趙學(xué)思,師仁麗,李　巖,于文龍,王向紅,*

(1.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北滄州 061000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001)

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堿蓬黃酮提取物的體外抗氧化及抑菌性研究

趙學(xué)思1,師仁麗2,李巖2,于文龍2,王向紅2,*

(1.滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北滄州 061000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001)

本研究對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期的鹽地堿蓬中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行提取,并對(duì)其抗氧化性和抑菌性進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)采用超聲波法提取黃酮類(lèi)化合物,采用4種不同的方法(還原力,抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力,DPPH·,·OH)評(píng)價(jià)堿蓬黃酮提取物的抗氧化活性,采用牛津杯法測(cè)定其抑菌活性。結(jié)果表明:展葉期,發(fā)芽期,花期的黃酮得率分別為0.728%,0.518%,1.461%。不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬黃酮具有不同的還原能力、清除DPPH·和·OH的活性。不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的堿蓬總黃酮提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的抑制作用,在花期的總黃酮提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳,抑菌圈直徑分別為19.54 mm和29.46 mm。說(shuō)明花期的堿蓬總黃酮提取物最適宜作為一種天然的抗氧化劑和抑菌劑而廣泛利用。

堿蓬,黃酮類(lèi)化合物,抗氧化性,抑菌性

堿蓬為藜科(chenopodiaceae)堿蓬屬(suaedaforsk.)植物,為一年生葉肉質(zhì)化真鹽生草本植物[1],在5～30 g/kg土壤含鹽量生境中有分布[2]。我國(guó)共有堿蓬屬植物20種,常見(jiàn)種分別為堿蓬(Suaedaglauca(Bge.)Bge.)和鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.)Pall),以堿蓬產(chǎn)量最大[3],生于海濱、荒地、田邊等含鹽堿的土壤中,全株富含碳酸鉀,可供工業(yè)用。

堿蓬的營(yíng)養(yǎng)成分豐富,是一種優(yōu)質(zhì)的蔬菜和油料作物,保健價(jià)值極高[4]。有相關(guān)研究報(bào)道表明,工業(yè)上可用堿蓬籽油來(lái)制備共軛亞油酸和硬脂酸,共軛亞油酸由于其具有抗氧化、抗腫瘤、降脂等功效而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥,同時(shí),堿蓬還能消除裸露鹽堿荒灘,防止水土流失,保持和重建鹽地生態(tài)等[3]。

黃酮類(lèi)化合物是植物產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物,是一類(lèi)重要的天然化合物,對(duì)人體健康起著重要的作用。大量研究表明黃酮類(lèi)物質(zhì)具有降血壓、降血脂、增大心臟血流量、增強(qiáng)心臟收縮、減少心臟搏動(dòng)數(shù)、止咳祛痰、抗菌消炎的功效[5]。

堿蓬中黃酮類(lèi)化合物的研究少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)在不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的堿蓬的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了定性和定量的測(cè)定,通過(guò)測(cè)定其還原力,Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過(guò)不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化體系中的抗氧化活性,對(duì)DPPH·、·OH的清除活性,評(píng)價(jià)了堿蓬黃酮類(lèi)化合物的抗氧化活性,并采用抑菌圈和最低抑菌濃度等實(shí)驗(yàn)研究了其抑菌活性。為堿蓬資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌(E.coli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中國(guó)微生物菌種保藏中心;堿蓬2014年采于河北滄州地區(qū);蘆丁對(duì)照品(≥99%)中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn);石油醚(60～90 ℃),無(wú)水乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉天津市華東試劑廠;鄰二氮菲,三氯乙酸天津市天力化學(xué)試劑;硫酸亞鐵,雙氧水北京市中聯(lián)化工;鐵氰化鉀天津市福晨化學(xué)試劑廠;氯化鐵天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;DPPH北京索萊寶科技有限公司;硫代巴比妥酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BS214D型分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;101-OAB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;萬(wàn)能粉碎機(jī)浙江屹立工貿(mào)有限公司;UV-2800H型紫外分光光度計(jì)尤尼柯儀器有限公司;XMTD-6000型恒溫水浴鍋北京長(zhǎng)風(fēng)儀表公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;QTSX6150型超聲波清洗器天津市瑞普電子儀器公司;TGL16M型離心機(jī)長(zhǎng)沙易達(dá)儀器公司;滅菌鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理將收集到的堿蓬,用清水洗凈,置于45 ℃烘箱內(nèi)烘干,取出后粉碎并過(guò)40目篩,備用。

