陳忠軍,高鶴塵,李?，u,鄭中文,趙　潔

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

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乳桿菌代謝所產(chǎn)生的抑酵母活性物質(zhì)的分離純化

陳忠軍,高鶴塵,李海瑄,鄭中文,趙潔

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中篩選出具有抑酵母作用的乳桿菌,對其代謝產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進行分離純化。結(jié)果表明:ALAC-3和ALAC-4菌株的代謝產(chǎn)物粗提液通過Sephadex G-100凝膠過濾層析分離純化后,分別得到抑菌活性組分G100-3和G100-5,經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測均達到電泳純,相對分子質(zhì)量分別為80.49 ku和40.32 ku。經(jīng)過薄層色譜法證明G100-3和G100-5為單一成分的抑菌物質(zhì)。

乳桿菌,抑酵母作用,活性物質(zhì),分離純化

乳桿菌是一類革蘭氏陽性菌、能夠利用葡萄糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌通稱[1]。近幾年,在食品中由病原菌和腐敗菌引起的食品安全事故頻繁的爆發(fā)[2]。經(jīng)統(tǒng)計,世界上約有四分之一的糧食曾被酵母菌污染,每年因污染浪費的糧食達到了2%[3]。國家的糧食每年就會損失占糧食總產(chǎn)量的將近四分之一。

乳桿菌在代謝過程產(chǎn)生的細菌素對近源菌種或同種的菌種有特異性的抑制作用,但對酵母沒有抑制作用[4]。近幾年,隨著科學的發(fā)展,研究表明抑制酵母菌的活性物質(zhì)主要有幾大類:有機酸、脂肪酸、環(huán)肽等,乳桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的研究具有廣闊的應用前景。乳桿菌產(chǎn)生的碳水化合物如乳酸和乙酸等可以作為發(fā)酵生產(chǎn)的最終產(chǎn)品[5]。苯乳酸現(xiàn)如今也引起了研究學者的重視,因其有良好的并且高效的抑真菌和細菌作用,而被作為抗真菌制劑來研究[6]。到目前為止,大量研究證明蛋白類的物質(zhì)對酵母有一定的抑制作用[7-8]。

目前測定乳桿菌抑菌作用的有效技術很少,所以今后研究工作的重點是研究檢測抑酵母菌化合物的方法[9]。菌株的代謝物質(zhì)常用的分離純化方法主要包括萃取法、硫酸銨鹽析法、超濾法、凝膠層析法、高效液相色譜法等。凝膠過濾又叫分子篩層析,主要是依據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀的不同進行分離和純化[10]。

本研究旨在將乳桿菌代謝產(chǎn)物經(jīng)凝膠過濾層析分離,并通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定相對分子質(zhì)量,且通過薄層色譜確定分離純度,為進一步研究其結(jié)構(gòu)并鑒定奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乳桿菌從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出的2株抑酵母活性較強的乳桿菌ALAC-3、ALAC-4。

指示菌白假絲酵母(Candidaalbicans)標準菌株,編號為32819,來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

酵母提取粉,氯化鈉,檸檬酸氫二胺,細菌學蛋白胨,磷酸氫二鉀,大豆蛋白胨,硫酸錳,硫酸鎂,牛肉浸膏,葡萄糖,瓊脂粉,硫酸銨,TWEEN 80,胰蛋白胨,無水氯化鈣,TEMED,Trizma 堿,無水甲醇,SDS,冰乙酸,Bromophenol blue均為分析純。

表2　Bradford法標準曲線的繪制

SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺蘇州博萊爾凈化設備有限公司,BCD-249CF美菱冰箱合肥美菱股份有限公司,DPX-9162B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱上海?，攲嶒炘O備有限公司,可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司,KDC-140HR高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司,HPX-9052 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠,L600低速自動平衡離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司,YC-1數(shù)控層析冷柜上海青浦滬西儀器廠,JC-TS-2脫色搖床濟南精誠實驗儀器有限公司,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀廣州儀科實驗室技術有限公司,BG系列電泳裝置北京百晶生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1主要溶液的配制

