于志鵬,武思佳,趙文竹,*,郭　輝，丁　龍,勵建榮,*,劉靜波

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

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海洋動物源性糖蛋白研究進展

于志鵬1,武思佳1,趙文竹1,*,郭輝1，丁龍2,勵建榮1,*,劉靜波2

(1.渤海大學食品科學與工程學院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.吉林大學營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春 130062)

糖蛋白是寡糖鏈與多肽以多種形式共價相連且具有生物活性的物質(zhì),天然糖蛋白具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生理活性。本文對海洋動物源性糖蛋白的組成結(jié)構、功能特性、制備以及分離純化等方面的研究現(xiàn)狀進行綜述,并分析展望了海洋動物源性糖蛋白的未來研究前景,旨在為海洋動物源糖蛋白的基礎研究與應用提供理論參考。

糖蛋白,提取,分離純化,結(jié)構

糖蛋白是一種由多糖和蛋白質(zhì)構成的活性組分,20世紀初美國生物化學協(xié)會蛋白質(zhì)命名委員會首次將其定義為由蛋白質(zhì)分子和除核酸外含有碳水化合物基團物質(zhì)共同組成的一類復合物。糖蛋白廣泛存在于生物體內(nèi),研究發(fā)現(xiàn)食物本身具有或通過體外水解方式獲得的糖蛋白有著抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力等生理功能[1-2]。隨著糖生物學、糖組學、現(xiàn)代分離純化技術和鑒定技術的發(fā)展,糖蛋白的提取[3-4]、純化[5-6]、結(jié)構鑒定[7-8]和活性評價[9]等研究現(xiàn)已成為諸多學科研究人員關注的焦點。近年來,隨著國內(nèi)外研究學者對海洋資源開發(fā)利用的重視,源于海洋動物的糖蛋白研究逐漸成為熱點。本文就海洋動物源性糖蛋白的發(fā)展現(xiàn)狀進展進行了綜述,旨在為糖蛋白的深入研究提供理論參考。

1　海洋動物源性糖蛋白的組成及結(jié)構

糖蛋白是蛋白質(zhì)以共價鍵方式與糖分子鏈相連所構成的分子,主鏈較短且一般情況下糖含量小于蛋白質(zhì)含量,因此糖蛋白總體性質(zhì)更接近于蛋白質(zhì)。糖蛋白中的肽鏈幾乎含有所有的氨基酸種類,其中蘇氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸、天冬酰胺、羥賴氨酸等含量較高。糖蛋白糖鏈中單糖則包括L-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、木糖、L-巖藻糖、半乳糖胺、唾液酸和L-艾杜糖醛等。糖鏈的存在可提高糖蛋白的親水性,且可與其他糖鏈或蛋白質(zhì)形成共價鍵或氫鍵,起到結(jié)構支架或轉(zhuǎn)移糖基的作用[10]。糖基化在細胞免疫、信號傳導、蛋白翻譯調(diào)控、蛋白降解等諸多生物過程中起著重要作用。目前糖基化反應是一種綠色的蛋白質(zhì)改性方法,可改善蛋白質(zhì)的功能特性,因此糖基化研究也愈益受到廣泛關注[11-12]。

糖肽鍵是糖鏈和肽鏈的連接鍵,是由糖基異頭碳原子上的羥基與肽鏈氨基酸殘基上的酰胺基或羥基脫水形成的糖苷鍵。糖肽鍵可分為N-糖肽鍵和O-糖肽鍵兩大類[13-14](圖1),主要包括木糖-絲氨酸型、半乳糖-羥賴氨酸型、阿拉伯糖-羥脯氨酸型、半乳糖-羥脯氨酸型、半乳糖-絲氨酸型、半乳糖-半胱胺酸型、葡萄糖-半胱氨酸型、甘露糖-絲(蘇)氨酸型、巖藻酸-蘇氨酸型8種連接方式。 糖肽鍵類型的判斷可通過β-消除反應來進行。

圖1　O-糖肽鍵(a)和 N-糖肽鍵(b)[14]Fig.1　O-glycopeptide linkage(a) and N-glycopeptide linkage(b)[14]

