吳祥坤,王騰飛,李丕武

(齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,山東濟南 250353)

?

葡萄糖濃度及補料方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響

吳祥坤,王騰飛,李丕武*

(齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,山東濟南 250353)

本研究以獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)為出發(fā)菌株,在10 L全自動發(fā)酵罐中進行透明質(zhì)酸的發(fā)酵研究,考察葡萄糖濃度和補料方式對發(fā)酵結(jié)果的影響。結(jié)果顯示,控制葡萄糖總濃度為80 g/L,采用初始葡萄糖濃度為40 g/L,一次性補加剩余40 g/L葡萄糖的方式時,菌體量和透明質(zhì)酸的產(chǎn)量比分批培養(yǎng)時分別提高了13.5%和28.5%,乳酸的積累量降低7.89%,透明質(zhì)酸的相對產(chǎn)率達到了10.02%,平均分子量達到了1.56×106u。因此,透明質(zhì)酸的發(fā)酵生產(chǎn)可以采用補糖的方式提高生產(chǎn)強度和產(chǎn)品質(zhì)量。

獸疫鏈球菌,分批培養(yǎng),補料分批培養(yǎng),透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是由N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)和葡萄糖醛酸(GlcUA)為雙糖單位聚合而成的酸性高分子粘多糖,廣泛存在于高等動物的結(jié)締組織內(nèi)。由于其結(jié)構(gòu)上的特殊性,HA具有很高的粘彈性和極強的保水性,已被大量用于醫(yī)學(xué)醫(yī)藥[1]、化妝品工業(yè)[2]。隨著研究的不斷深入,HA的生產(chǎn)方法也完成了由傳統(tǒng)的動物組織提取法向微生物發(fā)酵法的轉(zhuǎn)變,和傳統(tǒng)的動物組織提取法相比,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)HA有著顯著的優(yōu)點,因其成本低廉、工藝簡單、質(zhì)量穩(wěn)定而被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

山東臨朐華元生物工程有限公司是國內(nèi)首家采用微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)透明質(zhì)酸的公司,產(chǎn)品主要用于化妝品行業(yè)[3]。成霞[4]等研究發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖濃度為65.8 g/L有利于透明質(zhì)酸的生產(chǎn),產(chǎn)量達5.9 g/L,平均分子量達1.90×106u,產(chǎn)率系數(shù)為0.17 g/g。高海軍[5]等采用流加發(fā)酵的方式研究發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖濃度為30 g/L時,透明質(zhì)酸產(chǎn)量達4 g/L,平均分子量達2.0×106u,產(chǎn)率系數(shù)為0.04 g/g。湯棟等[6]利用氧化脅迫聯(lián)合UV、DES誘變選育出的透明質(zhì)酸菌株的生產(chǎn)能力僅僅為4.26 g/L。雖然透明質(zhì)酸的平均分子量和產(chǎn)率系數(shù)較高,但是應(yīng)用到產(chǎn)業(yè)以后,受原料和發(fā)酵條件等影響,產(chǎn)量比國際工廠的8～10 g/L低很多[4-6]。

本研究以獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)為出發(fā)菌株,在10 L全自動發(fā)酵罐中進行透明質(zhì)酸的發(fā)酵研究,考察葡萄糖濃度和補料方式對菌體生長、HA產(chǎn)量、分子量、乳酸積累量和發(fā)酵周期的影響,研究適合菌體生長繁殖的最佳初始葡萄糖濃度和有利于發(fā)酵過程中HA積累及控制發(fā)酵液中乳酸積累的葡萄糖流加方式,達到提高HA最終產(chǎn)量的目的。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)SL-2齊魯工業(yè)大學(xué)微生物酶技術(shù)實驗室篩選并保藏;葡萄糖(分析純)諸城東曉生物科技有限公司;蛋白胨；酵母粉(分析純)北京奧博星生物技術(shù)有限公司;磷酸氫二鉀；硫酸鎂；氫氧化鈉(分析純)天津市廣成化學(xué)試劑有限公司;谷氨酸(分析純)阿拉丁試劑(上海)有限公司。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖5 g/L,蛋白胨15 g/L,酵母粉5 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸鎂2 g/L。調(diào)pH7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨17.5 g/L,酵母粉6 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸鎂2 g/L,谷氨酸0.5 g/L。葡萄糖的添加量見后文。調(diào)pH7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

