王　琳,王　雪,田靜秒,宋云飛,閆葉娜

(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司,北京 101200)

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表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)保健品中的鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍

王琳,王雪,田靜秒,宋云飛,閆葉娜

(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司,北京 101200)

目的:建立一種用于檢測(cè)鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍的快速分析方法。方法:采用表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)分析方法檢測(cè)鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍。結(jié)果:該方法檢測(cè)鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍,檢測(cè)濃度分別為4、4、1 μg/mL。該方法的檢測(cè)結(jié)果受pH的影響,pH2.0時(shí),上述三種降糖藥的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著。該方法可以用于檢測(cè)保健品中添加的鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍,檢測(cè)濃度分別為200、200、100 μg/mL。結(jié)論:該方法操作簡(jiǎn)便,所用時(shí)間短,前處理與檢測(cè)時(shí)間一共只需15 min,適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

表面增強(qiáng)拉曼光譜,鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮,鹽酸苯乙雙胍,保健品

表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(SERS)是拉曼光譜技術(shù)中的一種,它發(fā)展于20世紀(jì)70年代。吸附在粗糙化金屬表面的化合物,由于化學(xué)作用與電磁作用,使被測(cè)定物的拉曼散射產(chǎn)生極大的增強(qiáng)效應(yīng)[1]。其增強(qiáng)因子可達(dá)103～107,已發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生SERS的金屬有金、銀等少數(shù)金屬。此技術(shù)具有選擇性好和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),實(shí)際檢測(cè)限可達(dá)10-12g級(jí)。因此,SERS技術(shù)作為一種新興的定性與定量檢測(cè)技術(shù),近年來(lái)引起了極大的重視,取得了若干研究進(jìn)展[2-4]。

不法分子在降糖中成藥和保健食品中非法摻入療效確切、價(jià)廉的降糖化學(xué)成分,對(duì)治療帶來(lái)隱患,對(duì)健康造成嚴(yán)重危害,也給非法添加化學(xué)成分的檢測(cè)提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。鹽酸苯乙雙胍與鹽酸吡格列酮等都是聲稱有輔助降血糖功能的保健品中非法添加的常見(jiàn)西藥品種[5]。表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)保健品中非法添加降糖藥具有操作簡(jiǎn)單,快速和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。張雁等人研究馬來(lái)酸羅格列酮在不同激發(fā)光波長(zhǎng)以及不同酸堿度條件下的表面增強(qiáng)拉曼光譜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于藥物分子-銀膠體系785 nm激發(fā)時(shí),酸性條件下的SERS效應(yīng)最為明顯[6]。張雁等人還發(fā)現(xiàn)偏酸性的pH條件有利于馬來(lái)酸羅格列酮與鹽酸吡咯列酮的鑒別[7]。譚忠謀等人發(fā)現(xiàn)偏堿性的pH條件有利于馬來(lái)酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍的鑒別[8]。趙娟等人發(fā)現(xiàn)偏堿性的pH條件有利于鹽酸苯乙雙胍與鹽酸二甲雙胍的鑒別[9]。

上述研究以檢測(cè)降糖藥物的溶液為主,并沒(méi)有對(duì)實(shí)際保健品中的降糖藥物進(jìn)行檢測(cè)。本文采用膠體金顆粒作為表面增強(qiáng)拉曼光譜的增強(qiáng)試劑,研究了不同pH對(duì)鹽酸羅格列酮,鹽酸吡咯列酮與鹽酸苯乙雙胍SERS檢測(cè)結(jié)果的影響,并且在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了檢測(cè)保健品中添加的降糖藥的方法,研究了采用SERS技術(shù)檢測(cè)保健品中非法添加的降糖藥的可行性,為進(jìn)一步研究SERS技術(shù)在保健品安全領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鹽酸苯乙雙胍(CAS:834-28-6),鹽酸吡格列酮(CAS:112529-15-4),鹽酸羅格列酮(CAS:302543-62-0)標(biāo)準(zhǔn)品采購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院;氯金酸與檸檬酸三鈉采購(gòu)于北京科實(shí)玻璃儀器有限公司;其他試劑采購(gòu)于西隴化工股份有限公司;消渴靈片(片劑)、降糖膠囊(膠囊)、消渴茶(茶劑)、消渴丸(丸劑)均為市售保健品。

