唐霞光,張春妹,劉　嘉,肖培云,*,楊永壽

(1.大理大學藥學與化學學院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室,云南大理 671000)

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美洲大蠊不同提取物清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化活性研究

唐霞光1,張春妹1,劉嘉1,肖培云1,*,楊永壽2

(1.大理大學藥學與化學學院,云南大理 671000;2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室,云南大理 671000)

目的:研究美洲大蠊不同提取物ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化活性的作用。方法:采用DPPH法研究美洲大蠊不同提取物清除自由基的能力,用硫代巴比妥酸(TBARS)法研究美洲大蠊提取物對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的抑制作用,評價其抗脂質(zhì)過氧化能力。結(jié)果:美洲大蠊不同提取物對DPPH自由基均有一定的清除作用,能抑制肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。結(jié)論:ML-A2對DPPH自由基的清除作用最強,ML-A4對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用最強。

美洲大蠊提取物,氧自由基,脂質(zhì)過氧化,抗氧化

美洲大蠊,作為一種傳統(tǒng)中藥材,因其對多種疾病的治療作用而逐漸引起人們的關注。然而,美洲大蠊的食用價值至今開發(fā)較少,加之人們一直視蟑螂為害蟲,對食用昆蟲藥了解甚微,導致美洲大蠊多以可食用干燥蟲品及精粉在市場流通。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)蟑螂含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦質(zhì)元素和微量元素,具有很高的藥用、食用價值。隨著人們生活水平的提高,人們對健康問題的關注更加密切,具有預防疾病及延緩衰老功能的保健品逐漸成為人們的首選。

自由基主要包括各種形式的活性氧,性質(zhì)活潑,氧化作用極強[1],能直接與細胞膜上的成分發(fā)生反應,引起細胞膜脂質(zhì)過氧化,使相應蛋白質(zhì)和酶的活性發(fā)生改變,損傷線粒體,攻擊DNA,誘導基因突變[2],對人體產(chǎn)生很大的傷害。臨床上常見的免疫性損傷和炎性損傷等與氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化反應密切相關。藥用昆蟲美洲大蠊(Periplanetaamericana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲,俗稱“蟑螂”,其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3],研究表明,美洲大蠊不同提取物具有抗腫瘤、抗病毒、促進組織修復等作用[4-6]。近年來隨著對美洲大蠊化學成分及藥理作用的深入研究,其藥用價值也受到廣泛的關注,以美洲大蠊為原料的抗乙肝病毒新藥“肝龍膠囊”及正在研發(fā)的抗衰老活性部位均有一定的體外抗氧化作用[7-8]。

DPPH法來評價外源抗氧化劑和植物抗氧化能力是一種快速、簡便、靈敏、直接可行的方法,抗氧化劑直接作用于DPPH自由基,與間接測定氧化產(chǎn)物的減少的方法相比,該法通過測定DPPH自由基吸收的變化即可評價藥物的抗氧化能力[9]。體內(nèi)抗氧化能力評價主要是借助氧化應激生物標志物的測定來判斷生物活性物質(zhì),其中對脂質(zhì)過氧化的保護程度是常用評價方法之一,硫代巴比妥酸(TBARS)法就是一種被廣泛使用、非侵入性的體內(nèi)評價脂質(zhì)過氧化方法[10]。本研究從美洲大蠊中經(jīng)過分離純化得到不同的提取部位,采用 DPPH與TBARS法相結(jié)合,系統(tǒng)研究不同提取部位清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化的作用效果,旨在為下一步的藥理活性研究和美洲大蠊資源的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

美洲大蠊不同溶劑提取物凍干粉;1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)東京化成工業(yè)株式會社;硫代巴比妥酸國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、維生素C均為分析純;水超純水;SD昆明大鼠,180～220 g,雄性,大理大學實驗動物中心提供。

