郭俊霞,張　靜,張　珊,高　亞,陳　文

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

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?；撬峤档透吣懝檀糎epG2細胞內(nèi)膽固醇的作用機制研究

郭俊霞,張靜,張珊,高亞,陳文*

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院食品科學(xué)系,北京 100191)

目的:探討?；撬釋Ω吣懝檀糎epG2細胞膽固醇降解作用及其機制。方法:以0.02 mmol/L膽固醇加入培養(yǎng)液中建立高膽固醇細胞模型后,分別加入1、10、20 mmol/L牛磺酸培養(yǎng)48 h,測定細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)、膽固醇酯(EC)及細胞內(nèi)總膽汁酸(TBAc)和培養(yǎng)液總膽汁酸(TBAm)水平;并檢測20 mmol/L?；撬嶙饔?4 h后細胞CYP7A1及其調(diào)控分子的蛋白表達水平。結(jié)果:10 mmol/L和20 mmol/L?；撬嶙饔?8 h可顯著降低細胞內(nèi)TC、FC和EC(p<0.01),同時升高了TBAc和TBAm(p<0.05或p<0.01);20 mmol/L牛磺酸作用24 h時使CYP7A1顯著增加(p<0.05);20 mmol/L?；撬嶙饔?4 h后MAPK、ERK、JNK、c-jun和p-c-jun表達明顯降低(p<0.05),而對HNF4α則無顯著影響。結(jié)論:?；撬峥梢种聘吣懝檀糎epG2細胞MAPK/ERK和MAPK/JNK表達水平,降低c-jun蛋白表達及c-jun磷酸化水平,促進CYP7A1蛋白表達升高,從而加速膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。

?；撬?膽固醇,膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1),HepG2細胞

?；撬?Taurine)是機體中一種含硫的非必需氨基酸,自身合成極少,主要通過膳食攝入,尤其是海產(chǎn)品。近些年來多項動物實驗和臨床實驗研究均發(fā)現(xiàn)食源性?；撬峋哂辛己玫慕档湍懝檀甲饔?。臨床實驗顯示?；撬崮苡行Ы档椭驹刚叩难蹇偰懝檀寂c動脈粥樣指數(shù)[1-2]。而動物實驗表明,?；撬峥娠@著降低大鼠、小鼠、豚鼠等高膽固醇動物模型的血清和肝臟總膽固醇含量,促進糞便膽汁酸的排出,并且?；撬嶂饕峭ㄟ^提高肝臟膽固醇降解限速酶-膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)mRNA或活性水平而起到降膽固醇作用的[1,3-5]。

牛磺酸降膽固醇的體外細胞研究雖然較少,但其作用于人肝細胞HepG2、鼠肝細胞H4IIE和人THP-1源性巨噬細胞,也均顯著降低細胞內(nèi)膽固醇水平[6-7],且促進細胞內(nèi)CYP7A1的mRNA表達和蛋白表達[6-8]。這與動物實驗結(jié)果相一致。但到目前為止,關(guān)于?；撬岽龠MCYP7A1上調(diào)的分子機制尚不清晰。

本文以人肝細胞HepG2為研究對象,通過外源加入膽固醇建立高膽固醇細胞模型,加入不同濃度?；撬?觀察?；撬釋毎麅?nèi)膽固醇和膽汁酸的調(diào)節(jié)作用,并檢測細胞內(nèi)CYP7A1及其調(diào)控分子肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子(HNF4α)、MAPK、JNK、ERK、c-Jun、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)的蛋白表達變化,從而探討牛磺酸調(diào)節(jié)肝細胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化的作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

HepG2細胞中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心;膽固醇(純度≥99%)、牛磺酸(純度>99%)、膽固醇氧化酶、辣根過氧化物酶、膽固醇酯水解酶、水合牛膽酸鈉和4-氨酰安替比林美國Sigma公司;抗CYP7A1(sc-25536)、抗JNK(sc-571)、抗p-c-jun(sc-7980-R)、抗c-jun(sc-1694)、抗ERK(sc-292838)、抗HNF4α(sc-8987)等一抗、山羊抗兔二抗(sc-2004)美國Santa Cruz公司;抗MAPK抗體(D1A5)美國CST(Cell Signaling Technology)公司,抗β-actin一抗美國Genview公司;BCA試劑盒北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;總膽汁酸測定試劑盒南京建成生物工程研究所。

uQuant Bio-Tek酶標(biāo)儀美國Bio-Tek公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng)美國通用公司。