1.2.1.1蛋白類物質(zhì)分離用溶液100%飽和硫酸銨:稱取硫酸銨80 g,蒸餾水100 mL,在低于60 ℃溫度下攪拌至溶解[11]。洗脫液:將超純水超聲波脫氣后備用。

1.2.1.2Bradford法測定蛋白質(zhì)含量溶液標準蛋白溶液的配制準確稱取10 mg標準牛血清蛋白,用蒸餾水定容到10 mL。考馬斯亮藍G-250試劑:稱取10 mg考馬斯亮藍G-250,溶于5 mL 95%乙醇中,加入85%磷酸10 mL,用蒸餾水定容到100 mL[12]。

1.2.1.3SDS-PAGE電泳用溶液配制1 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液、1.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)溶液、50%甘油、10%過硫酸銨溶液、電泳緩沖液、考馬斯亮藍染色液、脫色液、上樣緩沖液等[13]。按表1配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠。

表1　SDS-PAGE分離膠和濃縮膠配方

1.2.2乳桿菌抑菌粗提物的制備將穿刺保藏的乳桿菌接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中活化一代,37 ℃培養(yǎng)16～24 h后發(fā)酵,將100 mL發(fā)酵液離心(3000 r/min,10 min),將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至25倍,加入飽和硫酸銨使粗提物的飽和度達到40%,搖勻,使硫酸銨充分沉淀蛋白類活性物質(zhì),然后放入冰箱,沉淀過夜。將加了飽和硫酸銨的粗提物冷凍離心(10000 r/min,20 min),將上清液倒掉,加少量脫氣水溶解,并且用Bradford法測定蛋白含量,調(diào)至其濃度約為50 μg/mL,待層析柱上樣備用[14]。

1.2.3Bradford法測定溶液中的蛋白含量以1 mg/mL牛血清蛋白溶液為標準溶液,繪制標準曲線。按表2所示一次在試管中加入相應試劑,漩渦震蕩混勻,室溫靜置2 min,以0號管作為空白,于595 nm波長下測定光吸收值,以蛋白含量為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

用移液器吸取0.1 mL待測樣品,加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑,震蕩混勻,室溫靜置2 min,于595 nm波長下測定光吸收值,繪制標準曲線。結(jié)果如圖1。

1.2.4凝膠過濾層析分離純化蛋白葡聚糖凝膠過濾層析是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),使小分子物質(zhì)能進入其內(nèi)部,而大分子物質(zhì)卻被阻擋在外部,從而使混合溶液中各種組分按分子質(zhì)量不同進行篩分。根據(jù)預實驗的結(jié)果選用Sephadex G-100對飽和硫酸銨沉淀粗蛋白進行分離。把干燥的Sephadex G-100在洗脫液中浸泡,充分溶脹,輕輕攪拌,防止顆粒破碎。也可將其置于100 ℃度沸水中30 min,這樣可以有效的除去凝膠中的氣泡。將層析柱和其他的配件都清洗好后,把下口接好,并且從上口加入緩沖液,為把下面接口中的氣泡除去,當層析柱中剩下2 cm液柱時,關閉下口。吸去部分溶脹好的凝膠上清液,用攪拌棒輕輕的攪拌凝膠凝膠,并且順著攪拌棒緩緩倒入層析柱,待柱中沉降一定量凝膠后,打開下口,直至凝膠沉積至所需高度(過程中必須保證膠上方保留2 cm的洗脫液)。后加蓋,并接上儲液瓶,用恒流泵控制流速,開始滴注洗脫平衡液。洗脫大致兩個柱床的洗脫液為止,為了使膠床穩(wěn)定。并且檢查柱子裝的是否均勻,有無斷層,有無氣泡(若有需重裝)。將下口關閉,停止洗脫,并且使柱床上的洗脫液自然流出直至剛剛露出膠面,停止洗脫,將飽和硫酸銨沉淀后的乳桿菌粗提物回溶于少量脫氣超純水中,使其蛋白含量達到50 μg/ml,將大約300 μL的此樣品用吸管緩緩地沿著層析柱壁流入,而且不能攪動膠床。打開下口,使樣品流入柱床后,關閉下口,停止洗脫液流動。再如上法,手動加入少量洗脫液,使膠面上方保持2 cm的洗脫液。打開下口,利用恒流泵控制流速為0.3 mL/min,用自動部分收集器收集流出的液體,每管1.2 mL,一共收集100管。每管取0.1 mL收集液作為待測樣品,測定OD值,作出圖譜,并且將出現(xiàn)峰值的試管收集起來,濃縮約60倍,采用牛津杯法測定抑菌活性[15]。