2012年陳覺等[15]首次報道了P-糖蛋白的晶體結(jié)構(圖2),P-糖蛋白是具有兩個同源亞單位的單鏈多肽,每個亞單位包含有跨膜結(jié)構域(TMD)和胞質(zhì)核苷酸結(jié)合結(jié)構域(NBD)(圖2a),并表現(xiàn)出類似的內(nèi)向型結(jié)構,并且在兩個NBDS之間有較大程度的間隔(圖2b),且向細胞膜內(nèi)層側(cè)向開口的TM10和TM12螺旋是不連續(xù)的(圖2c)。P-糖蛋白是一種在癌細胞中賦予多藥耐藥的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運載體蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC),影響癌癥無關藥物和異生物質(zhì)的吸收、分布和清除。

圖2　P-糖蛋白的晶體結(jié)構(分辨率為3.4埃)Fig.2　Crystal structure of the multidrugtransporter P-glycoprotein

目前糖蛋白的結(jié)構鑒定方法有甲基化分析、高碘酸氧化、IR、13C-NMP、GC-MS、X-衍射等,主要涉及分子量測定、氨基酸及單糖組成測定、糖肽鍵特征分析等。糖蛋白分子量的測定主要通過SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法、質(zhì)譜掃描或沉降速度法等。研究糖鏈組成結(jié)構時需要對單糖組成、異頭構型、糖的環(huán)狀構象、糖鏈連接順序、各糖間的連接位置、連接構象、非糖基取代物的位置及高級結(jié)構等進行分析[16],常用方法有高碘酸氧化法、甲基化法、稀堿水解、肼解反應、IR、HPLC、GC-MS、FAC-MS、HPAEC-PAD、ESI-MS、SDS-PAGE、MALDI-MS及RAAM 等聯(lián)用、MALDA-MS與O-TOF聯(lián)用、FTICR與質(zhì)譜聯(lián)用等[17-18]。目前,糖蛋白組學技術也逐步應用于海洋動物源性糖蛋白的結(jié)構鑒定。

2　海洋動物源性糖蛋白的功能活性

2.1抗氧化

黃來珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)近江牡蠣3種糖蛋白粗提物均具有一定的清除羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的能力,且這3種糖蛋白對羥自由基的清除能力高于對DPPH自由基和超氧陰離子自由基作用效果。任國艷等[20]利用磷酸緩沖溶液(pH7.2)浸提海蜇糖蛋白,并通過化學發(fā)光法測定了糖蛋白組分JF-Ⅲ對羥基自由基和超氧自由基的清除效果,結(jié)果表明JF-Ⅲ有較強的自由基清除活性。戴宏杰[21]通過測定虎斑烏賊肌肉糖蛋白(SPMG)的還原力及對超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫的清除能力,發(fā)現(xiàn)SPMG具有一定的抗氧化活性。

2.2抗腫瘤

劉倩等[22]研究尖紫蛤全臟器中糖蛋白對鼻咽癌CNE-2Z有抑制作用。顧謙群等[23]發(fā)現(xiàn)櫛孔扇貝中提取的糖蛋白(FGP)具有顯著的腫瘤抑制作用,這種作用可能通過增強小鼠細胞免疫功能而實現(xiàn)。祝雯等[24]提取的河蜆蛋白 CFp-a對BEL7407癌細胞生長有抑制作用。管角螺肌肉經(jīng)鹽水浸提后得到管角螺糖蛋白(AGHⅠ、AGH Ⅱ、AGH Ⅲ和NGH)的粗提物,經(jīng)初步藥理實驗證明NGH對小鼠S180具有抑制作用[25]。

2.3免疫調(diào)節(jié)

