賈建穎,劉常金,*,王浩宇,李　楠,駱　琦,王富鑫

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.泰安市信通農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,泰安 271400)

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響應(yīng)面法優(yōu)化香椿中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的超聲波輔助提取條件

賈建穎1,劉常金1,*,王浩宇1,李楠1,駱琦1,王富鑫2

(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.泰安市信通農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司,泰安 271400)

采用響應(yīng)面分析方法對(duì)香椿中的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)超聲波輔助提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),以中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法,將GGT的提取量作為響應(yīng)值來進(jìn)行回歸分析。得到超聲輔助提取GGT的最佳條件:提取功率260 W、提取時(shí)間28 min、緩沖液體積240 mL(樣品質(zhì)量10.00 g)。在上述提取條件下,提取液中GGT的含量達(dá)到7.188 U/g,與模型預(yù)測(cè)值基本相符,說明該優(yōu)化方法合理可行。

香椿,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶,超聲輔助提取,響應(yīng)面法

香椿(Toonasinensis)是一種有特殊芳香風(fēng)味的中國傳統(tǒng)樹生植物,屬于楝科,廣泛地分布于中國,可食用,亦可入藥,并且香椿特有的風(fēng)味使其成為了家喻戶曉的菜品[1]。李聚英[2]、劉常金等[3]針對(duì)香椿的特殊風(fēng)味采用頂空固相微萃取法對(duì)香椿揮發(fā)性成分進(jìn)行富集,通過氣相色譜嗅聞聯(lián)用質(zhì)譜法(GC-O-MS)研究了香椿香氣的組成成分,并確定了其中兩種含硫化合物,2-巰基-3,4-二甲基-2,3-氫化噻吩和2-甲基-3,5-二甲基-2,3-二氫噻吩是香椿的特征性香氣物質(zhì)。在李家笑等人[4]的報(bào)道中,γ-谷氨酰-丙烯基巰基甘氨酸(產(chǎn)生香椿風(fēng)味的前體物質(zhì))通過酶促反應(yīng)得到谷氨酸和易水解產(chǎn)生丙烯基硫醇、氨和乙醛酸的中間物,丙烯基硫醇經(jīng)過進(jìn)一步反應(yīng)后得到香椿風(fēng)味物質(zhì)。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT,EC 2.3.2.2)能夠特異性地催化γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng),生成谷氨酸和氨,符合上述反應(yīng)路徑,因此將該酶作為研究材料,進(jìn)行分離提取后,可進(jìn)一步驗(yàn)證其在香椿風(fēng)味產(chǎn)生過程中的作用,對(duì)香椿風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)理的研究具有重要意義。

目前對(duì)植物中的GGT研究很少,多集中于微生物及動(dòng)物提取,而關(guān)于其植物提取方法的研究則更少。因此,對(duì)香椿中GGT的提取方法進(jìn)行研究,對(duì)于進(jìn)一步香椿風(fēng)味的機(jī)理研究具有意義。

已知GGT是谷胱甘肽的代謝路徑中起著主要作用的酶[5],該酶主要是存在于細(xì)胞膜的外表面,通過亞基和細(xì)胞膜相連[6]。超聲波是廣泛應(yīng)用的提取方法之一,超聲波提取法用于蛋白質(zhì)的提取也有明顯優(yōu)勢(shì)。超聲波會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈振動(dòng)、空化效應(yīng)以及攪拌作用等,這些作用可以促進(jìn)提取成分的加速釋放,從而提高提取率,縮短提取時(shí)間[7]。本實(shí)驗(yàn)采用了超聲輔助提取法改進(jìn)香椿中GGT的提取工藝,為深入研究GGT及香椿中風(fēng)味的產(chǎn)生機(jī)理提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香椿嫩葉(Toonasinensis.A.Juss.)天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃;三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Solarbio公司;雙甘肽購自上海金穗生物科技有限公司;L-γ-谷酰胺-對(duì)硝基苯胺購自生工生物工程(上海)股份有限公司;β-巰基乙醇購自Sigma公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

752N單光束紫外可見分光光度計(jì)上海菁華科技儀器有限公司;Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)Thermo公司;真空冷凍干燥機(jī)北京德天佑科技發(fā)展有限公司;SB25-12超聲波機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)篩60目上海陸順興工廠制造;400gHK-08粉碎機(jī)廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;FA1104A電子天平上海精天電子儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州普天儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品提取植物樣品經(jīng)真空冷凍干燥,粉碎機(jī)粉碎,過60目篩,備用。精確稱取1.000 g樣品粉末,置于100 mL的錐形瓶中,加入50 mL的Tris-HCl緩沖液(0.5 mol/L pH7.6),將該提取液體系放置于冰浴環(huán)境中,超聲提取20 min,提取功率200 W。超聲后的提取液,8000 r/min離心20 min后,取上清液測(cè)定酶活性,計(jì)算酶含量。