5804R型高速冷凍離心機德國Eppendorf公司;UV-7200型分光光度計上海精密科學(xué)儀器有限公司;SBA-40D生物傳感分析儀山東省科學(xué)院生物研究所;10 L全自動發(fā)酵罐上海百倫生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1分批培養(yǎng)在10 L的全自動發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。接種量10%,發(fā)酵溫度為37 ℃,pH7.0,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,隨著發(fā)酵的進行不斷提高轉(zhuǎn)速,維持溶氧飽和度30%,直至轉(zhuǎn)速達到600 r/min。五次分批發(fā)酵實驗的初始葡萄糖濃度分別為20、40、60、80、100 g/L。葡萄糖溶液單獨滅菌115 ℃、20 min。

1.2.2一次性補糖培養(yǎng)在10 L的全自動發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。接種量10%,發(fā)酵溫度為37 ℃,pH7.0,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,隨著發(fā)酵的進行不斷提高轉(zhuǎn)速,維持溶氧飽和度30%,直至轉(zhuǎn)速達到600 r/min。初始葡萄糖濃度為40 g/L,將剩余的40 g/L葡萄糖溶液在發(fā)酵6 h時一次性補加到發(fā)酵罐中。葡萄糖溶液單獨滅菌115 ℃、20 min。

1.2.3間歇性補糖培養(yǎng)在10 L的全自動發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。接種量10%,發(fā)酵溫度為37 ℃,pH7.0,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,隨著發(fā)酵的進行,不斷提高轉(zhuǎn)速,維持溶氧飽和度30%,直至轉(zhuǎn)速達到600 r/min。初始葡萄糖濃度為40 g/L,將剩余的40 g/L葡萄糖溶液在發(fā)酵6、10、14 h時分三次補加到發(fā)酵罐中。葡萄糖溶液單獨滅菌115 ℃、20 min。

1.2.4恒速流加補糖培養(yǎng)在10 L的全自動發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。接種量10%,發(fā)酵溫度為37 ℃,pH7.0,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,隨著發(fā)酵的進行不斷提高轉(zhuǎn)速,維持溶氧飽和度30%,直至轉(zhuǎn)速達到600 r/min。初始葡萄糖濃度為40 g/L,將剩余的40 g/L葡萄糖溶液在發(fā)酵6 h時開始以恒定的速率補加到發(fā)酵罐中,直至發(fā)酵結(jié)束。葡萄糖溶液單獨滅菌115 ℃、20 min。

1.3分析方法

1.3.1菌體量取25 mL發(fā)酵液,經(jīng)3000 r/min離心后再用蒸餾水洗滌2次,得到的濕菌體在105 ℃下烘至恒重,計算出菌體干重(dry cell weight,DCW)。在660 nm處測定發(fā)酵液的吸光度,建立吸光度與菌體干重的關(guān)系式,通過測定發(fā)酵液的吸光度計算菌體量。

1.3.2平均分子量將發(fā)酵液與0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)等體積混合,室溫下靜置10 min以釋放細胞外壁附著的HA。發(fā)酵液經(jīng)4200 r/min離心15 min,去除菌體,取上清液,加入2.5倍的無水乙醇,4 ℃靜置1 h,離心取沉淀,加入所取上清液適當倍數(shù)體積的去離子水,振蕩溶解,即制得樣液[7],用Laurernt法計算出平均分子量[8]。

