劉景煜,李　晨,高錦明,董娟娥,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西楊凌 712100)

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枸杞子總黃酮含量檢測方法優(yōu)化

劉景煜1,李晨1,高錦明2,董娟娥1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西楊凌 712100)

目的:篩選出枸杞子總黃酮適宜的提取及脫色素方法。方法:本研究通過比較考察脫色方法、提取溶劑、提取方法等對枸杞子總黃酮含量檢測方法進(jìn)行優(yōu)化,并對新疆產(chǎn)的15份和寧夏產(chǎn)的40份枸杞子中總黃酮含量進(jìn)行分析。結(jié)果:枸杞子總黃酮提取方法為:用95%乙醇回流提取,將提取液低溫冷藏,除去沉淀,上清液濃縮至近干后用無水甲醇萃取,萃取液用于總黃酮含量分析。該方法可有效去除枸杞子中的水溶性色素。對不同產(chǎn)地枸杞子進(jìn)行分析,結(jié)果表明寧夏產(chǎn)枸杞子總黃酮含量平均為1.134%,變異范圍為0.851%～1.466%;新疆產(chǎn)枸杞子總黃酮含量平均為1.020%,變異范圍為0.888%～1.241%。結(jié)論:該方法可簡單有效的除去水溶性色素以減少其對總黃酮檢測結(jié)果的影響,兩產(chǎn)地間枸杞子總黃酮含量無顯著差異(p>0.05)。

枸杞子,總黃酮,提取,新疆,寧夏

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實(shí),具有滋肝補(bǔ)腎、益精明目等功效[1],在我國寧夏、新疆、甘肅、青海、內(nèi)蒙古等省均有栽培[2]。研究表明枸杞子有抑制癌細(xì)胞增長、降血糖、降血脂、抗氧化、提高免疫力和改善骨髓造血[3-8]等作用。枸杞子中有效成分包括多糖、甜菜堿、總黃酮、類胡蘿卜素、多酚等[9-10]。目前,《中國藥典》(2015版)僅對枸杞子多糖和甜菜堿作了含量限度的規(guī)定。

總黃酮是枸杞子中重要的活性成分之一,有較好的抗氧化、清除自由基、抗炎及抑制血管增生[11-15]等作用。因此,總黃酮也可作為衡量枸杞子品質(zhì)的指標(biāo)之一。目前,總黃酮的含量檢測方法大多是利用黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)上具有的鄰二酚羥基可以與鋁離子絡(luò)合,在堿性條件下形成穩(wěn)定的紅色化合物,且在可見光區(qū)域(大多為510 nm)有較強(qiáng)吸收的原理進(jìn)行。由于枸杞子提取液也為紅色,且在可見光區(qū)有吸收,很大程度上影響了枸杞子總黃酮檢測的準(zhǔn)確性。目前報(bào)道的枸杞子總黃酮的檢測方法僅對脂溶性色素進(jìn)行了脫除[16],枸杞子中還含有大量的水溶性色素,會干擾檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,檢測時(shí)應(yīng)盡量排除水溶性色素的影響。目前枸杞子黃酮的提取方法有回流提取法、超聲波提取法和微波提取法等[17-18]。提取方法不同枸杞子總黃酮提取得率不同,檢測結(jié)果也會有很大差異。因此,有必要對枸杞子總黃酮的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化,建立一種準(zhǔn)確度、加標(biāo)回收率高的枸杞子總黃酮檢測方法。

本研究通過考察脫色方法、提取溶劑、提取方法等對枸杞子總黃酮含量檢測結(jié)果的影響,篩選出能夠準(zhǔn)確反映枸杞子中總黃酮含量的適宜提取和檢測方法,并利用優(yōu)化后的方法對來自寧夏40個(gè)和新疆15個(gè)不同產(chǎn)地的枸杞子樣品中總黃酮含量進(jìn)行分析,旨在為枸杞子中以總黃酮為指標(biāo)的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù),也為枸杞子資源的開發(fā)利用及枸杞子產(chǎn)地的篩選奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料來源及處理產(chǎn)自寧夏(40個(gè))和新疆(15個(gè))不同產(chǎn)地的枸杞子均為寧夏枸杞研究所提供,本研究中對各產(chǎn)地的樣品按數(shù)字順序標(biāo)號。每個(gè)樣品稱取約20 g枸杞子,去除果柄后于105 ℃烘至恒重,冷卻后粉碎,過40目篩,密封保存,備用。

