韓　莉,張莎莎,王博軍,劉京國(guó),劉偉豐,*,王艷萍,陶　勇

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,北京 100101;3.北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

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重組產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌工程菌株中異戊烯異構(gòu)酶(IDI)基因的篩選

韓莉1,2,張莎莎2,王博軍3,劉京國(guó)3,劉偉豐2,*,王艷萍1,*,陶勇2

(1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457;2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所,北京 100101;3.北京農(nóng)學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)

番茄紅素是一類(lèi)在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的萜類(lèi)化合物。異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)是番茄紅素合成途徑中的關(guān)鍵酶,也是代謝工程改造的主要靶點(diǎn)。本研究為了系統(tǒng)比較不同來(lái)源IDI對(duì)重組大腸桿菌番茄紅素(Lycopene)產(chǎn)量的影響,分別克隆了原核微生物、真核微生物、植物、古菌等多種來(lái)源的I型及II型異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)基因,在大腸桿菌E.coli中異源表達(dá),在加強(qiáng)自身2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)代謝途徑的背景下,通過(guò)優(yōu)化多靶點(diǎn)組合及轉(zhuǎn)化時(shí)間提高番茄紅素的合成水平。結(jié)果表明釀酒酵母來(lái)源的I型IDI(ScIDI)及枯草芽孢桿菌來(lái)源的II型IDI(BsIDI)在經(jīng)優(yōu)化的背景下可以獲得最高的番茄紅素產(chǎn)量,產(chǎn)量分別達(dá)到9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW,番茄紅素積累在轉(zhuǎn)化8 h達(dá)到最高,最高能達(dá)到10.29 mg/g DCW。本研究最終確定了不同類(lèi)型IDI發(fā)揮功能的條件,為后續(xù)番茄紅素以及萜類(lèi)化合物的代謝途徑的改造提供依據(jù)。

異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(IDI),大腸桿菌,番茄紅素,代謝工程,MEP途徑

番茄紅素是一種天然萜類(lèi)色素,主要存在于番茄等茄科植物的成熟果實(shí)中。它是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑之一。番茄紅素可以有效地防治因衰老,免疫力下降引起的各種疾病。在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。與所有的萜類(lèi)化合物一樣,番茄紅素是由萜類(lèi)通用前體——異戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)裝配合成的[1]。通用前體物質(zhì)IPP/DMAPP在生物體內(nèi)主要有兩條生成途徑:甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA pathway)和2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway,MEP pathway)生物合成途徑[2-4]。其中,MVA途徑主要存在于古細(xì)菌、真菌、以及動(dòng)物體;而高等植物、大多數(shù)細(xì)菌、藻類(lèi)則主要以MEP途徑合成。野生型大腸桿菌以MEP途徑作為唯一的萜類(lèi)前體合成途徑[5]。Martin等[6]在大腸桿菌中引入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MVA途徑,從而構(gòu)建了能夠高產(chǎn)紫槐二烯(Amorphadiene)的工程菌,并為其他萜類(lèi)化合物的生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)。Ajikumar P K等[7-9]就MEP途徑中的各關(guān)鍵基因進(jìn)行優(yōu)化,來(lái)提高異戊二烯(Isoprene)的產(chǎn)量。

異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)催化IPP與DMAPP的異構(gòu)化反應(yīng),是萜類(lèi)化合物生物合成的一個(gè)重要的限速酶[10]。Rad S A等[11]在大腸桿菌中分別過(guò)表達(dá)大腸桿菌E.coli和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的IDI基因,使番茄紅素的產(chǎn)量有較大提高。在MVA途徑和MEP途徑中,異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶IDI催化通用前體物質(zhì)IPP/DMAPP之間進(jìn)行異構(gòu)化,再經(jīng)過(guò)后續(xù)的酶催化反應(yīng),生成所要的目標(biāo)產(chǎn)物。MVA途徑中,兩分子的乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)一系列的酶的催化作用,生成前體物質(zhì)IPP,IPP經(jīng)過(guò)IDI的異構(gòu)化作用,生成其異構(gòu)體DMAPP;而在MEP途徑中,3-磷酸甘油醛和丙酮酸在一系列酶的作用下,同時(shí)生成IPP和DMAPP,IDI作為異構(gòu)酶,平衡前體物質(zhì)IPP/DMAPP的量,使得DMAPP在下游酶的作用下,進(jìn)入目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑[12],如圖1所示。