圖1　降糖藥結(jié)構(gòu)Fig.1　Structural formula注:1:鹽酸苯乙雙胍;2:鹽酸吡格列酮;3:鹽酸羅格列酮。

拉曼光譜檢測(cè)儀(IDRaman mini)手持式拉曼光譜檢測(cè)儀,海洋光學(xué)公司激發(fā)光波長(zhǎng)785 nm。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1膠體金制備采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法制備膠體金溶液[10],配制100 mL濃度為0.02%的氯金酸溶液,邊攪拌邊加熱至沸騰,快速加入3 mL的檸檬酸三鈉溶液,觀察溶液顏色變化,溶液顏色完全變?yōu)榧t色后開(kāi)始計(jì)時(shí),5 min后停止加熱,使其緩慢冷卻至室溫,加超純水補(bǔ)足體積至100 mL。

1.2.2表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)步驟首先,檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼圖譜,以該圖譜作為標(biāo)準(zhǔn)圖譜;接著,將80 μL樣品與320 μL增強(qiáng)試劑放入樣品瓶中,混合,搖勻;再將樣品瓶放入拉曼檢測(cè)儀的樣品池中,獲取樣品的拉曼圖譜,將樣品的拉曼圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比,以能否觀察到特征峰作為能否檢出的判斷依據(jù)。

1.2.3研究pH對(duì)SERS檢測(cè)降糖藥的影響取膠體金溶液,不加入待測(cè)物質(zhì),按照1.2.2的方法進(jìn)行檢測(cè)。將pH調(diào)節(jié)到2.0或12.0,之后按照1.2.2的方法進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,使用甲醇溶解降糖藥,配制濃度為4 μg/mL的鹽酸吡格列酮與鹽酸羅格列酮溶液,以及1 μg/mL的鹽酸苯乙雙胍溶液,將上述溶液與膠體金溶液按照體積比1∶4的比例混合均勻,按照1.2.2的方法進(jìn)行檢測(cè)。將pH調(diào)節(jié)到2.0或12.0,之后按照1.2.2的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4研究SERS檢測(cè)保健品中降糖藥的方法取(0.1±0.02) g保健品(片劑或丸劑研碎后稱量,膠囊劑取內(nèi)容物稱量,茶劑直接稱量),添加一定濃度的降糖藥,加入2 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩5 min。4000 r/min離心5 min。取0.5 mL上清液,加入0.5 mL鹽酸溶液(濃度:0.3 mol/L)。渦旋振蕩2 min。靜置分層后,取下層溶液,與膠體金溶液按照體積比1∶4的比例混合均勻,按照1.2.2的方法進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1pH對(duì)SERS檢測(cè)降糖藥的影響

膠體金溶液的拉曼圖譜見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),膠體金的拉曼圖譜在738,991,1176,1200,1207,1243,1310 cm-1等處沒(méi)有明顯的峰。

圖2　膠體金拉曼圖譜Fig.2　Raman atlas of colloidal gold注:1:pH7.0;2:pH12.0;3:pH2.0。

鹽酸吡格列酮的拉曼圖譜見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn),檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)pH至2.0,可以觀察到鹽酸吡咯列酮的拉曼特征峰,波數(shù)分別為1207,1243,1310 cm-1,其中1207 cm-1可能為對(duì)位二取代苯的骨架振動(dòng)峰,1243 cm-1可能為烷基芳香基醚的伸縮振動(dòng)峰,1500 cm-1右側(cè)的峰可能為苯衍生物的環(huán)伸縮峰[11]。檢測(cè)時(shí)pH為7.0或12.0,則無(wú)法觀察到上述特征峰。推測(cè)調(diào)節(jié)pH至2.0,能夠引起或促進(jìn)膠體金對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效應(yīng)。

圖3　鹽酸吡格列酮拉曼圖譜Fig.3　SERS atlas of Pioglitazone hydrochloride注:1:鹽酸吡格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH7.0);2:鹽酸吡格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH12.0);3:鹽酸吡格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH2.0);4:鹽酸吡格列酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)拉曼圖譜(固體)。