1.2.5SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白純度和分子量采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制作凝膠。將經(jīng)過層析柱分離純化后的乳桿菌收集液作為待測樣品。將待測樣品與上樣緩沖液以1∶1的比例混合,并且在沸水浴中處理5 min。用微量移液器取20 μL已處理后的樣品加入到樣品口,且以10～200 ku蛋白質(zhì)標準品作為Marker。連接電極,設定電壓為100 mv,至樣品前沿遷移至膠底部時結(jié)束電泳,用時大約3 h。當電泳結(jié)束后,將凝膠從電泳槽中取出,放到考馬斯亮藍染色液中,置于搖床上,過夜染色,棄去染液,用脫色液漂洗。分析電泳結(jié)果。電泳結(jié)束后需要先計算相對遷移率即Rf值,它是用測量的每個蛋白譜帶的遷移距離與溴酚藍前沿的遷移距離的比值。測量位置應在每個蛋白質(zhì)電泳譜帶的中央處。縱坐標是已知蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量的常用對數(shù)值,橫坐標是Rf,后作圖。通過測定未知蛋白的Rf值,便可在標曲上讀出相對分子質(zhì)量。本實驗對實驗產(chǎn)物G100-3和G100-5作SDS聚丙烯酰胺電泳,進行染色、脫色[16]。

1.2.6抑菌成分薄層層析將硅膠板(GF254)在105 ℃下活化30～100 min,且冷卻至室溫。在薄層板下端1 cm出輕輕劃一條基線,用微量注射器點1、2 μL,晾干,然后將點樣后的薄層板放在展開劑中,展開劑是氯仿∶甲醇∶水為10∶5∶2的混合液。當展開劑達到了薄層板大約4/5處時,取出揮干[17]。

2　結(jié)果與分析

2.1Bradford法測定溶液中的蛋白含量

Bradford法標準曲線如圖1。

圖1　Bradford法標準曲線Fig.1　Bradford standard curve

該曲線線性回歸方程為:Y=0.009x+0.003,R2=0.9986,Bradford法在標準牛血清蛋白濃度在0～100 μg/mL的范圍內(nèi)的線性關系良好。

2.2凝膠過濾層析分離純化蛋白

按照1.2.4方法對飽和硫酸銨沉淀的粗蛋白進行分離。洗脫曲線如圖2、圖3所示。

圖2　G-100凝膠過濾層析結(jié)果(ALAC-3)Fig.2　Results of G-100 gel filtration chromatography(ALAC-3)

對于ALAC-3代謝產(chǎn)物,洗脫過程出現(xiàn)三個蛋白峰,穩(wěn)定性較好,第三個峰較前兩個峰對稱性好(圖2)。三個峰頂點處蛋白含量分別為35.22、48.56、68.56 μg/mL。將29-38、45-54、59-79管分別收集起來,即為G100-1、G100-2、G100-3。濃縮后,進行抑菌實驗,只有G100-3成分有抑菌圈,抑菌圈大小為14.27 mm。收集G100-3進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純度及相對分子質(zhì)量。