圖1　IDI在番茄紅素合成途徑的作用[14]Fig.1　The role of IDI on lycopene biosynthesis pathway[14]

IDI在萜類(lèi)化合物代謝途徑中起到了至關(guān)重要的作用[13],目前工程菌株中強(qiáng)化IDI的策略往往局限在大腸桿菌來(lái)源基因idi等少數(shù)候選基因。IDI根據(jù)序列及催化機(jī)理可以分成I型IDI和II型IDI[10]。其中I型IDI分子量較小,約為20 u左右。催化中心為二價(jià)金屬離子。II型IDI分子量約為35 u左右。催化活性中心含有FMN等輔基。不同來(lái)源IDI在大腸桿菌中的表達(dá)特性各不相同,對(duì)提高工程菌株中番茄紅素產(chǎn)量的作用也各不相同。仍然有大量不同來(lái)源的idi基因沒(méi)有得到表征。在本研究中,我們分別對(duì)不同種來(lái)源的I型及II型idi基因進(jìn)行異源過(guò)表達(dá),對(duì)不同來(lái)源IDI對(duì)工程菌株合成番茄紅素的作用進(jìn)行系統(tǒng)性研究,為后續(xù)萜類(lèi)化合物代謝途徑的進(jìn)一步改造優(yōu)化提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

克隆宿主菌E.coliDH5α及表達(dá)宿主菌E.coliBW25113由中科院微生物所微生物生理與代謝工程院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;各種質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供(具體信息見(jiàn)表1);胰蛋白胨、酵母粉Oxoid公司;DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Thermo Scientific公司;TransStart FastPfu DNA聚合酶北京全式金生物技術(shù)有限公司;限制性?xún)?nèi)切酶(NcoⅠ、XhoⅠ等)NEB(北京)公司;質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA 回收試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒Omega(北京)有限公司;其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

離心機(jī)Eppendorf 公司;凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)BIO-RAD公司;SDS-PAGE 電泳儀美國(guó)BIO-RAD公司;UV-Vis(-NIR)分光光度計(jì)島津公司(中國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基和溶液的配制LB液體培養(yǎng)基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1% NaCl。

LB固體培養(yǎng)基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉,1% NaCl,1.5%瓊脂粉。

抗生素終濃度:氯霉素17 μg/mL,卡那霉素50 μg/mL,鏈霉素50 μg/mL。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L):1%蛋白胨,0.5%酵母浸粉。

1000×微量元素:50 mmol/L FeCl3,20 mmol/L CaCl2,10 mmol/L MnCl2,10 mmol/L ZnSO4,CoCl2、NiCl2、Na2MO4、Na2SeO3、H3BO3各 2 mmol/L。

50×M:1.25 mol/L Na2HPO4,1.25 mol/L KH2PO4,2.5 mol/L NH4Cl,0.25 mol/L Na2SO4。

50×5052:25%甘油,2.5%葡萄糖,10%阿拉伯糖。

表1　用于本研究的菌株和質(zhì)粒

1 mol/L MgSO4:稱(chēng)取24.6 gMgSO4·7H2O加ddH2O溶解,定溶至 100 mL,高壓滅菌。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[15]ZYM:在100 mL ZY 培養(yǎng)基中加入 2 mL 50×M,2 mL 50× 5052,200 μL 1 mol/L MgSO4,100 μL 1000×微量元素。

M9培養(yǎng)基:100 mL培養(yǎng)基中含終濃度 2 mmol/L MgSO4,0.1 mmol/L CaCl2,20 mL 5×M9鹽溶液(200 mL溶液中含Na2PO4·7H2O 12.8 g,KH2PO43.0 g,NaCl 0.5 g,NH4Cl 1.0 g)

1.2.2目的基因的克隆以實(shí)驗(yàn)室保存的基因組為模版,按表2中相應(yīng)的正反向配對(duì)引物,使用pfu DNA聚合酶分別擴(kuò)增得到ecoidi,savidi,scoidi,ptidi,mmidi,bsidi,scidi這幾個(gè)目的基因。PCR條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.2.3目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體將載體pSB1s用NcoI和XhoI雙酶切,回收條帶。同樣上述目的基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶處理,按照表1的描述,將相應(yīng)的目的基因片段與載體連接[16],轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。涂相應(yīng)抗性的Str(使用終濃度為50 μg/mL)平板,待長(zhǎng)出菌落后挑取克隆鑒定,驗(yàn)證引物分別pBAD-F/pBAD-R,鑒定正確的送北京睿博興科測(cè)序,鑒定正確的重組載體分別命名pSEco、pSSav、pSSco、pSPt、pSBs、pSSc及pSMm(如表1描述)。將載體pSX用NcoI和XhoI雙酶切,回收目的條帶。將相應(yīng)的目的基因片段與載體連接,按上述過(guò)程篩選鑒定得到相應(yīng)重組質(zhì)粒pSXEco、pSXSav、pSXSco、pSXPt、pSXBs、pSXSc及pSXMm(如表1描述)。