UV2500型紫外分光光度計日本島津公司;GeneQuant 100型微量紫外分光光度計美國Ge公司;LC-4012型低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1美洲大蠊不同提取物對DPPH的清除作用DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,其無水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收[11]。DPPH自由基與美洲大蠊不同提取物溶液反應后,DPPH自由基的量會減少,在517 nm處的吸光度值會降低,通過計算反應后DPPH自由基的清除率評價抗氧化劑的抗氧化能力[12]。參考文獻方法略作修改[7-8],實驗分為空白管、對照管、藥物底管及藥物管,藥物底管和藥物管中分別精密加入美洲大蠊不同提取物溶液1 mL,空白管及藥物底管中精密加入2.0 mL無水乙醇,對照管及藥物管中精密加入2 mL 0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液(均在10 mL棕色量瓶中操作),密封,混勻,暗處放置30 min,用超純水定容至刻度,搖勻,于517 nm處測定吸光值,按下式計算自由基的清除率:

DPPH清除率:I(%)=[A對-(A藥物管-A藥物底管)]/A對×100

其中:A對為對照管的吸光度,A藥物管為加入藥物溶液的吸光度,A藥物底管為不加DPPH藥物溶液本底的吸光度。

1.2.2美洲大蠊提取物大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用將健康大鼠禁食12 h,麻醉后迅速取肝臟,剪去脂肪及筋膜組織,用預冷的生理鹽水洗凈,濾紙拭干,稱重后,剪碎。以生理鹽水為勻漿介質(zhì),肝臟與生理鹽水重量比為1∶9,用玻璃勻漿器在冰水浴中研磨制得10%大鼠肝勻漿,低溫離心(3000 r/min,10 min),取上清液于冰箱中冷凍備用。參照文獻方法略作修改[13],實驗分空白管、對照管、藥物底管和藥物管。取10%肝組織勻漿上清液0.5 mL分別加入對照管和藥物管,空白管和藥物底管加0.5 mL生理鹽水。藥物管和藥物底管加入不同濃度的美洲大蠊提取物0.5 mL,空白管和對照管加入蒸餾水0.5 mL,搖勻,37 ℃恒溫水浴振蕩1 h,各管加入10%硫代巴比妥酸溶液(精密稱取0.5 g硫代巴比妥酸于50 mL棕色容量瓶中,先用1 mol/L NaOH溶液溶解,再用10%三氯乙酸定容至刻度),80 ℃水浴15 min,冷卻,離心(3000 r/min,10 min),以空白管標零,取上清液于532 nm處測定吸光度,平行操作三次,按下式計算抑制率:

抑制率:I(%)=[A對-(A藥物管-A藥物底管)]/A對×100

其中:A對為對照管的吸光度,A藥物管為加入藥物溶液的吸光度,A藥物底管為不加大鼠肝組織勻漿藥物溶液本底的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1維生素C對DPPH·的清除作用

維生素C具有很強的抗氧化活性,在天然產(chǎn)物抗氧化活性研究中維生素C常被用來作為評價抗氧化能力強弱的參照[14]。用1.2.1項下方法測定維生素C對DPPH自由基的清除曲線,其結(jié)果如圖1,根據(jù)計算,IC50值為0.0106 mg/mL。

圖1　維生素C對DPPH自由基的清除曲線Fig.1　The clearance curve of VC on DPPH free radical

2.2美洲大蠊不同提取物對DPPH自由基的清除作用

如圖2為美洲大蠊不同提取物對DPPH自由基的清除曲線,由圖可知,美洲大蠊不同提取物對DPPH自由基均有一定的清除作用,但強弱有所不同。隨著提取物濃度的升高,清除DPPH自由基的能力也增強。與其他提取物相比,ML-A與ML-A2對DPPH自由基的清除作用較強,藥物濃度為1.0 mg/mL時清除率可以達到80%以上。根據(jù)計算,各提取物清除DPPH的IC50值分別為:ML-A,0.336 mg/mL;ML-A1,0.966 mg/mL;ML-A2,0.311 mg/mL;ML-A3,0.436 mg/mL;ML-A4,0.474 mg/mL;ML-A5,0.652 mg/mL;ML-A6,27.55 mg/mL;ML-A7,5.32 mg/mL。以IC50值評價,可知ML-A2對DPPH的清除作用最強。