1.1.2主要儀器與試劑DK-S26電熱恒溫水浴鍋上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;101A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FW400-A高速萬能粉碎機(jī)北京中興偉業(yè)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品中國藥品生物制品檢定所;95%乙醇、無水甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取40 mg蘆丁,無水甲醇溶解定容至100 mL,配制成濃度為0. 4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,分別補(bǔ)加無水甲醇至總體積為3 mL,加0.5 mL 5% NaNO2水溶液,搖勻靜置6 min,加0.5 mL 10% Al(NO3)3水溶液,搖勻靜置6 min,加4 mL 4% NaOH水溶液,水定容,搖勻放置15 min。以不添加NaOH溶液(用4 mL蒸餾水代替NaOH溶液)的反應(yīng)液為空白,于紫外-可見光分光光度計(jì)510 nm波長下測各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度。

以吸光度A為橫坐標(biāo),蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:C=0.0958A+0.0044,R2=0.9994。在0.02～0.12 mg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

1.2.2脫色方法選擇

1.2.2.1對照組精密稱取1.0000 g枸杞子粉末,50 mL 80%乙醇回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,定容至100 mL,待測。

1.2.2.2石油醚回流脫脂溶性色素精密稱取1.0000 g枸杞子粉末,石油醚回流脫脂至提取液無色,過濾,殘?jiān)娓珊笥?0 mL 80%乙醇回流提取2次(每次1 h),過濾,合并濾液,定容至100 mL,待測。

1.2.2.3石油醚萃取脫脂溶性色素精密稱取1.0000 g枸杞子粉末,50 mL 80%乙醇回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,減壓回收至近干,用30 mL蒸餾水分散均勻,石油醚萃取至石油醚層無色,水相減壓濃縮至近干,80%乙醇定容至100 mL,待測。

1.2.2.4活性炭吸附脫脂溶性色素精密稱取1.0000 g枸杞子粉,加50 mL 80%乙醇回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,加入0.1 g活性炭,搖勻放置2 h,過濾,濾液用80%乙醇定容至100 mL,待測。

1.2.2.5水溶性色素脫除方法精密稱取1.0000 g枸杞子粉,用50 mL 95%乙醇于80℃回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,濾液4 ℃冷藏2 h,過濾。濾液減壓濃縮至近干,用無水甲醇定容至100 mL。搖勻,待測。

1.2.3提取溶劑對總黃酮檢測結(jié)果的影響精密稱取1.0000 g枸杞子粉,分別用50 mL 80%、95%乙醇于80 ℃回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,濾液4 ℃冷藏2 h,過濾。80%乙醇提取物用80%乙醇定容至100 mL;95%乙醇提取物的濾液減壓濃縮至近干,用無水甲醇定容至100 mL。搖勻,測定總黃酮含量及加標(biāo)回收率。

1.2.4提取方法對總黃酮檢測結(jié)果的影響精密稱取1.0000 g枸杞子粉末,按照崔大明等的方法[19],用50 mL 95%乙醇25 ℃超聲提取2次,0.5 h/次;80 ℃回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,減壓濃縮至近干,用無水甲醇定容至100 mL。搖勻,測定總黃酮含量及加標(biāo)回收率。

1.2.5枸杞子總黃酮含量檢測方法學(xué)考察

1.2.5.1供試液的制備精密稱取1.0000 g枸杞子樣品,50 mL 95%的乙醇80 ℃水浴回流提取2次,1 h/次,過濾,合并濾液,提取液4 ℃冷藏2 h,過濾,濾液減壓濃縮至近干,無水甲醇分次溶解濃縮物,過濾,濾液用無水甲醇定容到100 mL,搖勻待測。