1.2.4重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及生物轉(zhuǎn)化在MEP途徑強(qiáng)化菌株P(guān)X中表達(dá)不同來(lái)源的IDI的實(shí)驗(yàn)部分,分別將pSEco、pSSav、pSSco、pSPt、pSBs、pSSc及pSMm與番茄紅素報(bào)告質(zhì)粒pREIBk共轉(zhuǎn)化入PX菌株,同時(shí)在此背景中轉(zhuǎn)入空載體pSB1s。其中PX菌株以敲除pgi使得糖代謝途徑進(jìn)入ED途徑以及PP途徑,對(duì)MEP的前體物質(zhì)3-磷酸甘油醛和丙酮酸的量進(jìn)行平衡[17]。在利用異源的IDI構(gòu)建高水平合成番茄紅素的工程菌株的實(shí)驗(yàn)部分,分別將pSXEco、pSXSav、pSXSco、pSXPt、pSXBs、pSXSc及pSXMm與番茄紅素報(bào)告質(zhì)粒pREIBk共轉(zhuǎn)化入PXDF菌株,涂Str、Kan(使用終濃度為50 μg/mL)平板進(jìn)行篩選培養(yǎng),得到相應(yīng)的MEP重組菌株,同時(shí)在此背景中轉(zhuǎn)入空載體pSX。其中PXDF菌株是在菌株P(guān)X的背景上,對(duì)MEP途徑的關(guān)鍵基因靶點(diǎn)ispD、ispF的染色體上的內(nèi)源啟動(dòng)子用強(qiáng)的T5啟動(dòng)子進(jìn)行替換,而得到的MEP背景強(qiáng)化菌株。

挑取單克隆在新鮮的相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),待OD值到達(dá)0.6～0.8,以1%的接種量轉(zhuǎn)接到5 mL的相應(yīng)抗性的ZYM培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)培養(yǎng)12～14 h,誘導(dǎo)后測(cè)OD600,并取30OD誘導(dǎo)后的菌,在4 ℃,4000 r/min的條件下離心,棄去培養(yǎng)基,然后用M9培養(yǎng)基和4% 葡萄糖(總體積3 mL)的轉(zhuǎn)化液重懸菌體,37 ℃,280 r/min搖床進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化20 h。分別測(cè)定轉(zhuǎn)化前后番茄紅素產(chǎn)量水平。在對(duì)相應(yīng)工程菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)間的優(yōu)化時(shí),如前所述,接種工程菌株于自誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后,轉(zhuǎn)接于含4%葡萄糖的M9培養(yǎng)基中。分別選取轉(zhuǎn)化0、8、20 h,進(jìn)行番茄紅素合成水平的檢測(cè)。

1.2.5番茄紅素的測(cè)定番茄紅素的測(cè)定方法參照Li Chun等[17]。具體操作:對(duì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化前后的菌體細(xì)胞,分別測(cè)定轉(zhuǎn)化0 h和20 h的OD600,取1×108cfu細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體,雙蒸水洗滌菌體一次,于菌體中加入1 mL丙酮,冰上萃取2 h后,13000 r/min,10 min離心,吸取上清液,用分光光度計(jì)掃描340～550 nm的吸收光譜,并讀取474 nm處的特征吸收峰值。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算番茄紅素的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三次重復(fù)。

表2　用于本研究的引物

注:Restriction sites are underlined.