圖2　美洲大蠊不同提取物對DPPH自由基的清除曲線Fig.2　The clearance curve of Periplaneta Americanadifferent extract on DPPH free radical

2.3維生素C對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用

丙二醛(MDA)作為一種脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,是反映細胞氧化損傷程度的一個重要指標。用硫代巴比妥酸(TBA)法考察抗氧化劑對MDA的抑制作用,以此評價抗氧化劑抗脂質(zhì)過氧化活性[13]。用1.2.2項下方法評價維生素C對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的抑制作用,結(jié)果如表1。三個質(zhì)量濃度的維生素C均可抑制肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化,其中當VC反應濃度為1.5 mg/mL時,對MDA的抑制作用可以達到70%以上。

表1維生素C對肝組織勻漿自發(fā)性

Table 1The inhibition of VCon MDA

樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)抑制率(%)維生素C0.543.20±1.211.060.68±1.941.570.39±1.75

2.4美洲大蠊不同提取物對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用

測定5.0、10.0、15.0 mg/mL三個劑量點時美洲大蠊不同提取物對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用,結(jié)果如表2。隨著藥物濃度增加,各提取物對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化抑制作用也逐漸增強。當藥物濃度為5.0 mg/mL時,各提取物的抑制作用差異較大。其中,ML-A4抑制率最高(49.35%±1.50%),抑制作用最強;ML-A6抑制率最低(4.69%±0.73%),抑制作用最弱。當藥物濃度為10.0 mg/mL時,除ML-A6(39.32%±5.34%)與ML-A7(44.98%±2.28%)兩者抑制作用較弱外,其它提取物抑制作用相當。當藥物濃度為10.0 mg/mL時,ML-A與ML-A4抑制作用最強,抑制率分別為72.65%±2.91%、72.33%±1.94%。綜上可知,ML-A4對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用最強,抗脂質(zhì)過氧化活性最高。

樣品質(zhì)量濃度(mg/mL)抑制率(%)ML-A5.036.25±1.5510.051.29±4.5015.072.65±2.91ML-A15.037.06±2.7710.049.84±4.3715.066.34±2.96ML-A25.029.61±2.4310.049.84±4.3715.065.53±2.72ML-A35.026.54±1.0210.048.22±2.7215.062.62±3.01ML-A45.049.35±1.5010.060.84±2.9115.072.33±1.94ML-A55.032.20±3.6910.049.68±2.4315.066.02±0.97ML-A65.04.69±0.7310.039.32±5.3415.054.53±2.43ML-A75.08.74±3.2010.044.98±2.2815.058.58±2.96

綜上,美洲大蠊不同提取物、維生素C均有清除DPPH自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用,隨著質(zhì)量濃度的增加作用增強。美洲大蠊提取物表現(xiàn)出較強的抗氧化活性,但活性弱于維生素C。通過DPPH、TBA法這兩種方法檢測美洲大蠊不同提取物的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)ML-A2對DPPH自由基的清除作用最強,IC50值為0.311 mg/mL;ML-A4對大鼠肝組織勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的抑制作用最強,抑制率在70%以上。兩種方法測定結(jié)果有一定差異,原因可能是不同提取部位中組成成分及含量不同,適用方法不一樣。

3　討論

本實驗發(fā)現(xiàn)美洲大蠊不同提取物均有清除自由基及抗脂質(zhì)過氧化的作用,其中ML-A2為清除DPPH自由基活性最強的部位,ML-A4為抗脂質(zhì)過氧化活性最強的部位。研究結(jié)果說明美洲大蠊在保健品開發(fā)方面具有很高的潛力,本實驗針對美洲大蠊不同提取物抗氧化能力進行評價,其抗氧化活性與治療疾病之間的相關性有待進一步研究。

[1]劉敏,肖穎,左愛仁,等.槲皮素、根皮素、水飛薊賓清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化活性研究[J].中成藥,2012,34(4):753-756.