1.2細胞培養(yǎng)及處理

HepG2細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng),以1×105～2×105個/孔接種于六孔板中。培養(yǎng)液中加入0.02 mmol/L膽固醇孵育24 h細胞內(nèi)膽固醇濃度升高了33%,因此本實驗以0.02 mmol/L膽固醇建立細胞高膽固醇模型。根據(jù)處理不同分為:正常對照組(N),高膽固醇模型對照組(H),在模型基礎(chǔ)上分別加入1、10、20 mmol/L?；撬釣榕；撬峤M(T),共同培養(yǎng)12、24或48 h。

1.3細胞內(nèi)膽固醇測定

細胞每孔加入1 mL正己烷-異丙醇(2∶1,v/v)慢搖60 min以提取細胞內(nèi)脂類物質(zhì);4 ℃、10000 r/min離心10 min,上清通氮氣40 min除去有機溶劑;以含10% TritonX-100異丙醇130 mL振蕩溶解上述脂類提取物。按照表1配制總膽固醇(total cholesterol,TC)和游離膽固醇(free cholesterol,FC)測定工作液。取50 μL脂類提取物,分別加入TC和FC測定工作液,37 ℃水浴30 min,用酶標(biāo)儀于500 nm波長處測定吸光度[9-10]。

表1　膽固醇測定工作液配制成分

1.4細胞膽汁酸測定

分別收集細胞和培養(yǎng)液,1% TritonX-100裂解細胞,以總膽汁酸測定試劑盒測定細胞內(nèi)膽汁酸(TBAc)和培養(yǎng)液內(nèi)膽汁酸(TBAm)。

1.5細胞內(nèi)蛋白含量測定

細胞提取脂類物質(zhì)后加入裂解液冰上提取細胞內(nèi)總蛋白,4 ℃、10000 r/min離心10 min,取上清液為測試樣品。或者測定TBAc后的裂解液上清為測試樣品。各測試樣品以BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。

細胞膽固醇含量以膽固醇與蛋白質(zhì)比值(μg/mg·pro)表示,膽固醇酯(cholesterol ester,EC)=TC-FC;TBAc含量以膽汁酸與蛋白質(zhì)比值表示(μmol/g·pro)表示。

1.6Western Blot法

裂解細胞提取細胞總蛋白并以BCA試劑盒定量蛋白濃度。等量取每孔細胞蛋白30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,在含5%脫脂奶粉封閉1 h,加入不同目的蛋白一抗和內(nèi)參β-actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液漂洗3次后加入二抗,室溫孵育2 h。以ECL高效化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影。條帶結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行目的蛋白及內(nèi)參(β-actin)灰度值分析,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照蛋白灰度值之比作為所測目的蛋白相對含量。

1.7數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

機體肝臟膽固醇降解為膽汁酸是膽固醇清除的重要途徑,也是體內(nèi)膽固醇平衡的重要環(huán)節(jié)之一。CYP7A1是膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化經(jīng)典途徑的限速酶[11]。綜述近年來關(guān)于?；撬峤档湍懝檀甲饔玫膭游飳嶒灲Y(jié)果,高脂膳食誘導(dǎo)建立高膽固醇血癥大鼠或小鼠模型,經(jīng)飼料或飲水途徑給予牛磺酸,血清TC降低22%～67%,肝臟膽固醇降低26%～42%,同時CYP7A1的mRNA增加95%～119%,CYP7A1活性升高82%～151%[1]。

表2　?；撬嶙饔?8 h對高膽固醇HepG2細胞內(nèi)膽固醇和膽汁酸的影響

注:與正常對照比較,*p<0.05,**p<0.01;與模型對照比較,#p<0.05,##p<0.01。

本研究以HepG2細胞外源加入0.02 mmol/L膽固醇建立高膽固醇細胞模型,在細胞水平探討?；撬嵴{(diào)節(jié)肝細胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸生物轉(zhuǎn)化的作用及其機制。

2.1?；撬釋Ω吣懝檀糎epG2細胞內(nèi)膽固醇和膽汁酸的影響

由表2可見,以0.02 mmol/L膽固醇加入HepG2細胞,細胞內(nèi)TC、FC和EC均明顯升高(p<0.01),表示高膽固醇細胞模型建立成功。在此高膽固醇細胞模型基礎(chǔ)上,不同濃度牛磺酸作用48 h均使得細胞內(nèi)膽固醇下降,其中1.0 mmol/L?；撬醿H使得EC下降,而10 mmol/L?；撬崾筎C和FC分別顯著下降25.3%與24.6%,20 mmol/L牛磺酸則使TC和FC下降幅度達35.0%與42.8%。從膽汁酸的結(jié)果看出,與模型對照組相比,1 mmol/L和10 mmol/L牛磺酸均使胞內(nèi)膽汁酸TBAc顯著增多,20 mmol/L?；撬釁s使TBAc含量有所下降,但培養(yǎng)液TBAm水平則隨著牛磺酸濃度的增加顯著上升,在?；撬釣?0 mmol/L時達最大值,表示胞內(nèi)膽汁酸排出到了培養(yǎng)液中。這些結(jié)果顯示牛磺酸促進了細胞內(nèi)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化,其中20 mmol/L?；撬嶙饔米顝?。