1.2.2酶活測(cè)定方法及提取率計(jì)算取2 mL工作液(0.1 mol/L Tris-HCl 1.2 mL,0.1 mol/L雙甘肽0.4 mL,5 mmol/L L-γ-谷酰胺-對(duì)硝基苯胺0.4 mL),加酶液1.0 mL,置于具塞試管中混合均勻,于37 ℃反應(yīng)30 min后,加入3 mL 1.5 mol/L乙酸中止反應(yīng)。在410 nm處測(cè)定吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的GGT活性[8]。

單位酶活(U)的定義為在上文提到的反應(yīng)條件下,每分鐘產(chǎn)生1 μmol的P-nitroanilide即定義為1個(gè)單位的酶活。

GGT提取量/(U/g)=樣品的總GGT活性/香椿粉的質(zhì)量。

1.2.3樣品提取的單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)利用單因素法實(shí)驗(yàn)分析不同緩沖液體積、提取時(shí)間以及提取功率對(duì)GGT提取量的影響。具體操作為稱取10.00 g樣品粉末,分別加入0.5 mol/L Tris-HCl(pH7.6)緩沖液20、50、100、200、300 mL,在4 ℃,提取功率200 W條件下提取20 min;10.00 g樣品粉末,加入20 mL緩沖液,在4 ℃提取功率200 W條件下分別提取20、30、40、50、60、70 min;10.00 g樣品粉末,加入20 mL緩沖液,提取功率分別在0、100、200、250、300、400 W條件下提取20 min。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)為設(shè)計(jì)原理,利用Design-expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析[9],優(yōu)化GGT的超聲輔助提取法中緩沖液體積、提取時(shí)間和功率提取的工藝,實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面的分析因素與水平設(shè)計(jì)

2　結(jié)果與分析

2.1超聲波輔助提取法提取GGT的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同緩沖液體積對(duì)提取GGT酶含量的影響據(jù)圖1可知,隨著緩沖液體積的加大,提取液中GGT的含量不斷增加。當(dāng)緩沖液體積達(dá)到200 mL(樣品質(zhì)量10.00 g)時(shí),GGT的含量達(dá)到了最高值(5.34±0.57 U/g),之后進(jìn)一步增加緩沖液體積,GGT的含量相對(duì)最高值則有所降低。在實(shí)驗(yàn)的后續(xù)步驟中,如過濾,濃縮等對(duì)提取物的消耗也在不斷增加,因此出現(xiàn)溶劑量增大,而酶含量下降的情況。綜上所述,從原料用量,提取效率,酶活性等方面考慮,選擇緩沖液200 mL為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

圖1　緩沖液體積對(duì)提取GGT提取量的影響Fig.1　Effect of buffer volume on the content of GGT

2.1.2不同提取功率對(duì)提取GGT酶含量的影響據(jù)圖2可知,提取功率的變化是對(duì)GGT提取量有顯著影響的一個(gè)條件。隨著提取功率的增加,GGT的提取量也增加。超過最高值后,隨著功率的提高,振動(dòng)加強(qiáng),對(duì)細(xì)胞的破壞作用加大,溶質(zhì)分散程度也加強(qiáng),有利于GGT的擴(kuò)散浸出[10]。在適宜的頻率條件下,因超聲的機(jī)械振蕩作用、空穴作用和磁致伸縮作用,且對(duì)溶液有化學(xué)反應(yīng)、結(jié)晶成核的促進(jìn)功能及對(duì)酶催化的協(xié)同加速作用,因此表現(xiàn)出酶催化活性的提高[11]。但是當(dāng)超過臨界值,振動(dòng)過大時(shí),會(huì)產(chǎn)生較高的瞬時(shí)溫度,而且不能被及時(shí)降溫,因此可能對(duì)酶活性造成一定影響,同時(shí),過強(qiáng)的振動(dòng)也會(huì)破壞蛋白的結(jié)構(gòu)及狀態(tài),因此造成酶的活性降低[12]。綜上所述,選擇250 W作為最佳反應(yīng)的提取功率,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2　提取功率的變化對(duì)提取GGT提取量的影響Fig.2　Effect of extract power on the content of GGT

2.1.3不同提取時(shí)間對(duì)提取GGT酶含量的影響據(jù)圖3可知,提取時(shí)間與GGT的提取量變化有著顯著的關(guān)系,在30 min前,隨著時(shí)間變化,酶的含量出現(xiàn)顯著提高,到30 min時(shí)為最大值(5.65±0.03 U/g),之后隨著時(shí)間的延長,GGT的含量出現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì),主要是因?yàn)殡S著樣品提取時(shí)間的增加,超聲波的熱效應(yīng)增加,提取溫度變高,同時(shí)過高的溫度又會(huì)減弱超聲波的空化效應(yīng),使得超聲波對(duì)提取物所在樣品的細(xì)胞壁的破碎作用減小,使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和擴(kuò)散受阻,進(jìn)而使提取率有所降低,并且超聲時(shí)間的延長亦會(huì)導(dǎo)致了蛋白變性[13],因而使蛋白質(zhì)水溶性變差,GGT的提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此,選擇30 min為最佳提取時(shí)間。

