RT-PCR技術(shù)的檢測(cè)成本比dot-ELISA的高。結(jié)果暗示,對(duì)于單頭介體昆蟲(chóng)中的病毒檢測(cè),RT-PCR技術(shù)的檢出率不一定比dot-ELISA的高。綜合考慮后,如對(duì)室外大批量灰飛虱進(jìn)行帶毒率檢測(cè)時(shí)可采用dot-ELISA方法,如需準(zhǔn)確分析單頭灰飛虱體內(nèi)RSV時(shí)可采用RT-PCR方法。

水稻條紋病毒;灰飛虱;RT-PCR;dot-ELISA;檢測(cè)

水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)引起水稻條紋葉枯病,自然界中可以由灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)、白脊飛虱(Unkanodessapporona)、白帶飛虱(U.albifascia)和白條飛虱(Terthronalbovittatum)傳播,但主要依靠灰飛虱以持久方式經(jīng)卵傳給后代[1]。水稻是RSV最主要的寄主,受侵染的水稻最典型的外部癥狀為出現(xiàn)褪綠的條紋斑點(diǎn)或斑塊,一般最早出現(xiàn)在嫩葉,根據(jù)具體表現(xiàn)癥狀可以分為卷葉型和展葉型兩類(lèi)。水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本關(guān)東地區(qū)發(fā)生,隨后在俄羅斯、朝鮮、韓國(guó)、前蘇聯(lián)和烏克蘭相繼發(fā)生[2]。我國(guó)自1963年首次在江蘇南部地區(qū)發(fā)生后,該病迅速擴(kuò)及到18個(gè)省(市、自治區(qū))的廣大稻區(qū),并在江蘇、安徽、河南、山東、云南、北京、上海、臺(tái)灣等地暴發(fā)流行,病情嚴(yán)重的稻區(qū)甚至顆粒無(wú)收。自2006年以來(lái)，通過(guò)選育抗病品種、加強(qiáng)病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)、合理用藥等綜合治理措施,該病害發(fā)生面積已大幅下降[3],但是全國(guó)各地仍時(shí)有發(fā)生,因此對(duì)該病進(jìn)行早期預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及有效防控仍很有必要。

灰飛虱的帶毒率與水稻條紋葉枯病的發(fā)生關(guān)系密切,快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)灰飛虱體內(nèi)的RSV對(duì)水稻條紋葉枯病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和防治具有重要意義。要準(zhǔn)確探明田間灰飛虱的帶毒率,需要對(duì)大量單頭灰飛虱攜帶RSV情況進(jìn)行檢測(cè)。RSV的檢測(cè)方法有許多,包括 ELISA、DIBA、Western Blot、RT-PCR、Northern 雜交等[4-6],其中RT-PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。dot-ELISA除具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)外,還具有成本低的優(yōu)勢(shì),適于大批量樣品檢測(cè),且不需要特殊儀器設(shè)備,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果判定簡(jiǎn)單易行,因此被廣泛應(yīng)用于灰飛虱體內(nèi)RNA病毒的檢測(cè)[7-9]。雖然目前利用RT-PCR和dot-ELISA檢測(cè)灰飛虱體內(nèi)水稻病毒的報(bào)道有不少,但尚未見(jiàn)比較這兩種方法檢測(cè)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的相關(guān)報(bào)道。本文比較了兩種方法對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢出率、檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)成本等,以期為單頭灰飛虱體內(nèi)RSV以及其他蟲(chóng)傳病毒的檢測(cè)提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

可能攜帶水稻條紋病毒的灰飛虱高齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)，在溫室用‘武育粳3號(hào)’飼養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)試劑

0.01 mol/L PBS緩沖液,百泰克公司的TRIpure總RNA提取試劑,TaKaRa公司的 Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-反轉(zhuǎn)錄試劑盒,Tiangen公司的TaqDNA Polymerase試劑盒,美國(guó)KPL公司的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗,Sigma公司的TMB顯色液,美國(guó)PALL公司的硝酸纖維素濾膜。RSV單克隆抗體由浙江大學(xué)周雪平教授惠贈(zèng)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品準(zhǔn)備

在比較兩種方法的檢出率時(shí),設(shè)置了兩個(gè)處理,處理1:同一頭灰飛虱,用PBS研磨后將上清液分成兩部分,一部分直接用于dot-ELISA檢測(cè),另一部分提RNA后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),該處理設(shè)置3組重復(fù),分別檢測(cè)灰飛虱20、30、20頭。處理2:不同的單頭灰飛虱分別進(jìn)行RT-PCR和dot-ELISA檢測(cè),均各自設(shè)置2組重復(fù),分別檢測(cè)灰飛虱34、72頭。