章建設等[18]從魷魚中提取的糖蛋白具有一定的免疫活性,能使小鼠體內(nèi)單核巨噬細胞的吞噬能力增強,從而提高小鼠的免疫力。Lei等[26]在章魚干中,經(jīng)鹽提得到的O GP1,O GP2和O GP3糖蛋白具有促進T細胞與小鼠脾細胞增殖的作用。任國艷等[27]以海蜇頭為原料,通過緩沖液提取,95%乙醇分級沉淀、Sephacryl S300HR柱層析等分離純化方法,獲得JGP-Ⅱ、JGP-Ⅲ、JGP-Ⅳ三種糖蛋白,并通過測定淋巴細胞增殖反應實驗得出3種糖蛋白在一定程度上可促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化,增加免疫活性。

2.4其他生物活性

王珊珊等[28]從鯽魚卵中提取的唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細胞增殖分化的功能,能顯著調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝,抑制高骨轉(zhuǎn)換速率,防止骨丟失。林丹等[29]從霞水母中提取的糖蛋白具有增加機體肝糖原的儲備、減少血清尿素氮產(chǎn)生、加快運動后血乳酸水平的恢復的作用,有明顯抗疲勞活性。

3　海洋動物源性糖蛋白的制備

糖蛋白在生物體內(nèi)以不同形式存在且參與凝血、免疫、分泌、內(nèi)吞、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信息傳遞、神經(jīng)傳導、細胞遷移、創(chuàng)傷修復等生理活動。其存在廣泛且有極高的利用價值,已有研究表明從牡蠣、魷魚、鯽魚、珠母貝等海洋動物中制備的糖蛋白具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效[19,30]。糖蛋白是寡糖鏈與多肽鏈以多種共價相連的復合糖,兼有糖和蛋白質(zhì)的性質(zhì),其制備方法主要采用水提法、鹽提法、醇提取法等[1]。因蛋白質(zhì)和糖種類多且性質(zhì)差異多樣化,在不同體系中的提取方式也存在著差異。

表2　稀鹽溶液浸提法提取糖蛋白

3.1水浸提法

糖蛋白中糖鏈的高度親水性使其易溶于水,因此可用水浸提法進行提取,提取條件也因糖蛋白的結(jié)構質(zhì)差異而不同(表1),從而實現(xiàn)最大限度的溶出糖蛋白且不破壞糖蛋白的穩(wěn)定性。糖蛋白提取劑一般以水溶液為主,通常根據(jù)原料特性需要先進行脫脂和脫色處理后再進行提取,得率一般在0.98%～1.68%[30-31]。

表1　水浸提法提取糖蛋白

3.2稀鹽溶液或緩沖鹽浸提法

糖蛋白在稀鹽和緩沖溶液中穩(wěn)定性好且溶解度大,因此可作為常用的提取溶劑,其中氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液最為常用。稀鹽溶液或緩沖鹽溶液因其中鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合具有保護蛋白質(zhì)使其不易變性的特點。一般能溶解在水溶液中而且與細胞顆粒結(jié)合不太緊密的糖蛋白,選用適當?shù)柠}濃度及pH條件進行提取,可有效提高其提取效果(表2),得率一般在1.8%～9.3%[32-37]。提取率一般在6.25%～12.79%[38-39]。

3.3酸堿提取法

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),堿性和酸性蛋白質(zhì)可分別用偏酸性和偏堿性提取液提取,NaOH和HCl溶液為常用酸堿提取的糖蛋白溶液。用稀酸或稀堿溶液進行提取時,要注意防止過酸或過堿導致蛋白質(zhì)構象的不可逆變化。王倩[38]等以魷魚纏卵腺為原料提取糖蛋白,對NaOH濃度、提取溫度和提取時間等因素進行單因素實驗,并通過建立回歸模型及顯著性檢驗確定了顯著因素,最終得出從魷魚纏卵腺中提取糖蛋白的最佳工藝條件為:提取時間3.5 h,提取溫度25 ℃,NaOH濃度0.37 mol/L,在此條件下糖蛋白得率為12.79%。王倩等[42]以太平洋褶柔魚纏卵腺為原料,通過水溶液浸提、酶解法提取和堿溶液提取這三種方式提取糖蛋白,對比發(fā)現(xiàn)堿溶液提取法效果最佳,其工藝參數(shù)為:提取時間3.44 h,提取溫度25 ℃,NaOH濃度為0.37 mol/L,此條件下不僅可提高糖蛋白的提取率,且醇沉時消耗乙醇量少。