1.2.2堿蓬中黃酮類(lèi)化合物的提取稱取堿蓬樣品1 g,置于燒杯中,加10 mL石油醚(60～90 ℃),超聲提取30 min,功率200 W,除脂,在水浴下?lián)]干石油醚,加40 mL 70% 甲醇(v/v),浸泡45 min后再超聲提取20 min,重復(fù)一次,合并提取液,將提取液離心15 min(4500 r/min)。棄去沉淀得到總黃酮提取液,放于50 mL的容量瓶中,定容。

1.3總黃酮含量的測(cè)定

1.3.1對(duì)照品溶液的配制精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,溶解在95%的乙醇中,定容至10 mL的容量瓶中,再?gòu)闹袦?zhǔn)確量取5 mL,用95%的乙醇稀釋定容至50 mL的容量瓶中,得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用NaNO3-Al(NO3)3-NaOH比色法[6],精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,不足5 mL的用95%乙醇補(bǔ)充,加入0.5 mL 5%的NaNO2溶液,靜置6 min;加入0.5 mL的10%的Al(NO3)3溶液,靜置6 min;最后加入4%的NaOH溶液4 mL,放置10 min。測(cè)定其在510 nm處的吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用以上方法測(cè)定樣品的吸光值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品中總黃酮含量。

1.4還原力的測(cè)定

采用孟娜等人的方法[7],取2.0 mL不同濃度的總黃酮溶液,分別加入pH為6.6的0.2 mol/L 磷酸緩沖液2.0 mL及1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL,50 ℃孵育20 min后快速冷卻,加入10%三氯乙酸水溶液2.0 mL,于3000 r/min離心10 min,取上清液5.0 mL,加蒸餾水5.0 mL及0.1%三氯化鐵水溶液1.0 mL,充分混勻后,在室溫下靜置10 min,于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。

1.5Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過(guò)不飽和脂肪酸(PUFA)過(guò)氧化體系中的抗氧化活性

按照周媛等人的方法[8],稍作修改,配制濃度分別為10,50,100,200,300,400,500 mg/mL的三個(gè)時(shí)期的堿蓬黃酮溶液,VC溶液為樣品溶液。選用1∶25的卵黃懸液并吸取0.2 mL,加入黃酮溶液0.1,0.2 mL FeSO4溶液和1.5 mL 0.1 mol/L PBS溶液,37 ℃培養(yǎng)15 min。加三氯乙酸(TCA),靜置離心后吸取2.0 mL上清液加入硫代巴比妥酸(TBA),放入沸水浴中15 min,冷卻后,于532 nm處比色測(cè)定吸光度值(A),對(duì)照管除不加提取液外,其他試劑相同,所測(cè)吸光值為A0,樣品及VC和PBS對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率(AOA)根據(jù)以下公式計(jì)算。

AOA(%)=(A0-A)/A0×100

1.6對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·清除率的測(cè)定:取2.2所得堿蓬黃酮提取液,真空減壓濃縮,經(jīng)真空冷凍干燥后得到干燥的堿蓬粗提物。準(zhǔn)確稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL取2 mL,加入等體積的0.2 mol/L 的DPPH·溶液,混勻。避光放置30 min,在517 nm測(cè)定其吸光度Ai。