1.3.2單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)已報(bào)道的RSV RNA4序列,設(shè)計(jì)特異性RSV檢測(cè)引物(RNA4dF1:5′-ACACAAAGTCCAGGGCATTT-3′,RNA4dR1:5′-CACACAAGAAGGTCAACCCAAAC-3′)。利用TRIpure試劑提取單頭灰飛虱上清液中的總RNA,取1 μL總RNA用ddH2O按100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍進(jìn)行系列稀釋,然后分別按照Reverse Transcriptase M-MLV RNase H-反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqDNA Polymerase試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.3.3單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的dot-ELISA檢測(cè)

dot-ELISA采用Xie等[10]的方法,略有改動(dòng)。取1 μL用0.01 mol/L PBS緩沖液研磨單頭灰飛虱后的上清液,用0.01 mol/L PBS進(jìn)行100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6系列稀釋;取2 μL稀釋液點(diǎn)到NC膜上,室溫干燥;用5%脫脂奶粉室溫封閉60 min,用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1∶8 000稀釋RSV單克隆抗體,將抗體與NC膜在室溫孵育60 min;洗膜后與用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1∶10 000的比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗室溫孵育60 min;洗膜后用TMB底物顯色液顯色,待NC膜上的陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)明顯藍(lán)色而陰性對(duì)照未顯色時(shí)棄顯色液終止反應(yīng),記錄結(jié)果并照相保存。

2　結(jié)果與分析

2.1RT-PCR和dot-ELISA方法對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢出率

處理1中,RT-PCR的RSV平均陽(yáng)性檢出率為55.56%,dot-ELISA的RSV平均陽(yáng)性檢出率為67.35%,RT-PCR的RSV平均陽(yáng)性檢出率比dot-ELISA方法低11.79%。處理2中,RT-PCR和dot-ELISA的RSV平均陽(yáng)性檢出率分別為27.82%和43.59%,前者陽(yáng)性檢出率比后者低15.77%。無(wú)論是同一頭灰飛虱同時(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)和dot-ELISA檢測(cè),還是不同的單頭灰飛虱分別進(jìn)行dot-ELISA和RT-PCR檢測(cè),RT-PCR的RSV陽(yáng)性檢出率都比dot-ELISA的低(表1)。

表1　RT-PCR和dot-ELISA對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢出率1)Table 1　Detection rate of RSV in individual SBPHs by RT-PCR and dot-ELISA

1) 處理1:隨機(jī)采集的同一頭灰飛虱既進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)又進(jìn)行dot-ELISA檢測(cè);處理2:隨機(jī)采集的不同的單頭灰飛虱,一半進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),另一半進(jìn)行dot-ELISA檢測(cè)。

Treatment 1: RSV detection was conducted by both RT-PCR and dot-ELISA for the same individual SBPH; Treatment 2: RSV detection was conducted by RT-PCR or dot-ELISA for different individual SBPHs.

2.2RT-PCR和dot-ELISA對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢測(cè)靈敏度

取一頭灰飛虱用PBS緩沖液充分研磨后得到上清液,一部分上清液用PBS按10×梯度進(jìn)行稀釋后用于dot-ELISA檢測(cè),稀釋倍數(shù)為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6,隨著稀釋倍數(shù)增大,陽(yáng)性顯色逐漸減弱,稀釋至10-2后便不再顯色(圖1),即dot-ELISA方法可以檢測(cè)到RSV的最大稀釋倍數(shù)為原液的100倍。另一部分上清液提RNA后用ddH2O 按10×梯度進(jìn)行稀釋后用于RT-PCR檢測(cè),稀釋倍數(shù)為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6,隨著稀釋倍數(shù)增大,目標(biāo)條帶逐漸減弱,稀釋至10-3后便檢測(cè)不到目標(biāo)條帶(圖2),即RT-PCR方法可以檢測(cè)到RSV的最大稀釋倍數(shù)為原RNA濃度的1 000倍。

圖1　Dot-ELISA對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢測(cè)靈敏度Fig.1　Detection sensitivity for RSV in individual SBPHs by dot-ELISA

2.3RT-PCR和dot-ELISA對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢測(cè)成本比較