3.4酶解提取法

酶解法提取糖蛋白可有效減少有效成分溶出及溶劑提取時的傳質(zhì)阻力,在縮短提取時間的同時提升提取效率,并利用酶的專一性和高選擇性避免提取過程中對底物其他成分的破壞。目前采用酶解法提取糖蛋白的報道較少。范秀萍[39]以海蜇皮為原料制備糖蛋白,通過選擇酶用量、料水比、酶解溫度與時間四個因素設計正交實驗,分別討論枯草桿菌中性蛋白酶與胰蛋白酶對糖蛋白提取的影響,得出當使用枯草中性蛋白酶/胰蛋白酶復合酶解法提取的最佳工藝條件分別為:料液比1∶0.5、溫度50 ℃、酶用量(枯草中性蛋白酶/胰蛋白酶)0.2%/0.3%、時間3 h/4 h。方旭波等[43]采用酶解法,經(jīng)酶解、75%乙醇沉淀和丙酮乙醇洗滌,最終得到魷魚硫酸軟骨素糖蛋白。酶解法以其反應條件溫和、特異性強和提取率高等優(yōu)點,具有較大的應用前景。

表3　超聲輔助提取糖蛋白

3.5超聲輔助提取法

超聲波在傳遞的過程中會產(chǎn)生振動、傳遞出能量,使物料細胞壁被破壞或細胞發(fā)生形變、溫度升高,從而加速糖蛋白的溶解,縮短時間、提高提取效率和增加得率;同時超聲波輔助提取所需溫度較低,避免了高溫對熱敏性物質(zhì)的破壞。由于糖蛋白種類繁多,性質(zhì)上差異比較大,即使是同類糖蛋白,但因其處于不同體系,因此提取條件也存在差異,在糖蛋白的超聲輔助提取過程中時常綜合考慮這些內(nèi)外因素(表3)。

4　海洋動物源性糖蛋白的分離純化

糖蛋白的分離純化是指從糖蛋白粗品中分離出單一組分糖蛋白的過程,是對糖蛋白進行結(jié)構鑒定的基礎。主要是通過生化分離的手段,先將雜質(zhì)去除后再進行逐級分離,從而得到具有一定純度的目標糖蛋白。糖蛋白的初步分級可利用硫酸銨分級沉淀、乙醇或乙二醇沉淀法,初步分級的糖蛋白可經(jīng)離子交換色譜等進一步分離純化。由于食源性糖蛋白的來源廣泛,形式復雜,且不同的糖蛋白間存在著相似性,因此對其的分離純化要根據(jù)糖蛋白的具體性質(zhì)與實驗目的進行選擇。

4.1離子交換層析法

離子交換層析法根據(jù)物質(zhì)的酸堿性、極性等差異,通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液的各組分分開。操作中需先將含各種糖蛋白的粗品吸附于層析柱,然后用不同的洗脫液將與層析介質(zhì)結(jié)合力不同的糖蛋白分別洗脫下來而達到分離純化的目的。利用離子交換層析純化時要根據(jù)糖蛋白的結(jié)構性質(zhì)進行選擇,一般分離糖蛋白常用陰離子交換柱,此法適用于分離各種酸性、中性或堿性的糖蛋白。吳紅棉等[41]將菲律賓蛤仔糖蛋白粗品(CGP)使用DEAE-52纖維素進行分離純化,首先用蒸餾水洗脫得到一中性組分NGP;經(jīng)2.0 mol/L NaCl梯度洗脫后得到AGP-I、AGP-II、AGP-III3個酸性組分;而后再將NGP和AGP-Ⅲ經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱進一步分離純化。夏光華等[47]以鯽魚卵為原料提取水溶性蛋白,將提取得到的粗糖蛋白經(jīng)QFF陰離子交換純化,采用0～1 mol/L的NaCl進行梯度洗脫,而后采用S-200凝膠柱進一步分離純化,再經(jīng)G-25凝膠柱脫鹽后凍干,得到可促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化的的CA-SGP組分。