1.2.5.2精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液2.0 mL于10 mL容量瓶中,顯色、測吸光度,重復(fù)6次。

1.2.5.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密稱取6份同一枸杞子樣品1.0000 g,制備供試品溶液,計(jì)算枸杞子中總黃酮含量。

1.2.5.4加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取6份已知含量的枸杞子樣品1.0000 g,分別加入11.0 mg蘆丁標(biāo)品,制備供試品溶液,計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.5.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別將供試品顯色液、供試品提取液、遮光處理的供試品提取液放置不同時(shí)間,每隔0.5 h測定一次吸光度,考察樣品的穩(wěn)定性。

1.2.6樣品中總黃酮含量測定處理不同產(chǎn)地的樣品,得到供試液,顯色,測定吸光度,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到枸杞子中總黃酮的含量(X),公式如下:

式中:X為總黃酮的含量(%);C為通過標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算的樣品比色液中的蘆丁濃度(mg/mL);v為比色液體積(mL);d為稀釋比例;m為樣品的質(zhì)量(g)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析,設(shè)置顯著水平為p<0.05,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

2　結(jié)果與討論

2.1脫色方法對枸杞子總黃酮檢測結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)對幾種脂溶性色素脫除方法和水溶性色素脫除方法處理前后枸杞子中總黃酮含量差異性進(jìn)行了考察,結(jié)果見圖1。通過SPSS 19.0方差分析發(fā)現(xiàn),脂溶性色素脫除各組總黃酮含量與對照組相比均無顯著性差異(p>0.05),說明石油醚脫色、活性炭吸附脫色雖然除去了枸杞子中的脂溶性色素,但均不能有效去除枸杞子中影響總黃酮檢測結(jié)果的有色物質(zhì)。用脫除水溶性色素的方法處理后所檢測的總黃酮含量顯著低于對照組。枸杞子紅色素為強(qiáng)極性分子,有弱堿性[20],其水溶液在波長520 nm處有最大吸收[21],在強(qiáng)堿性溶液中不穩(wěn)定,隨pH增加吸光度會增大[22]。用“亞硝酸銨-硝酸鋁”法測定總黃酮含量的顯色液最大吸收波長在510 nm處,因?yàn)轱@色劑中有氫氧化鈉,枸杞子水溶性紅色素的存在會干擾枸杞子總黃酮的檢測,導(dǎo)致檢測結(jié)果偏大。

表1　提取溶劑對枸杞子總黃酮檢測結(jié)果的影響

圖1　脫脂方法對枸杞子總黃酮檢測結(jié)果的影響Fig.1　Effect of degreasing method on the contents of total flavonoids of L. Barbarum注:*表示與對照組相比差異顯著(p<0.05)。

2.2提取溶劑對枸杞子總黃酮檢測結(jié)果的影響

本實(shí)驗(yàn)以加標(biāo)回收率為考察指標(biāo),對文獻(xiàn)中常用的提取溶劑(80%乙醇)與95%乙醇的提取效果進(jìn)行了比較。以80%乙醇和95%乙醇作為提取溶劑時(shí),檢測得到樣品中總黃酮的含量分別為1.21%和1.10%。向樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品后,再分別用80%乙醇和95%乙醇提取、檢測,經(jīng)計(jì)算加標(biāo)回收率發(fā)現(xiàn)(表1),以95%乙醇為提取溶劑,檢測樣品總黃酮含量,加標(biāo)回收率均在95%～105%范圍內(nèi),符合檢測要求;而以80%乙醇為提取溶劑,檢測的加標(biāo)回收率均大于110%,檢測結(jié)果偏高,不符合檢測要求。充分證實(shí)了前文“水溶性紅色素導(dǎo)致檢測結(jié)果偏大”的結(jié)論。本研究利用95%乙醇提取枸杞子中總黃酮,冷藏靜置后發(fā)現(xiàn)有大量紅色沉淀析出,沉淀可能是回流過程中溶于熱乙醇的色素,溫度降低使其溶解度降低而析出。當(dāng)用80%乙醇提取時(shí),將提取液冷藏靜置后無紅色沉淀析出,進(jìn)一步證實(shí)了枸杞子中的有色雜質(zhì)多為水溶性,不溶于高濃度乙醇。為了除去干擾總黃酮含量檢測的有色雜質(zhì),將經(jīng)過冷卻除去大量紅色素的提取液濃縮至近干,用無水甲醇萃取,得到的溶液用于總黃酮含量檢測,以減少雜質(zhì)的溶出。本法完全避免了水溶性色素對檢測結(jié)果的干擾,使檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3提取方法對枸杞子總黃酮含量的影響