1.3.3葡萄糖含量SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測定。

1.3.4乳酸含量SBA-40D生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測定。

1.3.5透明質(zhì)酸產(chǎn)量Bitter-Muir法[9]。

1.3.6透明質(zhì)酸相對產(chǎn)率相對產(chǎn)率=透明質(zhì)酸產(chǎn)量/(葡萄糖添加量-葡萄糖剩余量)。

2　結(jié)果與分析

2.1分批發(fā)酵工藝中透明質(zhì)酸的合成過程

圖1為不同初始葡萄糖濃度對獸疫鏈球菌菌體量的影響,圖2為不同初始葡萄糖濃度下葡萄糖濃度隨培養(yǎng)時間的變化曲線。從圖1和圖2中可以得知,獸疫鏈球菌可以在初始葡萄糖濃度為20～80 g/L的范圍內(nèi)正常生長,并且菌體量在初始葡萄糖濃度為80 g/L時達到了最大值10.98 g/L。當初始葡萄糖濃度為20 g/L時,獸疫鏈球菌在發(fā)酵4 h時進入快速增長的階段,但由于葡萄糖既要為菌體生長提供能量和前體物質(zhì)又要為透明質(zhì)酸的合成提供前體物質(zhì)而導(dǎo)致菌體量未能達到較高的水平;初始葡萄糖濃度為40 g/L時,獸疫鏈球菌生長的停滯期較短,在6 h時即達到對數(shù)生長期;初始葡萄糖濃度為60 g/L和80 g/L時對數(shù)期的到達時間分別為發(fā)酵開始8 h和10 h,而當初始葡萄糖濃度為100 g/L時,獸疫鏈球菌生長的停滯期則延續(xù)到了12 h。分析其原因為較低的初始葡萄糖濃度有利于細胞的生長,但是較高的初始葡萄糖濃度則會抑制細胞的生長,這和鄧開野[10]得到的結(jié)論一致。隨著初始葡萄糖濃度的提高,葡萄糖的消耗情況和獸疫鏈球菌的生長情況相一致,當初始葡萄糖濃度為40 g/L時,發(fā)酵6 h時,葡萄糖濃度開始明顯減少,說明6 h時HA合成和菌體生長同步進行導(dǎo)致葡萄糖濃度急劇減少。

圖1　不同初始葡萄糖濃度對菌體量的影響Fig.1　Effect of different initial glucose concentration on cell amount

圖2　葡萄糖濃度隨時間變化曲線Fig.2　Different initial glucose concentration change curve

圖3為不同初始葡萄糖濃度對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響。由圖3可以看出,當初始葡萄糖濃度為20～80 g/L時,隨著初始葡萄糖濃度的增加,HA產(chǎn)量也不斷增加,尤其是初始葡萄糖濃度為80 g/L時,HA的最高產(chǎn)量更是達到了5.94 g/L,當初始葡萄糖濃度為100 g/L時,HA的最高產(chǎn)量降低到了3.52 g/L;當初始葡萄糖濃度分別為20、40、60、80 g/L時,透明質(zhì)酸的平均分子量也不斷增加,在一定的初始葡萄糖濃度范圍內(nèi)(40～80 g/L),初始葡萄糖濃度越高,HA的分子量越高。田毅紅[11]認為較高的葡萄糖初始濃度有利于透明質(zhì)酸分子量的提高,原因在于構(gòu)成透明質(zhì)酸的GlcNAc和GlcUA均由葡萄糖分子衍生而來[12],葡萄糖是透明質(zhì)酸多聚物的一個必需構(gòu)建單元,同時也是菌體生長的能量來源。在高初始葡萄糖濃度下,單體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc被激活,外部的葡萄糖連接到這些單體上,使透明質(zhì)酸分子鏈延長;然而過高的初始葡萄糖濃度(100 g/L)會抑制菌體生長,進而影響HA的產(chǎn)量和分子量。乳酸積累量在初始葡萄糖濃度為20～80 g/L的范圍內(nèi)一直增加,當初始葡萄糖濃度提高到100 g/L時,乳酸產(chǎn)量降低為38.8 g/L。隨著初始葡萄糖濃度的增加,透明質(zhì)酸的發(fā)酵周期不斷增加,這和菌體的生長代謝情況有著很大的關(guān)系。分批培養(yǎng)時,HA產(chǎn)量、平均分子量和乳酸產(chǎn)量都是和菌體量的生長情況呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。分析圖1～圖3可知,在透明質(zhì)酸的分批發(fā)酵實驗中,初始葡萄糖濃度為80 g/L(葡萄糖總濃度為80 g/L)時有利于提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量,但是副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量比初始葡萄糖濃度為20～60 g/L時高。