對于ALAC-4代謝產(chǎn)物,洗脫過程出現(xiàn)兩個蛋白峰,兩個峰穩(wěn)定性和對稱性都較好(圖3)。兩個峰頂點處蛋白含量分別為40.78、71.89 μg/mL。將41-52、61-77管分別收集起來,即為G100-4、G100-5。濃縮后,進行抑菌實驗,只有G100-5成分有抑菌圈,抑菌圈大小為12.89 mm。收集G100-5進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定純度及相對分子質(zhì)量。

圖3　G-100凝膠過濾層析結(jié)果(ALAC-4) Fig.3　Results of G-100 gel filtration chromatography(ALAC-4)

2.3SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

對收集得到的G100-3和G100-5按照方法1.2.5進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)果如圖4、圖5。

圖4　G100-3的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.4　SDS polyacrylamide gel electrophoresis of G100-3

圖5　G100-5的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.5　SDS polyacrylamide gel electrophoresis of G100-5

由圖4可以看出,菌株ALAC-3的代謝產(chǎn)物的粗提液通過G-100凝膠過濾層析后,組分G100-3達到了電泳純。組分遷移了約14.14 mm,上樣緩沖液遷移了62 mm,根據(jù)標準蛋白的標準曲線y=-1.2734x+5.1961計算出組分G100-3的分子量約為80.49 ku。

由圖5可以看出,菌株ALAC-4的代謝產(chǎn)物粗提液通過G-100凝膠過濾層析后,組分G100-5達到了電泳純。組分遷移了約40.04 mm,上樣緩沖液遷移了了77 mm,根據(jù)標準蛋白的標準曲線y=-1.083x+5.1687可以計算出組分G100-5的分子量約為40.32 ku。

2.4抑菌成分薄層層析

將具有抑菌效果的組分G100-3(蛋白含量為68.56 μg/mL)和G100-5(蛋白含量為71.89 μg/mL)按照實驗方法1.2.6進行薄層層析。在硅膠板上都顯示單一點。由此可見,利用葡聚糖凝膠電泳可以有效地將乳桿菌抑菌活性物質(zhì)分離,得到G100-3和G100-5為單一成分的抑菌成分。

3　結(jié)論

本實驗以白假絲酵母為指示菌,對具有抑酵母作用乳桿菌ALAC-3和ALAC-4產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物進行分離純化,得出以下結(jié)論:菌株ALAC-3和ALAC-4代謝活性物質(zhì)經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾層析后分別得到具有抑酵母菌作用的組分G100-3和G100-5。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其分別達到了電泳純。G100-3的分子量約為80.49 ku,G100-5的分子量約為40.32 ku。且經(jīng)過薄層色譜法證明G100-3和G100-5為單一成分的抑菌物質(zhì)。

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Study on separation of antiyeast active substances produced byLactobacillus

CHEN Zhong-jun,GAO He-chen,LI Hai-xuan,ZHENG Zhong-wen,ZHAO Jie

(Inner Mongolia Agricultural University,College of Food Science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The characteristics of antiyeast substances produced by Lactobacillus,which were isolated from traditional dairy fermentation food in Inner Mongolia were studied. The results were showed as follows:The active substances of ALAC-3 and ALAC-4 were separated and purified by G-100 Sephadex gel filtration chromatography.And then the G100-3 and G100-5 were obtained respectively. They were analytically pure and the molecular weights were about 80.49 ku and 40.32 ku respectively through SDS-PAGE. G100-3 and G100-5 were judged separately as the single substances according to the thin-layer chromatography.

Lactobacillus;inhibiting yeast function;active substances;separation and purification

2016-01-08

陳忠軍(1971-)，女，博士，教授，從事食品微生物及發(fā)酵工程的研究,E-mail:nmndchen@126.com。

國家自然基金(31260390)。

TS252.1

A

1002-0306(2016)13-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.029