2　結(jié)果與討論

2.1I型IDI與II型IDI的序列分析

選擇大腸桿菌(Escherichiacoli)來(lái)源IDI(EcIDI)、阿維鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)來(lái)源IDI(SavIDI)以及天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)來(lái)源IDI(ScoIDI)作為原核微生物I型IDI代表;選擇釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來(lái)源IDI(ScIDI)為真核微生物I型IDI的代表;選擇楊樹(shù)(Populustomentosa)來(lái)源IDI(PtIDI)為植物I型IDI的代表。同時(shí)我們選擇了芽孢桿菌(Bacillussubtilis)來(lái)源IDI(BsIDI)作為原核微生物II型IDI的代表;選擇了馬氏甲烷八疊球菌(Methanosarcinamazei)來(lái)源IDI(MmIDI)為古菌II型IDI的代表。

采用Vector NTI分別對(duì)所選擇的I型IDI和II型IDI進(jìn)行了序列比對(duì)分析。結(jié)果表明在所選I型IDI中(圖2),SavIDI、ScoIDI、PtIDI、ScIDI與EcoIDI的氨基酸序列一致性分別為43.43%、38.58%、25.93%、36.51%。所有5種I型IDI均含有保守的與催化功能相關(guān)的二價(jià)金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。BsIDI與MmIDI二種II型IDI間的氨基酸序列一致性為41.91%。二種II型IDI均含有與FMN輔酶結(jié)合的保守氨基酸位點(diǎn)(圖3)。

圖2　I型IDI的序列分析Fig.2　Sequence analysis of type I IDI

圖3　II型IDI的序列分析Fig.3　Sequence analysis of type II IDI

2.2I型IDI及II型IDI的重組表達(dá)

為了有利于在代謝工程應(yīng)用中的不同蛋白間表達(dá)平衡,實(shí)驗(yàn)將全部IDI克隆到以pSC101為復(fù)制起始位點(diǎn)的低拷貝表達(dá)載體pSB1s中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主BW25113中。其中在BW25113中轉(zhuǎn)入pSB1s作為對(duì)照。經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)后檢測(cè)可溶性表達(dá)情況。SDS-PAGE分析結(jié)果表明(圖4),所有I型IDI未見(jiàn)明顯可溶性表達(dá)帶。這一結(jié)果與實(shí)驗(yàn)之前表達(dá)EcIDI的結(jié)果相一致,表明I型IDI在大腸桿菌中發(fā)揮作用與重組蛋白表達(dá)量沒(méi)有必然關(guān)系。來(lái)源于枯草芽孢桿菌的II型IDI(BsIDI)可見(jiàn)明顯可溶性表達(dá)帶,而MmIDI的表達(dá)帶則不明顯,則無(wú)法通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)。

圖4　不同IDI的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of IDIs注：M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；C:對(duì)照組pSB1s。

2.3在MEP途徑強(qiáng)化菌株中表達(dá)IDI對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有番茄紅素合成質(zhì)粒pREIBk的MEP途徑強(qiáng)化菌株P(guān)X中,獲得不同的IDI/PX菌株。在含有阿拉伯糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h后,在含有4%葡萄糖的M9培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化20 h。以番茄紅素的產(chǎn)量作為檢測(cè)指標(biāo),比較不同來(lái)源的IDI在MEP背景菌株中對(duì)于番茄紅素產(chǎn)量的影響。結(jié)果如圖5,在異源表達(dá)不同種來(lái)源的IDI基因后,重組菌株的番茄紅素產(chǎn)量得到了不同程度的提高。重組表達(dá)I型IDI能夠更有效地提高番茄紅素產(chǎn)量。其中,表達(dá)SavIDI(阿維鏈霉菌來(lái)源)、ScoIDI(天藍(lán)鏈霉菌來(lái)源)、PtIDI(楊樹(shù)來(lái)源)的菌株番茄紅素產(chǎn)量要明顯高于其它菌株,番茄紅素產(chǎn)量分別可達(dá)6.78、6.59、6.29 mg/g DCW。其中最高的SavIDI比沒(méi)有轉(zhuǎn)化IDI的對(duì)照菌株產(chǎn)量(0.69 mg/g DCW)可提高約9倍。

圖5　不同IDI對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.5　The effects of IDIs on lycopene production

I型IDI對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響為SavIDI>ScoIDI>PtIDI>EcoIDI>ScIDI。而強(qiáng)化II型IDI工程菌株中,番茄紅素產(chǎn)量明顯低于I型IDI強(qiáng)化菌株。其中BsIDI對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響接近I型IDI中的ScIDI,番茄紅素產(chǎn)量為4.41 mg/g DCW,約為對(duì)照菌株的6倍。而MmIDI則對(duì)番茄紅素產(chǎn)量提高最低,僅提高了約60%。