圖3　不同初始葡萄糖濃度對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響Fig.3　Effect of different initial glucose concentration on Hyaluronic acid fermentation

產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能與發(fā)酵液中乳酸的積累有關(guān)。乳酸是透明質(zhì)酸發(fā)酵過程中的主要副產(chǎn)物,與菌體的生長相偶聯(lián),且乳酸對菌體的生長和產(chǎn)物的合成有抑制作用[13]。王瑞明[14]等研究發(fā)現(xiàn),副產(chǎn)物乳酸的積累對發(fā)酵過程的抑制作用主要體現(xiàn)在對細胞生長的抑制上。高海軍[5]和鄧開野[10]研究發(fā)現(xiàn),乳酸產(chǎn)生的原因主要是獸疫鏈球菌的TCA循環(huán)不完全[15],不能將其徹底分解氧化,菌體生長要靠葡萄糖不完全氧化生成乳酸和乙酸產(chǎn)生的能量來進行,故乳酸和菌體生長是偶聯(lián)的,而作為非細胞基本成分的HA在達到一定量后就不再增加。

在不同初始葡萄糖濃度的分批發(fā)酵實驗中,乳酸積累量在初始葡萄糖濃度為20～80 g/L的范圍內(nèi)一直增加,當初始葡萄糖濃度提高到100 g/L時,乳酸產(chǎn)量降低為38.8 g/L。由分批發(fā)酵實驗結(jié)果可知,葡萄糖濃度為40 g/L時,透明質(zhì)酸產(chǎn)量為2.46 g/L,分子量為1.25×106u,乳酸產(chǎn)量為26.35 g/L,發(fā)酵周期為15 h,有利于前期的菌體生長和縮短發(fā)酵周期,但透明質(zhì)酸產(chǎn)量和分子量較低;葡萄糖濃度為80 g/L時,透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量達到了5.94 g/L和1.68×106u,均高于葡萄糖濃度為20、40、60、100 g/L時的產(chǎn)量和分子量,但乳酸產(chǎn)量高和發(fā)酵周期長;為保證菌體正常生長和透明質(zhì)酸發(fā)酵正常進行,降低發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乳酸的積累量,因此下面的實驗采用補糖培養(yǎng)的方式繼續(xù)研究葡萄糖濃度的控制模式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響,葡萄糖總濃度為80 g/L,初始葡萄糖濃度為40 g/L,將剩余的40 g/L葡萄糖在培養(yǎng)過程中分別進行一次性補加、間歇性補加和恒速流加的發(fā)酵實驗。

2.2葡萄糖補料方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響

2.2.1一次性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響圖4為一次性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響。由圖4可以看出,一次性補糖的方式下獸疫鏈球菌的最大菌體量為12.46 g/L,比分批培養(yǎng)的最大菌體量10.98 g/L提高了13.5%;透明質(zhì)酸濃度的最大值達到了7.63 g/L,比分批培養(yǎng)時的5.94 g/L提高了28.5%;隨著發(fā)酵過程的進行,乳酸的積累量不斷升高,在發(fā)酵20 h時達到了最高值48.73 g/L,比分批培養(yǎng)的52.9 g/L降低了7.89%。

圖4　一次性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響Fig.4　Effect of disposable carbohydrate supplement way on Hyaluronic acid fermentation