已有的體外細胞實驗顯示,Yanagita等在HepG2細胞加入0.1 mmol/L和1 mmol/L?；撬?細胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯水平顯著下降[12],而我們之前的研究也顯示?；撬?1～20 mmol/L)作用顯著降低HepG2細胞內(nèi)TC、FC和EC[6]。這些?；撬釋φepG2細胞的作用與本研究中對高膽固醇模型的作用不同,可見對于高膽固醇細胞需要較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)?；撬岱跤拍鼙憩F(xiàn)出降低膽固醇的效果。

2.2牛磺酸對高膽固醇HepG2細胞CYP7A1表達的影響

?；撬釋毎鸆YP7A1及其調(diào)控分子的表達實驗均選取降低膽固醇作用的最佳濃度20 mmol/L。從圖1可知,20 mmol/L?；撬岱謩e作用12、24和48 h,與模型對照組比較CYP7A1表達量在24 h時顯著上升(p<0.05)。據(jù)此,后續(xù)調(diào)控CYP7A1表達的分子檢測實驗選取20 mmol/L?；撬岱跤?4 h。在正常HepG2細胞也有對CYP7A1作用的報道,?；撬?0～20 mmol/L)可誘導(dǎo)細胞內(nèi)CYP7A1 mRNA和蛋白表達水平增加,且具有濃度依賴性和時間依賴性[6,8]。

圖1　?；撬釋Ω吣懝檀糎epG2細胞CYP7A1表達的影響 Fig.1　The effect of taurine on the expression of CYP7A1 in high-cholesterol HepG2注:N:正常對照組;H:高膽固醇模型組;T:牛磺酸組;A:CYP7A1和內(nèi)參蛋白條帶代表圖;B:CYP7A1相對表達量柱狀圖;*:p<0.05。

2.3牛磺酸對高膽固醇HepG2細胞內(nèi)調(diào)節(jié)CYP7A1表達重要分子的影響

體內(nèi)有多條信號途徑嚴(yán)密調(diào)控CYP7A1的表達以維持機體膽固醇膽汁酸的平衡。一方面,膳食膽固醇與肝X受體α(LXRα)結(jié)合活化后可上調(diào)CYP71的表達,促進膽汁酸的生成[11,13-14]。另一方面,產(chǎn)生的膽汁酸又可與膽汁酸受體(FXR)結(jié)合活化而抑制CYP7A1的表達。到目前為止,CYP7A1啟動子的invitro研究分析以及HNF4α缺失小鼠的實驗都已證實肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子(HNF4α)是CYP7A1表達的重要調(diào)控因子,可促進CYP7A1轉(zhuǎn)錄表達,增加膽固醇向膽汁酸的生物轉(zhuǎn)化[15-16]。膽汁酸可以通過LXR/FXR-依賴與FXR-非依賴兩條負(fù)反饋途徑抑制HNF4α的作用,從而降低CYP7A1的轉(zhuǎn)錄表達,實現(xiàn)CYP7A1表達平衡[8,11,17]。本研究重點鎖定?；撬釋YP7A1表達負(fù)反饋通路FXR-非依賴途徑的影響。在FXR-非依賴途徑中,主要包括MAPK、ERK、JNK、c-Jun等信號因子。在這條途徑中,產(chǎn)生的膽汁酸會通過激活MAPK/JNK、MAPK/ERK途徑,激活和磷酸化轉(zhuǎn)錄因子c-Jun,而磷酸化的c-Jun(p-c-jun)與HNF-4α的結(jié)合可抑制HNF-4α的表達或活性,直接導(dǎo)致CYP7A1表達下調(diào)[17-18]。

圖2　?；撬釋φ{(diào)節(jié)高膽固醇肝細胞內(nèi)CYP7A1表達的關(guān)鍵分子的影響Fig.2　The effect of taurine on several key moleculars associated with CYP7A1 expressions in high-cholesterol HepG2注:N:正常對照組;H:高膽固醇模型組;T:?；撬峤M;A、B、C和D:分別為MAPK、ERK、JNK和c-Jun/p-c-Jun蛋白表達結(jié)果,每組圖中上為目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶代表圖，下為目的蛋白相對表達量柱狀圖;*:p<0.05。