本實(shí)驗(yàn)比較了回流提取和超聲波提取對枸杞子總黃酮含量的影響,結(jié)果見圖2。方差分析發(fā)現(xiàn)回流提取法的總黃酮含量顯著高于超聲波提取法的含量(p<0.05),因此選取回流提取法作為枸杞子總黃酮的提取方法。枸杞子總黃酮常用提取方法有微波提取法、回流提取法與超聲波提取法[17-18]。采用微波提取時(shí),由于在微波爐中無法進(jìn)行溶劑回流,在加熱過程中乙醇會不斷揮發(fā)對溶劑濃度無法控制,無可比性,本文沒有考察微波提取法。本文發(fā)現(xiàn),回流提取法提取枸杞子總黃酮的含量比超聲波提取法高。一般來說,回流過程中細(xì)胞內(nèi)外成分達(dá)到濃度平衡所需的時(shí)間較長,在提取較短時(shí)間和較低溫度下,超聲法的提取效率高于回流提取法。但在大功率或長時(shí)間的超聲提取條件下,會破壞成分的結(jié)構(gòu)及活性[23],同時(shí),由于超聲波的熱效應(yīng)使提取溫度難以保持恒定不變。通過優(yōu)化回流提取的條件,可以使目標(biāo)成分較完全提取出來,可作為提取黃酮類化合物的首選方法。

圖2　提取方法對枸杞子總黃酮提取得率的影響Fig.2　Effect of extraction method on the contents of total flavonoids of L. barbarum

2.4枸杞子總黃酮含量檢測方法考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)計(jì)算,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.65%,顯示儀器精密度良好。

表2　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。經(jīng)計(jì)算,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.41%,符合分析要求,顯示該方法重復(fù)性好。

表3　重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)加標(biāo)回收率結(jié)果見表4。按照本實(shí)驗(yàn)建立的方法測定總黃酮含量,各樣品加標(biāo)回收率均在95%～105%之間,平均加標(biāo)回收率為99.63%,RSD=1.33%,符合檢測要求,顯示本方法在提取過程中總黃酮損耗少,準(zhǔn)確度高。

表4　加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。表明隨著放置時(shí)間的延長,各處理組的吸光度均會降低。供試液經(jīng)遮光保存顯色后吸光度在3.5 h內(nèi)較穩(wěn)定;供試液未遮光保存顯色后吸光度在1.5 h內(nèi)較穩(wěn)定;供試品顯色液吸光度在2.5 h開始明顯降低。綜上可知,供試品溶液應(yīng)遮光保存,且在3.5 h內(nèi)完成測量,顯色液應(yīng)在2.5 h內(nèi)測定其吸光度。

圖3　穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3　The results of stability test

2.5不同產(chǎn)地枸杞子總黃酮含量分析

本研究對寧夏及新疆產(chǎn)枸杞子總黃酮含量進(jìn)行分析比較,結(jié)果見圖4～圖6。寧夏產(chǎn)枸杞子總黃酮含量(1.134%)略高于新疆產(chǎn)枸杞子(1.020%),兩產(chǎn)地枸杞子總黃酮含量差異不顯著(p>0.05)。

圖4　寧夏及新疆產(chǎn)枸杞子總黃酮含量比較Fig.4　Comparison of total flavonoids contents of L. barbarum from Ningxia and Sinkiang province

圖5　新疆產(chǎn)枸杞子各樣品中總黃酮含量Fig.5　The contents of total flavonoids of L. barbarum from Sinkiang province注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)，圖6同。