2.2.2間歇性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響圖5為間歇性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響。由圖5可以看出,間歇性補糖分批培養(yǎng)的方式下獸疫鏈球菌菌體量的最大值為12.91 g/L,比分批培養(yǎng)的菌體量最大值10.98 g/L提高了17.58%,透明質(zhì)酸濃度的最大值達到了6.23 g/L,比分批培養(yǎng)的5.94 g/L提高了4.88%,副產(chǎn)物乳酸的最高積累量為57.61 g/L,比分批培養(yǎng)的52.9 g/L增加了8.9%。

圖5　間歇性補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響Fig.5　Effect of intermittent feeding mode on Hyaluronic acid fermentation

2.2.3恒速流加補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響圖6為恒速流加補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響。由圖6可以看出,恒速流加補糖方式下分批培養(yǎng)的方式下獸疫鏈球菌菌體量的最大值為13.29 g/L,比分批培養(yǎng)的菌體量最大值10.98 g/L提高了21.04%,透明質(zhì)酸濃度的最大值達到了5.46 g/L,比分批培養(yǎng)降低了4.37%,乳酸的最高濃度為58.36 g/L,比分批培養(yǎng)增加了10.32%。

圖6　恒速流加補糖方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響Fig.6　Effect of constant speed fed-sugar on Hyaluronic acid fermentation

由圖7結(jié)合上述2.2結(jié)果可以看出,當葡萄糖添加量為80 g/L時,補糖發(fā)酵的HA產(chǎn)量和HA相對產(chǎn)率均優(yōu)于分批發(fā)酵的HA產(chǎn)量和HA相對產(chǎn)率。在補糖發(fā)酵過程中,采用一次性補糖方式培養(yǎng)時,HA的產(chǎn)量和相對產(chǎn)率均為最高,并且分子量的變化較小。由于構(gòu)成HA的N-乙酰氨基葡糖和和葡糖醛酸就是由葡萄糖分子衍生而來的[10],因此在發(fā)酵過程中控制適當?shù)钠咸烟菨舛?不僅可以保障菌體生長所需要的碳源和能量,更重要的是能夠提供充足的N-乙酰氨基葡糖和和葡糖醛酸,有利于HA的合成,故得到的HA分子量較高。間歇性補加葡萄糖和恒速流加葡萄糖的方式下HA產(chǎn)量和分子量均低于一次性補加葡萄糖方式下的產(chǎn)量和平均分子量,分析其原因可能為以下兩點,一是在6 h第一次補加葡萄糖時,間歇性補加葡萄糖和恒速流加葡萄糖的方式未能使葡萄糖濃度達到可以激活單體UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的濃度[9];二是葡萄糖過多流向菌體生長,導(dǎo)致發(fā)酵后期HA合成前體物質(zhì)供應(yīng)不足。

圖7　不同培養(yǎng)方式對透明質(zhì)酸發(fā)酵的影響Fig.7　Effect of different cultivation methods on Hyaluronic acid fermentation

3　結(jié)論

采用分批培養(yǎng)的方式進行發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸時,初始葡萄糖濃度為80 g/L(葡萄糖總濃度為80 g/L)時透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和分子量達到了5.94 g/L和1.68×106u,均高于葡萄糖濃度為20、40、60、100 g/L時的產(chǎn)量和分子量,發(fā)酵周期為24 h,但是副產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量較高,達到了52.9 g/L。

采用補料培養(yǎng)的方式進行發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸時,控制葡萄糖總濃度為80 g/L,采用初始葡萄糖濃度為40 g/L,在發(fā)酵6 h時一次性補加剩余40 g/L葡萄糖的方式可以使獸疫鏈球菌的菌體量增加13.5%,透明質(zhì)酸的產(chǎn)量提高28.5%,乳酸的積累量降低7.89%平均分子量達到1.56×106u。

[1]邱麗筠,黃麗麗,俞淑文.透明質(zhì)酸在腫瘤治療藥物新型給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用[J].中國實用醫(yī)藥,2014,9(16):238-241.