圖3　不同提取時(shí)間對(duì)提取GGT提取量的影響Fig.3　Effect of extract time on the content of GGT

2.2采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取法

2.2.1響應(yīng)面分析法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

表3　回歸方程的方差分析

由軟件Design-expert 8.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,得到回歸分析和方差分析,并擬合回歸方程,得到Y(jié)=7.05+0.19A+0.23B+0.87C-0.41AB+0.15AC-0.077BC-0.62A2-0.99B2-1.01C2

從表3可以看出,回歸方程的因變量和自變量之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.9224),方程中的“Prob>F”=0.0256<0.05,說明該二次方程的模型是顯著的;失擬項(xiàng)“Prob>F”=0.0616>0.05,說明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較好,因此此實(shí)驗(yàn)方法是可靠可行的。

2.2.2提取工藝的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Design-expert 8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析,結(jié)合圖4～圖6給出的回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知,各因素的交互作用不顯著[14],回歸模型存在最大值[15-16]。取回歸方程的極值點(diǎn),得到:提取功率、提取時(shí)間、緩沖液體積的最佳值分別為261.37 W,28.33 min,241.53 mL(10.00 g),在此最優(yōu)工藝條件下,GGT的提取量達(dá)到最大值,為7.217 U/g。但是考慮到實(shí)驗(yàn)條件以及實(shí)際操作過程的便利,將GGT的最佳提取工藝條件修正為提取功率260 W,提取時(shí)間28 min,緩沖液體積240 mL。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性,在修正的最優(yōu)條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定的GGT提取量為7.188 U/g,與理論上的預(yù)測(cè)值基本相符,這說明該回歸方程能較為真實(shí)地反映出各因素對(duì)GGT提取量的影響。

圖4　提取功率與提取時(shí)間對(duì)GGT提取量交互影響效應(yīng)的響應(yīng)面3D分析圖Fig.4　Response surface of the effects between power and time on the GGT content

圖5　提取功率與緩沖液體積對(duì)GGT提取量交互影響效應(yīng)的響應(yīng)面3D分析Fig.5　Response surface of the effects between power and buffer volume on the GGT content

圖6　提取時(shí)間與緩沖液體積對(duì)GGT提取量交互影響效應(yīng)的響應(yīng)面3D分析Fig.6　Response surface of the effects between time and buffer volume on the GGT content

3　結(jié)論

為優(yōu)化GGT的提取工藝,本實(shí)驗(yàn)選提取功率、提取時(shí)間和料液比這三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和Design-expert 8.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析,同時(shí)結(jié)合實(shí)際的操作,得到超聲輔助提取GGT的最佳條件:提取功率、提取時(shí)間、緩沖液體積的最佳條件分別為260 W,28 min,240 mL(10.00 g)。在該最佳提取條件下,提取液中GGT的

提取率達(dá)到了7.188 U/g,與理論值是相符合的,這表明了該回歸方程較為真實(shí)地反映出各因素對(duì)香椿中的GGT提取量的影響,為GGT的提取以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了操作指導(dǎo)。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction conditions of γ-glutamyltranspeptidase fromToonasinensisby response surface methodology

JIA Jian-ying1,LIU Chang-jin1,*,WANG Hao-yu1,LI Nan1,LUO Qi1,WANG Fu-xin2

(1.College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Taian Xintong Agricultural Development Co. Ltd.,Tai’an 271400,China)

In order to optimize the ultrasonic-assisted extraction of γ-glutamyltranspeptidase(GGT)fromToonasinensis,single factor investigations were initially carried out,followed by construction of a three-factor,three-level Box-Benhnken experimental design,quadratic regression fitting for GGT activity as a function of three extraction conditions and response surface analysis. The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of GGT were volume of buffer solution of 240 mL(10.00 g),ultrasonic power of 260 W,and ultrasonic time of 28 min. Under the above conditions,the experimental value of GGT activity was 7.188 U/g,which was in basic agreement with the model predicted value.

Toonasinensis;γ-glutamyltranspeptidase;ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology

2016-01-12

賈建穎(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：植物酶的研究，E-mail：951891128@qq.com。

劉常金(1969-)，男，副教授，研究方向：植物化學(xué)物與健康食品，E-mail：cjliu@tust.edu.cn。

TS255.7

B

1002-0306(2016)13-0226-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.037