鹽酸羅格列酮的拉曼圖譜見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)pH至2.0,可以觀察到鹽酸羅格列酮的拉曼特征峰,波數(shù)分別為738,1176,1207,1258 cm-1,其中738 cm-1可能為單取代苯的碳?xì)湔駝?dòng)峰,1176 cm-1和1207 cm-1可能為對(duì)位二取代苯的骨架振動(dòng)峰[11]。檢測(cè)時(shí)pH為7.0或12.0,則無(wú)法觀察到上述特征峰。推測(cè)調(diào)節(jié)pH至2.0,能夠引起或促進(jìn)膠體金對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效應(yīng)。

圖4　鹽酸羅格列酮拉曼圖譜,Fig.4　SERS atlas of Rosiglitazone hydrochloride注:1:鹽酸羅格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH7.0);2:鹽酸羅格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH12.0);3:鹽酸羅格列酮SERS圖譜(溶液,濃度4 μg/mL,pH2.0);4:鹽酸羅格列酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜(固體)。

鹽酸苯乙雙胍的拉曼圖譜見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn),檢測(cè)時(shí)調(diào)節(jié)pH至2.0,可以觀察到鹽酸羅格列酮的拉曼特征峰,波數(shù)分別為991,1200 cm-1,其中991 cm-1可能為單取代苯三角形環(huán)呼吸峰,1200 cm-1可能為環(huán)振動(dòng)峰[11]。檢測(cè)時(shí)pH為7.0或12.0,則無(wú)法觀察到上述特征峰。推測(cè)調(diào)節(jié)pH至2.0,能夠引起或促進(jìn)膠體金對(duì)拉曼光譜的增強(qiáng)效應(yīng)。

圖5　鹽酸苯乙雙胍拉曼圖譜 Fig.5　SERS atlas of Phenformin hydrochloride注:1:鹽酸苯乙雙胍SERS圖譜(溶液,濃度1 μg/mL,pH12.0);2:鹽酸苯乙雙胍SERS圖譜(溶液,濃度1 μg/mL,pH7.0);3:鹽酸苯乙雙胍SERS圖譜(溶液,濃度1 μg/mL,pH2.0);4:鹽酸苯乙雙胍標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜(固體)。

待測(cè)物質(zhì)的表面增強(qiáng)圖譜,與待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜有區(qū)別,有些特征峰消失,有些特征峰發(fā)生位移,有些特征峰強(qiáng)度發(fā)生變化。推測(cè)待測(cè)物質(zhì)在溶液中濃度較低,拉曼效應(yīng)較弱,因此有些特征峰消失。推測(cè)待測(cè)物質(zhì)與膠體金顆粒表面發(fā)生相互作用,拉曼振動(dòng)模式有所改變,因此有些特征峰發(fā)生位移或強(qiáng)度發(fā)生變化。

酸性條件下,待測(cè)物質(zhì)的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著。膠體金對(duì)待測(cè)物質(zhì)拉曼散射的增強(qiáng)機(jī)制,與化學(xué)鍵效應(yīng)(來(lái)自于吸附分子與金屬的復(fù)合、成鍵)有關(guān),也與電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)有關(guān)。推測(cè)溶液pH變?yōu)樗嵝?影響了待測(cè)物質(zhì)的分子的電性與電荷分布,從而影響了待測(cè)物質(zhì)與膠體金顆粒表面的吸附基團(tuán)或吸附模式[6],以及待測(cè)物質(zhì)與膠體金顆粒的拉曼共振效應(yīng),因此使膠體金顆粒對(duì)待測(cè)物質(zhì)拉曼散射的表面增強(qiáng)作用進(jìn)一步加強(qiáng)。

本方法檢測(cè)鹽酸吡格列酮的檢測(cè)濃度為4 μg/mL,檢測(cè)鹽酸羅格列酮的檢測(cè)濃度為4 μg/mL,檢測(cè)鹽酸苯乙雙胍的檢測(cè)濃度為1 μg/mL。

2.2檢測(cè)保健品中的降糖藥

市售保健品中不添加降糖藥標(biāo)準(zhǔn)品,不同劑型的保健品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn),市售保健品的拉曼圖譜在738,991,1176,1200,1207,1243,1310 cm-1等處沒(méi)有明顯的峰。

圖6　未添加降糖藥的保健品拉曼圖譜Fig.6　SERS atlas of health care products without additive注:1:片劑;2:膠囊;3:茶劑;4:丸劑,圖7～圖9同。