[2]李真,朱維波,尹研婷,等.殼聚糖/魔芋葡甘聚糖/透明質(zhì)酸鈉共混多孔膜的制備與表征[J].高分子材料科學(xué)與工程,2015,31(5):159-163,168.

[3]國內(nèi)首家采用微生物發(fā)酵工藝工業(yè)化生產(chǎn)透明質(zhì)酸 高級化妝品的理想保濕因子——透明質(zhì)酸(HA)[J]. 中國化妝品,

1994(5):3.

[4]成霞,劉登如,陳堅,等.高產(chǎn)量、高分子量透明質(zhì)酸發(fā)酵條件優(yōu)化[J].過程工程學(xué)報,2006,6(5):808-813.

[5]高海軍,陳堅,管軼眾,等.不同培養(yǎng)方式下獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,1999,5(6):614-617.

[6]湯棟,榮紹豐,管世敏,等.氧化脅迫聯(lián)合UV、DES誘變選育高產(chǎn)、高分子量透明質(zhì)酸菌株[J].食品工業(yè)科技,2015,36(11):136-140.

[7]Chong B F,Nielsen L K.Amplifying the cellular reduction potential of Streptococcus zooepidemicus[J]. Biotechnol,2003,100:33-341.

[8]Laurent TC,Ryan M,Pietruszkiewicz A. Fractionation of hyaluronic acid,the poly dispersity of hyaluronic acid from the bovine vitreous body[J]. Biochim Biophys Acta,1960,42(3):476-485.

[9]Bitter T,Muir HM. A modified hyaluronic acid carbazole reaction[J].Anal Biochem,1962,4(6):330-334.

[10]鄧開野,譚梅唇.透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌分批發(fā)酵工藝條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(3):221-223,407.

[11]田毅紅,蔡海波,陸仕燦,等.高分子量透明質(zhì)酸的發(fā)酵研究[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2004,35(5):13-15.

[12]武薇,杜連祥,路福平,等.透明質(zhì)酸補糖分批發(fā)酵工藝研究[J].食品研究與開發(fā),2008,29(11):108-111.

[13]Honda H,Toyama Y,Takahashi H,et al. Effectible lactic acid production by two-phase system[J]. Biotechnol Bioeng,1960,50:280-290.

[14]王瑞明,宋磊,王騰飛,等.透明質(zhì)酸分批發(fā)酵動力學(xué)模型[J].齊魯工業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2012,26(2):1-5.

[15]Johns MR,Goh L-T,Oeggerli A. Effect of pH,agitation and aeration on hyaluronic acid produced by Streptococcus zooepidemicus[J]. Biotech Lett,1988,15(5):507-512.

Effect of glucose concentration and feeding methods on hyaluronic acid fermentation

WU Xiang-kun,WANG Teng-fei,LI Pi-wu*

(Department of Bioengineering,Qilu University of Technology,Ji’nan 250353,China)

In this study,Streptococcus zooepidemicus(Streptococcuszooepidemicus)as the starting strain,the effect of glucose concentration and feeding methods on Hyaluronic acid fermentation was studied in 10 L automatic fermentation tank. The results showed that the total concentration of glucose should be controlled at 80 g/L,and both of the initial and supplemented glucose concentration was 40 g/L. The cell amount and production of hyaluronic acid were increased by 13.5% and 28.5% compared with the batch culture while the accumulation of lactic acid was reduced by 7.89%,the relative yield of hyaluronic acid was 10.02%,and average molecular weight was 1.56×106u. Thus,the production of hyaluronic acid fermentation can be used single carbohydrate supplement cultured ways to enhance the intensity of production and product quality.

Streptococcuszooepidemicus;batch fermentation;fed-batch fermentation;hyaluronic acid

2015-12-16

吳祥坤(1989-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：微生物酶技術(shù)，E-mail:wuxk1989@126.com。

李丕武(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物酶技術(shù)，E-mail:piwuli@126.com。

國家“863計劃”項目(2012AA021504)；泰山學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費資助。

TS201.1

A

1002-0306(2016)13-0198-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.031