對(duì)單頭灰飛虱進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)時(shí),如果選用較為便宜的TRIpure總RNA提取試劑、TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒和天根TaqDNA Polymerase試劑盒等,折算后檢測(cè)1個(gè)樣品的主要試劑、耗材成本約為20～30元;對(duì)單頭灰飛虱進(jìn)行dot-ELISA檢測(cè)時(shí),需用到硝酸纖維素濾膜、RSV單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗和TMB顯色液,折算后檢測(cè)1個(gè)樣品的試、耗材成本約為8～10元,約是RT-PCR檢測(cè)成本的1/3。由此可見(jiàn)RT-PCR檢測(cè)成本比dot-ELISA高許多。

圖2　RT-PCR對(duì)單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的檢測(cè)靈敏度Fig.2　Detection sensitivity for RSV in individual SBPHs by RT-PCR

3　討論

劉珊珊等[11]、馬占鴻等[12]的研究結(jié)果表明RT-PCR檢測(cè)靈敏度比dot-ELISA的高,因此我們起初也一直認(rèn)為RT-PCR的檢出率應(yīng)該比dot-ELISA的高,但是經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn),結(jié)果都是RT-PCR的陽(yáng)性檢出率比dot-ELISA的低,且存在RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品dot-ELISA檢測(cè)卻為陰性、dot-ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品RT-PCR檢測(cè)為陰性的現(xiàn)象。針對(duì)RT-PCR和dot-ELISA陽(yáng)性檢出率不一致的現(xiàn)象,我們分別用TRIpure、RNAiso和Trizol 3種RNA提取試劑分別對(duì)單頭灰飛虱的RNA進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)3種試劑的提取效果差異不大,結(jié)果依然是RT-PCR的陽(yáng)性檢出率比dot-ELISA的低,說(shuō)明RNA的提取試劑不是造成RT-PCR檢出率比dot-ELISA低的主要原因。另外對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)雙向差異的這些樣品進(jìn)行10、50、100、200倍稀釋后再檢測(cè),發(fā)現(xiàn)結(jié)果仍然是RT-PCR的陽(yáng)性檢出率比dot-ELISA的低。于是我們用IC-RT-PCR對(duì)這些樣品進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示RT-PCR和IC-RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果基本一致,且IC-RT-PCR陽(yáng)性檢出率比RT-PCR提高8%左右,依然存在部分陽(yáng)性結(jié)果與dot-ELISA不吻合的現(xiàn)象。

饒黎霞等[13]的研究結(jié)果也表明,分別用RT-PCR和dot-ELISA檢測(cè)水稻上的南方水稻矮縮病毒、水稻矮縮病毒和水稻齒葉矮縮病毒時(shí),從檢出率看,兩種方法的吻合率并不完全一致,并因病毒而異。另外嵇朝球等[14]、楊杰等[15]認(rèn)為dot-ELISA是在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)有無(wú)病毒的外殼蛋白,這種檢測(cè)法受到基因表達(dá)和環(huán)境條件等因素的影響,檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性較高,導(dǎo)致dot-ELISA的檢出率要高許多。另外在開(kāi)展RT-PCR檢測(cè)前需要對(duì)單頭灰飛虱進(jìn)行RNA提取,因蟲(chóng)體很小,很容易在提取過(guò)程中發(fā)生RNA的降解及丟失,導(dǎo)致RT-PCR的檢出率要低一些,這些可能都是導(dǎo)致在對(duì)大批量單頭灰飛虱進(jìn)行檢測(cè)時(shí)很難做到兩種方法的檢測(cè)結(jié)果完全吻合的原因。

在使用成本及實(shí)用性方面,RT-PCR方法所使用的儀器和試劑成本較高,需要專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行操作,不利于大批量的樣品檢測(cè)。dot-ELISA方法的成本相對(duì)較低,靈敏度高、特異性強(qiáng),不需要特殊儀器設(shè)備,適用于大批量的單頭灰飛虱樣品檢測(cè),但可能存在假陽(yáng)性現(xiàn)象?？偟膩?lái)說(shuō)在進(jìn)行田間大批量灰飛虱帶毒率的檢測(cè)時(shí),dot-ELISA方法是一個(gè)不錯(cuò)的選擇,而需要準(zhǔn)確分析單頭灰飛虱體內(nèi)RSV時(shí),選擇RT-PCR方法較好,各單位可根據(jù)自己的條件及具體情況來(lái)選擇檢測(cè)技術(shù)[16]。

[1]白雪亮, 王金菊, 周維, 等. 水稻條紋葉枯病的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2007, 42(8): 4-6.