市售保健品中添加鹽酸吡咯列酮,添加濃度為200 μg/g(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該濃度可以觀察到拉曼特征峰,而且特征峰較明顯),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可見(jiàn),可以觀察到鹽酸吡格列酮的拉曼特征峰,波數(shù)分別為1207,1243,1310 cm-1。說(shuō)明該方法可以檢測(cè)保健品(包括片劑,膠囊,茶劑與丸劑)中非法添加的鹽酸吡格列酮。

圖7　保健品中鹽酸吡咯列酮的拉曼圖譜Fig.7　SERS atlas of Pioglitazonehydrochloride in health care products

市售保健品中添加鹽酸羅格列酮,添加濃度為200 μg/g(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該濃度可以觀察到拉曼特征峰,而且特征峰較明顯),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn),可以觀察到鹽酸羅格列酮的拉曼特征峰,波數(shù)分別為738,1176,1207,1258 cm-1。說(shuō)明該方法可以檢測(cè)保健品(包括片劑,膠囊,茶劑與丸劑)中非法添加的鹽酸羅格列酮。

圖8　保健品中鹽酸羅格列酮的拉曼圖譜Fig.8　SERS atlas of Rosiglitazonehydrochloride in health care products

市售保健品中添加鹽酸苯乙雙胍,片劑和膠囊添加濃度為40 μg/g(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該濃度可以觀察到拉曼特征峰,而且特征峰較明顯),茶劑和丸劑添加濃度為100 μg/g(根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該濃度可以觀察到拉曼特征峰,而且特征峰較明顯),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可見(jiàn),可以觀察到鹽酸苯乙雙胍的拉曼特征峰,波數(shù)為991 cm-1。說(shuō)明該方法可以檢測(cè)保健品(包括片劑,膠囊,茶劑與丸劑)中非法添加的鹽酸苯乙雙胍。

圖9　保健品中鹽酸苯乙雙胍的拉曼圖譜Fig.9　SERS atlas of Rosiglitazonehydrochloride in health care products

保健品中待測(cè)物質(zhì)的特征峰的強(qiáng)度較低,可能原因?yàn)楸＝∑分械哪承┪镔|(zhì)干擾待測(cè)物質(zhì)在膠體金表面的吸附,從而降低了膠體金顆粒對(duì)待測(cè)物質(zhì)的拉曼散射的表面增強(qiáng)效應(yīng)。

本方法檢測(cè)保健品中鹽酸吡格列酮的檢測(cè)濃度為200 μg/g,檢測(cè)保健品中鹽酸羅格列酮的檢測(cè)濃度為200 μg/g,檢測(cè)保健品中鹽酸苯乙雙胍的檢測(cè)濃度為40 μg/g(片劑與膠囊)或100 μg/g(茶劑與丸劑)。

3　結(jié)論

本文研究了SERS在檢測(cè)保健品中降糖藥方面的應(yīng)用。本文通過(guò)研究pH對(duì)SERS檢測(cè)結(jié)果的影響,發(fā)現(xiàn)pH為2.0時(shí),鹽酸吡咯列酮,鹽酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍的表面增強(qiáng)拉曼效應(yīng)較顯著。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究保健品中降糖藥的檢測(cè)方法提供了啟示。

表面增強(qiáng)拉曼光譜分析法選擇性好,靈敏度高,是很有發(fā)展前景的檢測(cè)技術(shù)。目前,該技術(shù)在食品安全領(lǐng)域檢測(cè)實(shí)際樣品的相關(guān)報(bào)道較少,有研究表明SERS技術(shù)可以用于檢測(cè)谷物中的苯甲酮[12]與果汁中的有機(jī)硫殺菌劑[13]。本文在保健品中添加降糖藥,通過(guò)一系列前處理步驟將降糖藥純化,并且溶解在酸性溶劑中,再與增強(qiáng)劑膠體金溶液混合,最后使用手持式拉曼光譜儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明,該方法可以檢測(cè)保健品中添加的鹽酸吡格列酮、鹽酸羅格列酮和鹽酸苯乙雙胍,而且靈敏度高,方法簡(jiǎn)單,所用時(shí)間少,前處理與檢測(cè)時(shí)間一共只需15 min,適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。該研究為SERS技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供了進(jìn)一步的支持。

[1]Martin Thomas,Stefan Mühlig,Tanja Deckert-Gaudig,et al. Distinguishing chemical and electromagnetic enhancement in surface-enhanced Raman spectra:The case of para-nitrothiophenol[J]. Journal of Raman Spectroscopy,2013,44(11):1497-1505.