2.4利用異源IDI構(gòu)建高水平合成番茄紅素的工程菌株

以上結(jié)果表明異源IDI的強(qiáng)化對(duì)MEP途徑的強(qiáng)化具有明顯的作用。但合成番茄紅素工程菌株的構(gòu)建需要在強(qiáng)化IDI的同時(shí),協(xié)同強(qiáng)化其它代謝途徑靶點(diǎn)。其中DXS是MEP途徑中另一關(guān)鍵性的強(qiáng)化靶點(diǎn)。為了構(gòu)建高水平合成番茄紅素的大腸桿菌工程菌株,實(shí)驗(yàn)將不同來(lái)源的idi基因構(gòu)建到上游含有大腸桿菌dxs基因的pSB1s載體中。通過(guò)協(xié)同表達(dá)DXS和IDI兩種靶點(diǎn)來(lái)進(jìn)一步提高番茄紅素的合成水平。我們將相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到強(qiáng)化MEP途徑的PXDF菌株中,獲得不同的XI/PXDF菌株。在含有阿拉伯糖的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h后收集菌體,轉(zhuǎn)入含有4%葡萄糖的M9培養(yǎng)基中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。檢測(cè)轉(zhuǎn)化20 h后番茄紅素產(chǎn)量。結(jié)果表明(圖6),強(qiáng)化ScIDI的工程菌株獲得了最高的番茄紅素產(chǎn)量,番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)9.96 mg/g DCW。而強(qiáng)化II型IDI的BsIDI強(qiáng)化菌株番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)8.78 mg/g DCW。以上結(jié)果暗示,I型IDI和II型IDI均可在合成番茄紅素工程菌株中發(fā)揮明顯的作用。但其作用不僅與IDI本身的活性有關(guān),同時(shí)與DXS等其它靶點(diǎn)強(qiáng)化背景有關(guān)。

圖6　不同IDI在工程菌株中的作用Fig.6　The effects of IDIs in engineering strains

2.5工程菌株合成番茄紅素轉(zhuǎn)化時(shí)間的優(yōu)化

以上結(jié)果表明,異源IDI對(duì)合成番茄紅素的作用在不同背景下各不相同。為了確定最優(yōu)的番茄紅素合成條件,我們進(jìn)一步系統(tǒng)比較了上述工程菌株中分別含有EcoIDI、ScoIDI、SavIDI、PtIDI、ScIDI等5種I型IDI及BsIDI(II型IDI)等6株工程菌株的番茄紅素合成特性。結(jié)果表明(圖7),所有6株工程菌株均在8 h時(shí)達(dá)到番茄紅素的最高積累。其中含有ScIDI的工程菌株番茄紅素產(chǎn)量最高,于轉(zhuǎn)化8 h時(shí)可達(dá)10.29 mg/g DCW。以上結(jié)果顯示,在進(jìn)行自誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞內(nèi)獲得代謝途徑中一定的酶積累量,在提供生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化時(shí),產(chǎn)物呈現(xiàn)逐步積累的狀態(tài),但同時(shí)細(xì)胞處于生長(zhǎng)狀態(tài),隨著轉(zhuǎn)化的進(jìn)行,前體物質(zhì)不斷消耗使得前體物質(zhì)供應(yīng)不足,導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化的后期單位細(xì)胞的產(chǎn)量有所下降。從而呈現(xiàn)出在8 h 時(shí)產(chǎn)量最高的現(xiàn)象。

圖7　轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.7　The effects of bioconversional time on lycopene production

3　結(jié)論與討論

異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)是合成番茄紅素、β-胡蘿卜素、異戊二烯等萜類(lèi)化合物的關(guān)鍵催化酶類(lèi)。也是代謝工程對(duì)萜類(lèi)化合物合成途徑改造的最重要的靶點(diǎn)之一。IDI在蛋白質(zhì)序列及催化機(jī)制上可以分成I型與II型,但2種IDI在生物工程改造中促進(jìn)萜類(lèi)化合物的各自作用仍然不清楚。Rad S A[11]等報(bào)道II型IDI在大腸桿菌工程菌株中更有利于番茄紅素的合成,但由于候選基因過(guò)少,并沒(méi)有對(duì)2類(lèi)IDI進(jìn)行系統(tǒng)性比較。在本研究中,我們分別選擇原核微生物、真核微生物、植物、古菌等來(lái)源的2類(lèi)IDI進(jìn)行了系統(tǒng)性分析,分別通過(guò)過(guò)表達(dá)及與其它靶點(diǎn)的協(xié)同作用研究了不同IDI種類(lèi)在工程菌株的作用。為進(jìn)一步萜類(lèi)化合物代謝工程的改造提供了充足的依據(jù)。