圖6　寧夏產(chǎn)枸杞子各樣品中總黃酮含量Fig.6　The contents of flavonoids of L. barbarum from Ningxia province

寧夏不同產(chǎn)地枸杞子總黃酮含量平均為1.134%,變異范圍0.851%～1.466%,分為4個(gè)差異水平。其中N-22號、N-23號、N-28號和N-31號枸杞子中總黃酮含量最高(a水平),變異范圍為1.352%～1.459%;而N-2號、N-11號、N-12號、N-16號、N-39號枸杞子樣品中總黃酮含量處于最低水平(d水平),變異范圍為0.860%～0.980%。方差分析結(jié)果顯示,寧夏產(chǎn)枸杞子總黃酮含量差異顯著(p<0.05),各產(chǎn)地枸杞子總黃酮含量差異較大。

新疆不同產(chǎn)地枸杞子總黃酮含量平均為1.020%,變異范圍為0.888%～1.241%,分為3個(gè)差異水平。其中X-10號、X-11號枸杞子中總黃酮含量最高(a水平),變異范圍為1.159%～1.241%;而X-1號、X-2號、X-3號、X-5號、X-14號枸杞子總黃酮含量處于低水平(c水平),變異范圍0.888%～0.966%。方差分析結(jié)果顯示,新疆產(chǎn)枸杞子總黃酮含量差異顯著(p<0.05)。

上述結(jié)果表明,新疆產(chǎn)枸杞子總黃酮含量略低于寧夏產(chǎn)枸杞子,但無顯著性差異(p>0.05),但寧夏產(chǎn)的枸杞子質(zhì)量參差不齊,不是所有產(chǎn)自寧夏的都是優(yōu)質(zhì)枸杞子。應(yīng)制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)格控制枸杞子質(zhì)量,防治以次充好現(xiàn)象。

3　結(jié)論

篩選出能夠準(zhǔn)確反映枸杞子中總黃酮含量的適宜提取和檢測方法:用95%乙醇回流提取枸杞子總黃酮,將提取液低溫冷藏,除去沉淀,上清液濃縮至近干后用無水甲醇萃取,萃取液用NaNO2-Al(NO3)3比色法檢測總黃酮含量。該方法準(zhǔn)確度和精密度高,重現(xiàn)性好,可以簡單有效的除去水溶性色素以減少其對總黃酮檢測結(jié)果的影響,為枸杞子中以總黃酮為指標(biāo)的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù),也為枸杞子資源的開發(fā)利用及枸杞子產(chǎn)地的篩選奠定基礎(chǔ)。

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Optimization on test method of total flavonoids fromLyciumbarbarumL.

LIU Jing-yu1,LI Chen1,GAO Jin-ming2,DONG Juan-e1,*

(1.College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.College of Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,China)

In this study,determination methodology of total flavonoids fromLyciumbarbarumwas optimized employing decolorization,extraction solvent,and extraction method. The optimal conditions were determined as follows:theLyciumbarbarumwas extracted with reflux by 95% ethyl alcohol. Subsequently,the obtained extracting solution was refrigerated to remove the precipitate and the up-phase was concentrated. Furthermore,the concentrated solution was purified by extracting with absolute methanol. The purified solution was subsequently used for detecting the total flavonoids. With the optimized determination methodology,the average content of total flavonoids was 1.134% deriving from NingxiaLyciumbarbarumwhile 1.020% from Sinkiang,and the variation range were 0.851% to 1.466% and 0.888% to 1.241%,respectively. This research can effectively remove the water soluble pigment which influenced the determination accuracy of total flavonoids.

LyciumbarbarumL.;general flavones;extraction;Sinkiang;Ningxia

2015-12-08

劉景煜(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥質(zhì)量控制，E-mail：liujingyu1023@163.com。

董娟娥(1968- )，女，博士，教授，主要從事藥用植物次生代謝和天然產(chǎn)物開發(fā)利用的教學(xué)和研究工作，E-mail：dzsys@nwsuaf.edu.cn。

TS201.1

B

1002-0306(2016)13-0304-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.054