[2]Esfahani A,Ghoreishi Z,Nikanfar A,et al.Influence of chemotherapy on the lipid peroxidation and antioxidant status in patients with acute myeloid leukemia[J].Acta Med Iran,2012,50(7):454-458.

[3]孫星衍.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:商務印書館,1955:90.

[4]Luo T S,Gao M T,Ma F F,et al.Research advances in pharmacological action and clinical application of Periplaneta Americana[J].Journal of Anhui Agricultural Science & Technology,2012,13(4):888-892.

[5]Jiang L Y,Liu X,Xia C L,et al. Research advances on chemical constituents and anti-tumor effects of Periplaneta Americana L[J].Medicinal Plant,2012,3(11):95-97.

[6]王翠芬,潘彩蓮,江連湖.康復新液配合紅外線治療褥瘡76例療效觀察[J].當代醫(yī)學,2012,18(14):20-21.

[7]張成桂,焦春香,何正春,等.肝龍不同有效部位體外抗氧化活性的分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(1):69-71.

[8]焦春香,張成桂,劉光明,等.美洲大蠊提取物中抗衰老活性部位抗氧化活性的初步分析[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(6):1389-1391.

[9]彭長連,陳少薇,林植芳,等.用清除有機自由基DPPH法評價植物抗氧化能力[J].生物化學與生物物理進展,2000,27(6):658-661.

[10]劉小兵,樸建華.生物活性物質(zhì)的抗氧化能力評價方法及其研究進展[J].中國食品衛(wèi)生雜志,2008,20(5):440-444.

[11]熊雙麗,盧飛,史敏娟,等.DPPH自由基清除活性評價方法在抗氧化劑篩選中的研究進展[J].食品工業(yè)科技,2012,33(8):380-383.

[12]韋獻雅,殷麗琴,鐘成,等.DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J].食品科學,2014,35(9):317-322.

[13]Wei Y M,Li W G. The effects of sijunzi decoction on anti-lipid peroxidation and active oxygen free radicalsinvitro[J]. Chinese J Animal and veterinary Sci,2002,32(2):32-33.

[14]趙杰,官守濤,孫設宗,等.半枝蓮多糖清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化作用[J].中成藥,2012,34(7):1361-1364.

Research of the effect ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on scavenging free radical and anti-lipid perxidation

TANG Xia-guang1,ZHANG Chun-mei1,LIU Jia1,XIAO Pei-yun1,*,YANG Yong-shou2

(1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali 671000,China;2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali 671000,China)

Objective:To study the effect of scavenging free radical and anti-lipid perxidation onPeriplanetaAmericanadifferent extract(ML-A,ML-A1,ML-A2,ML-A3,ML-A4,ML-A5,ML-A6,ML-A7). Method:DPPH was used to study the ability of scavenging free radicals ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts. Using TBA to study the inhibition ofPeriplanetaAmericanadifferent extracts on MDA in the rat liver tissue homogenate. Result:PeriplanetaAmericanadifferent extracts had certain scavenging effect on DPPH· and could inhibit MDA the rat liver tissue lipid oxidation products of spontaneous generation. Conclusion:During the different extracts ofPeriplanetaAmericana,ML-A2 had the strongest effect of scavenging DPPH·,ML-A4 had the strongest effect of anti-lipid perxidation.

PeriplanetaAmericanaextracts;Oxygen free radical;lipid perxidation;antioxidant

2015-11-16

唐霞光(1991-),女,碩士研究生,主要從事美洲大蠊抗肺纖維化研究,E-mail:874808019@qq.com。

肖培云(1970-),女,碩士,教授,主要從事昆蟲藥物研究開發(fā),E-mail:xpy990120@126.com。

國家自然科學基金(81360634,81560634);云南省科技廳應用基礎研究重點項目(2015FA025)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0083-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.008