在代謝工程構(gòu)建微生物工程菌株過(guò)程中,通常過(guò)表達(dá)單個(gè)基因會(huì)造成“蛋白質(zhì)預(yù)算”的失衡[18]。有研究表明采用強(qiáng)啟動(dòng)子、高拷貝復(fù)制起始位點(diǎn)蛋白重組表達(dá)常用的元件,往往不能達(dá)到模塊功能的理想最優(yōu)狀態(tài)。Jones KL等[19]認(rèn)為強(qiáng)啟動(dòng)子、高拷貝數(shù)質(zhì)粒往往會(huì)在菌株代謝過(guò)程中造成代謝壓力,有毒產(chǎn)物積累,同時(shí)在菌體內(nèi)存在穩(wěn)定性問(wèn)題,相反,低拷貝質(zhì)粒能夠通過(guò)緩解代謝壓力而對(duì)產(chǎn)物水平進(jìn)行優(yōu)化。為此我們采用低拷貝的pSB1s表達(dá)載體表達(dá)IDI,為進(jìn)一步工程菌株的改造和多靶點(diǎn)蛋白表達(dá)的協(xié)同優(yōu)化打下基礎(chǔ)。我們的結(jié)果顯示I型IDI在發(fā)揮功能時(shí)往往不需要過(guò)高的表達(dá)量,從而減少了對(duì)其它靶點(diǎn)的干擾,使這一類(lèi)IDI成為番茄紅素工程菌株構(gòu)建時(shí)的良好候選酶類(lèi)。在工程菌株中,來(lái)自于釀酒酵母的I型IDI(ScIDI)與來(lái)自枯草芽孢桿菌的II型IDI(BsIDI)能夠最有效地促進(jìn)工程菌株番茄紅素的合成,而在單獨(dú)強(qiáng)化IDI時(shí)楊樹(shù)來(lái)源的IDI(PtIDI)則作用最為明顯。這一結(jié)果顯示IDI在不同的背景下發(fā)揮作用各不相同,可能是由于不同強(qiáng)化靶點(diǎn)疊加時(shí)的影響造成的。因此在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中需充分考慮啟動(dòng)子、基因順序等具體的表達(dá)手段。

IPP與DMAPP作為萜類(lèi)化合物合成途徑的通用前體物質(zhì),是在IDI作用下的同分異構(gòu)體,這兩種物質(zhì)的分配比例會(huì)涉及到下游目標(biāo)產(chǎn)物的合成,因此建立對(duì)IPP/DMAPP的含量進(jìn)行檢測(cè)的方法成為一個(gè)難點(diǎn)。本研究對(duì)于不同來(lái)源IDI基因?qū)EP途徑菌株的番茄紅素的產(chǎn)量的影響,分別從MEP途徑中篩選出具有針對(duì)性的較好來(lái)源的IDI基因,可以應(yīng)用于萜類(lèi)化合物代謝途徑改造的設(shè)計(jì),同時(shí)也為生產(chǎn)番茄紅素的基因工程菌株的改造提供一定的思路。

[1]Misawa N.Pathway engineering for functional isoprenoids[J].Current opinion in biotechnology,2011,22(5):627-633.

[2]Bochar D A,Stauffacher C V,Rodwell V W.Sequence comparisons reveal two classes of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase[J].Molecular Genetics and Metabolism,1999,66(2):122-127.

[3]Hedl M,Tabernero L,Stauffacher C V,et al.Class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductases[J].Journal of Bacteriology,2004,186(7):1927-1932.

[4]Kuzuyama T.Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2002,66(8):1619-1627.

[5]Rodríguez-Concepción M,Boronat A.Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids.A metabolic milestone achieved through genomics[J].Plant Physiology,2002,130(3):1079-1089.

[6]Martin V J J,Pitera D J,Withers S T,et al.Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids[J].Nature Biotechnology,2003,21(7):796-802.

[7]Ajikumar P K,Xiao W H,Tyo K E J,et al.Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli[J].Science,2010,330(6000):70-74.