由圖2結(jié)果可知,與正常對照組相比較,高膽固醇模型組MAPK表達下降而ERK、JNK、c-jun和p-c-jun表達無明顯變化。從圖2A～圖2C可以看出,20 mmol/L?；撬嶙饔糜诟吣懝檀糎epG2細胞模型24 h,細胞內(nèi)MAPK、ERK和JNK表達比模型細胞組明顯下降(p<0.05);圖2D結(jié)果表明20 mmol/L?；撬崾辜毎麅?nèi)c-jun和p-c-jun表達也明顯降低(p<0.05)。這些結(jié)果說明20 mmol/L?；撬犸@著降低了細胞內(nèi)關(guān)鍵信號分子MAPK、ERK、JNK、c-jun和p-c-jun的蛋白表達水平。

由圖3可以看出,高膽固醇模型與正常對照組比較細胞內(nèi)HNF4α表達無明顯差異,且20 mmol/L?；撬釋Ω吣懝檀糎epG2細胞HNF4α也無明顯影響。

圖3　?；撬釋Ω吣懝檀糎epG2細胞HNF4α表達的影響Fig.3　The effect of taurine on the expression of HNF4α in high-cholesterol HepG2注:N:正常對照組;H:高膽固醇模型組;T:?；撬峤M;圖中上為HNF4α蛋白和內(nèi)參蛋白條帶代表圖，下為目的蛋白相對表達量柱狀圖。

以上這些結(jié)果提示?；撬峥赡芤种屏四懼釋APK/ERK、MAPK/JNK通路的激活,使得c-Jun表達及其磷酸化也受到抑制,導(dǎo)致p-c-Jun的蛋白表達下降,減少了其與HNF-4α的結(jié)合,最終減弱了產(chǎn)生的膽汁酸對CYP7A1的反饋性抑制,使CYP7A1蛋白表達顯著增加。

3　結(jié)論

綜上所述,10 mmol/L和20 mmol/L牛磺酸作用48 h可顯著降低高膽固醇HepG2細胞內(nèi)膽固醇水平,增加膽汁酸生成;20 mmol/L?；撬嶙饔糜诟吣懝檀糎epG2細胞24 h,可抑制MAPK/ERK和MAPK/JNK表達水平,降低c-jun蛋白表達及c-jun磷酸化水平,促進了CYP7A1蛋白表達升高,從而加速膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸。

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Cholesterol-lowering effect of taurine and its mechanism in high-cholesterol HepG2 cells

GUO Jun-xia,ZHANG Jing,ZHANG Shan,GAO Ya,CHEN Wen*

(College of Applied Arts and Science,Beijing Union University,Beijing 100191,China)

Objective:To study the effect of taurine on cholesterol degradation and its preliminary mechanism. Methods:HepG2 cells were treated with 1,10,and 20 mmol/L taurine for 48 h after being cultured in DMEM supplemented with 0.02 mmol/L cholesterol. Then the levels of intracellular total cholesterol(TC),free cholesterol(FC),ester cholesterol(EC),total bile acids(TBAc)and medium TBA(TBAm)were determined. The expression of CYP7A1 and its regulatory key molecules were detected by western blot after HepG2 cells were incubated with 20 mmol/L taurine for 24 h. Results:TC,FC and EC were significantly reduced and TBAc and TBAm were increased by 10 mmol/L and 20 mmol/L taurine for 48 h-treatment(p<0.05 orp<0.01). The expression of CYP7A1 was significantly increased by 20 mmol/L taurine at 24 h(p<0.05). The expression of MAPK,ERK,JNK,c-jun and p-c-jun were obviously decreased(p<0.05)and the expression of HNF4αhad no significant change by 20 mmol/L taurine for 24 h. Conclusion:Taurine can enhance CYP7A1 expression by inhibiting MAPK/JNK,MAPK/ERK and c-Jun/p-c-Jun expression,to promote the transformation of cholesterol to bile acid in liver cells.

taurine;cholesterol;bile acid;CYP7A1;HepG2 cell

2016-01-20

郭俊霞(1976-)，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)與功能，E-mail:junxia@buu.edu.cn。

陳文(1966-)，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)與功能，E-mail:wlchenwen@buu.edu.cn。

北京市自然科學(xué)基金資助項目(5142004)；北京市教委科技計劃面上項目(KM201511417014)；北京聯(lián)合大學(xué)新起點計劃項目(Zk10201404)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)13-0112-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.014