[2]Bei Nie,Chaolan He,Lijuan Liu. Surface-enhanced Raman scattering within silver-nanoparticle-decorated nanometric apertures[J]. Journal of Raman Spectroscopy,2013,44(11):1512-1517.

[4]Irene Izquierdo-Lorenzo,José Vicente García-Ramos,Santiago Sanchez-Cortes. Vibrational characterization and surface enhanced Raman scattering detection of probenecid doping drug[J]. Journal of Raman Spectroscopy,2013,44(10):1422-1427.

[5]關(guān)于發(fā)布保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單(第一批)的通知[S]. 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,2012:1-2.

[6]張雁,尹利輝,陳亞飛,等. 馬來(lái)酸羅格列酮的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J].藥物分析雜志,2011,31(9):1720-1725.

[7]張雁,尹利輝,金少鴻. 馬來(lái)酸羅格列酮與鹽酸吡咯列酮在納米銀表面共吸附的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J]. 藥物分析雜志,2012,32(12):2162-2167.

[8]譚忠謀,尹利輝,張雁.馬來(lái)酸羅格列酮與鹽酸苯乙雙胍納米銀表面共吸附的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J]. 中國(guó)藥師,2013,16(6):817-820.

[9]趙娟,張雁. 鹽酸苯乙雙胍與鹽酸二甲雙胍在納米銀表面共吸附的表面增強(qiáng)拉曼光譜研究[J]. 中國(guó)藥師,2013,16(12):1775-1777.

[10]Frens G. Preparation gold dispersions of varying particle size:controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions[J]. Nature Physical Science,1973,241:20-22.

[11]朱自瑩,顧仁敖,陸天虹. 拉曼光譜在化學(xué)中的應(yīng)用[M]. 東北大學(xué)出版社,1998:295-301.

[12]Enrica Droghetti,Francesco P. Nicoletti,Luca Guandalini,et al. SERS detection of benzophenones on viologen functionalized Ag nanoparticles:application to breakfast cereals[J]. Journal of Raman Spectroscopy,2013,44(10):1428-1434.

[13]Benjamin Saute,Radha Narayanan. Solution-based SERS method to detect dithiocarbamate fungicides in different real-world matrices[J]. Journal of Raman Spectroscopy,2013,44(11):1518-1522.

Surface-Enhanced Raman Spectroscopy(SERS)assay method for pioglitazone hydrochloride,rosiglitazone hydrochloride and phenformin hydrochloride in health care products

WANG Lin,WANG Xue,TIAN Jing-miao,SONG Yun-fei,YAN Ye-na

(Beijing Purkinje General Instrument Co.,Ltd,Beijing 101200,China)

Objective:A fast assay method for pioglitazone hydrochloride,rosiglitazone hydrochloride and phenformin hydrochloride was developed. Method:A Surface-Enhanced Raman Spectroscopy(SERS)assay method was used to detect the pioglitazone hydrochloride,rosiglitazone hydrochloride and phenformin hydrochloride. Result:The concentration of the SERS method for pioglitazone hydrochloride and rosiglitazone hydrochloride was 4 μg/mL,and for phenformin hydrochloride was 1 μg/mL. The SERS spectrums under three different pH conditions were studied,and the results showed that the pH of the system had obvious effect on the SERS,and the SERS was most enhanced when the pH was 2.0. For detecting health care products,the concentration of the SERS method for pioglitazone hydrochloride and rosiglitazone hydrochloride was 200 μg/mL,and for phenformin hydrochloride was 100 μg/mL. The SERS method was simple and rapid and could be finished in fifteen minutes. Conclusion:The SERS method could be a convenient tool for field detection of health care products.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy(SERS);pioglitazone hydrochloride;rosiglitazone hydrochloride;phenformin hydrochloride;health care products

2015-11-02

王琳(1980-)，男,碩士研究生,工程師,研究方向:快速診斷檢測(cè)技術(shù)的研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,E-mail:lin.wang@pgeneral.com.cn。

TS207

A

1002-0306(2016)13-0295-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.052