[8]Lv X,Xu H,Yu H.Significantly enhanced production of isoprene by ordered coexpression of genes dxs,dxr,and idi in Escherichia coli[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(6):2357-2365.

[9]Zurbriggen A,Kirst H,Melis A.Isoprene production via the mevalonic acid pathway in Escherichia coli(Bacteria)[J]. BioEnergy Research,2012,5(4):814-828.

[10]Berthelot K,Estevez Y,Deffieux A,et al.Isopentenyl diphosphate isomerase:A checkpoint to isoprenoidbiosynthesis[J].Biochimie,2012,94(8):1621-1634.

[11]Rad S A,Zahiri H S,Noghabi K A,et al.Type 2 IDI performs better than type 1 for improving lycopene production in metabolically engineered E. coli strains[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(1):313-321.

[12]de Ruyck J,Wouters J,Poulter C D.Inhibition Studies on Enzymes Involved in Isoprenoid Biosynthesis:Focus on Two Potential Drug Targets:DXR and IDI-2 Enzymes[J].Current Enzyme Inhibition,2011,7(2).

[13]Zhou C,Li Z,Wiberley-Bradford A E,et al.Isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate/isopentenyl diphosphate ratio measured with recombinant isopentenyl diphosphate isomerase and isoprene synthase[J].Analytical Biochemistry,2013,440(2):130-136.

[14]Yoon S H,Kim J E,Lee S H,et al.Engineering the lycopene synthetic pathway in E. coli by comparison of the carotenoid genes of Pantoea agglomerans and Pantoea ananatis[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(1):131-139.

[15]Studier F W.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures[J].Protein Expression and Purification,2005,41(1):207-234.

[16]Gibson D G,Young L,Chuang R Y,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J]. Nature Methods,2009,6(5):343-345.

[17]Li C,Ying L Q,Zhang S S,et al.Modification of targets related to the Entner-Doudoroff/pentose phosphate pathway route for methyl-d-erythritol 4-phosphate-dependent carotenoid biosynthesis in Escherichia coli[J].Microbial Cell Factories,2015,14(1):117.

[18]劉偉豐,陶勇. 蛋白質(zhì)預(yù)算:合成生物學(xué)的成本標(biāo)尺[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2013,29(8):1123-1132.

[19]Jones K L,Kim S W,Keasling J D.Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria[J].Metabolic Engineering,2000,2(4):328-338.

Screening of isopentenyl diphosphate isomerase(IDI) in engineeringEscherichiacolistrains for lycopene production

HAN Li1,2,ZHANG Sha-sha2,WANG Bo-jun3,LIU Jing-guo3,LIU Wei-feng2,*,WANG Yan-ping1,*,TAO Yong2

(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;2.Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;3.College of Biological Science and Engineering,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

Lycopene is a terpenoid pigment that has diverse applications in the fields of food and medicine. A prospective approach for lycopene production is by metabolic engineering in microbial hosts such asEscherichiacoli. Isopentenyl diphosphate isomerase(IDI)is the key enzyme in lycopene biosynthetic pathway,and one of the most important targets during metabolic engineering. In this study,in order to systematic compare the effects of different IDI on lycopene production,the type1 and type2 genes of isopentenyl diphosphate isomerase were cloned from different species,including prokaryotic microbe,eukaryotic microbe,plant,archaea,and heterologous expressed inEscherichiacoli. The effects of different IDI on lycopene production and the bioconversional conditions were investigated in a MEP-enhanced background inEscherichiacoli. In the result,ScIDI and BsIDI were the most efficient IDI species for lycopene production and the yield of lycopene rose to 9.96 mg/g DCW,8.78 mg/g DCW. As observed after bioconversion for 8 h,the yield of lycopene was up to a maximum of 10.29 mg/g DCW. The results will provide new information for further metabolic engineering study involved in lycopene and terpenoid production.

isopentenyl diphosphate isomerase(IDI);Escherichiacoli;lycopene;metabolic engineering;MEP pathway

2015-11-03

韓莉(1988-)，女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，代謝工程，E-mail：hanlireal@163.com。

劉偉豐(1976-)，男，博士，助理研究員，研究方向：代謝工程，E-mail：liuwfv@im.ac.cn。

王艷萍(1962-)，女，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)、生物技術(shù)，E-mail：ypwang@tust.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170038)；中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(KSZD-EW-Z-016-1)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)13-0137-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.019