[2]任春梅,程兆榜,季英華,等.灰飛虱來(lái)源的水稻條紋病毒病害特異性蛋白基因遺傳多樣性[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25(6):132-138.

[3]鄭璐平.水稻條紋病毒基因NS2致病作用機(jī)理分析[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2013.

[4]周益軍,劉海建,王貴珍,等.灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒免疫檢測(cè)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1):50-52.

[5]孫祥良,王華第,朱金良,等.灰飛虱攜帶水稻條紋葉枯病毒檢測(cè)研究[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊,2007，27:7-9.

[6]Cai Lijun, Ma Xizhi, Kang Lin, et a1. DetectingRicestripevirus(RSV) in the small brown planthopper (Laodelphaxstriatellus) with high specificity by RT-PCR [J]. Journal of Virological Methods, 2003, 112: 115-120.

[7]王朝輝, 周益軍, 范永堅(jiān), 等. 從單頭灰飛虱中檢測(cè)水稻黑條矮縮病毒簡(jiǎn)單快速的方法[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版), 2002, 20(4): 340-343．

[8]曲志才, 沈大棱. 單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋葉枯病毒的快速檢測(cè)[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2008, 25(4): 459-464．

[9]張開(kāi)玉, 熊如意, 周益軍. 灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的檢測(cè)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2008, 35(5): 410-414.

[10]Xie Yan, Jiao Xiaoyang, Zhou Xueping et a1. Highly sensitive serological methods for detecting tomato yellow leaf curl virus in tomato plants and whiteflies [J].Virology Journal,2013,10:142.

[11] 劉珊珊, 周倩, 高必達(dá), 等. Dot-ELISA和RT-PCR檢測(cè)南方水稻黑條矮縮病毒靈敏度的比較[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014(1): 51-54.

[12]馬占鴻, 常勝軍, 周廣和. 應(yīng)用dot-ELISA和RT-PCR法檢測(cè)玉米花粉中玉米矮花葉病毒的研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1999, 29(3): 247-249.

[13]饒黎霞,王震成,吳建祥,等.2011-2012年三種水稻矮縮病在我國(guó)的分布及發(fā)生調(diào)查[J].植物保護(hù),2014,40(3):151-156.

[14]嵇朝球, 鐘環(huán), 鐘佩英, 等. 水稻條紋葉枯病病毒RT-PCR快速檢測(cè)研究[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版), 2005, 23(2): 188-191.

[15]楊杰, 王軍, 陳志德, 等. 利用RT-PCR快速檢測(cè)水稻條紋葉枯病病毒[J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 24(1): 40-44.

[16]李海明,沈建國(guó),吳祖建,等.3種方法檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒的靈敏度對(duì)比分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(17):269-272.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Detection ofRicestripevirusin individual small brown planthoppers by RT-PCR and dot-ELISA

Zhang Shuiying1,Jiang Chunhe2,Lan Pingxiu1,3,Zhang Xuefeng4,Li Fan1

(1. Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pest Management of Ministry of Education, Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China; 2. Office of Teaching Affairs, Yunnan Agricultural University,Kunming650201, China; 3. College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming650201, China; 4. Honghe University, Yunnan661199, China)

The detection rates, sensitivities and cost of RT-PCR and dot-ELISA methods were compared for the detection ofRicestripevirus(RSV) in individual small brown planthoppers (SBPH). The results indicated that RSV could be detected in single SBPH successfully by both methods. The RSV-positive detection rates in single SBPHs by RT-PCR were 11.79%-15.77% lower than that by dot-ELISA; however, the sensitivity of RT-PCR was 10 times higher than that of dot-ELISA. The cost of RT-PCR was also higher. The results suggested that the detection rate of RSV in individual insect vectors by RT-PCR might be lower than that by dot-ELISA. Therefore, dot-ELISA is recommended for the detection of RSV in individual SBPHs when large-scale field samples need to be tested, while RT-PCR is used for accurate analysis of the virus in single SBPHs.

Ricestripevirus;small brown planthopper;RT-PCR;dot-ELISA; detection

2015-01-30

2015-03-31

云南省教育廳科學(xué)研究基金重大專(zhuān)項(xiàng)(ZD2012005)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(云教科[2014]22號(hào))

E-mail:zxf197927@163.com；fanlikm@126.com

Q 93-331, S435.111.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.021