4.2凝膠柱層析法

凝膠層析法分離糖蛋白是將粗糖蛋白加入充滿凝膠顆粒的層析柱中,后用緩沖液洗脫,由于糖蛋白分子的大小和形狀不同,從而得到分離。常用的凝膠有葡聚糖凝膠和羥丙基葡聚糖凝膠,其中葡聚糖凝膠只適用在水中,羥丙基葡聚糖凝膠不僅可在水中應用,也可在極性有機溶劑或與水組成的混合溶劑中使用,因此應根據(jù)提取方法的不同,選擇不同的凝膠進行純化。汪秋寬等[48]將經(jīng)透析后的牡蠣粗糖蛋白經(jīng)DEAE-52柱(2.6 cm×22.5 cm)分離純化,經(jīng)磷酸鹽緩沖液(pH7.2)洗脫,收集液經(jīng)冷凍濃縮后用Sephadex G-200分離得到糖蛋白G I和GⅡ組分。

4.3親和層析法

親和層析法是制備糖蛋白的一種有效方法,主要根據(jù)生物大分子的生物學特異性(即專一性親和力),利用凝集素能專一且可逆地與游離或復合糖類中的單糖或寡糖結(jié)合的性質(zhì),可采用固定化凝集素親和層析來分離純化糖蛋白[49]。祝雯等[24]將河蜆糖蛋白經(jīng)Blue Sepharose 6 Fast Flaw親和層析,用Tris-HCl洗脫至A280<0.02,用含0.05 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脫(流速1 mL/min),收集洗脫液濃縮后用PBS平衡;再經(jīng)SP Sepharose Fast Flaw(1.7 cm×15 cm)柱層析,用PBS洗脫至A280<0.02,用含0～0.5 mol/L NaCl的PBS梯度洗脫(流速40 mL/h),收集液再經(jīng)HPLC柱層析分離純化得到糖蛋白CFP-a。

此外,根據(jù)糖蛋白糖鏈部分特殊理化性質(zhì),納米離子以其豐富的活性親和位點[50]和特殊結(jié)構已開始逐步應用于糖蛋白的分離與富集[51],還有凝集素親和法、硼酸法、肼化學反應法和免疫法等也有應用。

5　展望

糖蛋白對人類健康作用已被證實,目前可以利用其免疫原性和免疫反應性,將細菌的多糖抗原與蛋白載體通過化學方法制備多糖蛋白結(jié)合疫苗。由于糖基化修飾與疾病的密切關系,利用糖蛋白及糖鏈作為疾病診斷標志物和治療靶標的研究成為了研究熱點,同時也將有更多的生物活性功能被逐漸發(fā)現(xiàn)。海洋動物資源豐富,對海洋動物源性糖蛋白的研究將對未來食品、保健品乃至藥品的開發(fā)有巨大借鑒意義,市場潛力和開發(fā)前景廣闊。

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Research progress of glycoprotein from marine animal

YU Zhi-peng1,WU Si-Jia1,ZHAO Wen-zhu1,*,GUO Hui1,DING Long2,LI Jian-rong1,*,LIU Jing-bo2

(1.College of food science and engineering,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Glycoprotein is a kind of bioactive substance,which is constructed with oligosaccharide chains and peptides by a variety of covalent forms. Natural glycoprotein exhibits physiological activities,such as anti-oxidation,anti-tumor,and enhance immunity. The current work reviewed the research progress of the glycoprotein from marine animals,including the structure,function,preparation and purification of the glycoprotein. Furthermore,the further study of marine animal-derived glycoprotein was addressed,aimed to provide the reference for the development of the glycoprotein.

glycoprotein;extraction;separation and purification;structure

2015-12-04

于志鵬(1984-)，男，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā),E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

趙文竹(1986-)，女，博士，講師，研究方向：營養(yǎng)與功能食品，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。

勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

國家科技支撐課題(2012BAD00B03)；遼寧省科技攻關項目(2015103020)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)13-0376-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.069