清除率(%)=(1-Ai-Aj/Ac)×100

式中,Ai:待測(cè)液+DPPH;Ac:無(wú)水乙醇+DPPH;Aj:待測(cè)液+無(wú)水乙醇。

1.7對(duì)·OH清除率的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[10],修改如下:取不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬黃酮提取物,準(zhǔn)確稀釋為10、20、40、60、80、100 μg/mL,取1 mL依次向樣液中加入2 mL磷酸鹽緩沖液,2 mL鄰二氮菲,2 mL硫酸亞鐵溶液,1 mL 0.1%雙氧水,充分混勻后在532 nm處測(cè)其吸光度。

清除率(%)=(A0-A1)/(A2-A1)×100

式中,A1:70%乙醇代替樣液所測(cè)的吸光度;A2:用70%乙醇替代H2O2所測(cè)的吸光度值。

1.8抑菌性的測(cè)定

1.8.1抑菌能力的測(cè)定以平板菌落計(jì)數(shù)法配制濃度約為0.5×107CFU/mL的菌懸液[11]。

準(zhǔn)確吸取菌懸液0.1 mL均勻涂布在平皿上,在平板上等距離放入4個(gè)經(jīng)滅菌的牛津杯,分別加入100 μL堿蓬黃酮提取液,用70%的乙醇做對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑,并記錄,各菌重復(fù)3次,結(jié)果以mm表示。

1.8.2最低抑菌濃度的測(cè)定采用2倍稀釋法,將樣品溶液分別稀釋到0.05,0.0125,0.00625,0.003125,0.00156。在每個(gè)牛津杯內(nèi)加入100 μL堿蓬黃酮提取液,用70%的乙醇做對(duì)照。28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑不同濃度的稀釋液,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,觀察菌落情況。在沒(méi)有抑菌圈的最高稀釋度提取物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次,采用spss19.0軟件進(jìn)行多重比較分析。

2　結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

以1.3.2的方法進(jìn)行測(cè)定,由圖1可得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Y=13.220x+0.0033,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9999。

圖1　蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2總黃酮含量

圖2顯示了在不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)堿蓬總黃酮含量的變化。由圖2可知,在不同生長(zhǎng)時(shí)期,堿蓬的總黃酮含量不同。在整個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi),花期的總黃酮含量遠(yuǎn)高于發(fā)芽期和展葉期,展葉期的總黃酮含量最低,三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期黃酮含量差異極顯著(p≤0.01)，展葉期、發(fā)芽期、花期黃酮得率分別為0.728%、0.518%、1.461%。

圖2　堿蓬總黃酮含量Fig.2　Total flavonoid contents of Suaeda

2.3還原力測(cè)定

從圖3可以看出,不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬總黃酮具有一定的還原力,隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增大,其吸光度也增加。還原力強(qiáng)弱順序?yàn)檎谷~期>花期>發(fā)芽期。

圖3　不同濃度堿蓬總黃酮的還原力Fig.3　Reducing power of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.4抗脂質(zhì)過(guò)氧化性

由圖4可以看出,所有樣品隨著濃度的降低,對(duì)卵黃脂蛋白過(guò)氧化的抑制效果減小,濃度范圍在300～500 mg/mL時(shí),花期的總黃酮抑制率大于VC。三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬在Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過(guò)不飽和脂肪酸過(guò)氧化體系中的抗氧化活性大小順序?yàn)榛ㄆ?展葉期>發(fā)芽期,但是濃度范圍在200 mg/mL時(shí),花期的總黃酮抑制率是最低的。

圖4　不同濃度堿蓬總黃酮對(duì)過(guò)氧化的抑制率Fig.4　The inhibition rate of different concentration of total flavonoids from Suaeda

2.5對(duì)DPPH·的清除作用

從圖5可以看出,不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)DPPH·均具有一定的清除作用,并且在一定范圍內(nèi),清除能力隨總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)逐漸增大,超過(guò)這個(gè)范圍后,變化不太明顯,甚至有降低的趨勢(shì),表明堿蓬總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除能力與質(zhì)量濃度之間存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)堿蓬總黃酮提取物的濃度達(dá)到60 μg/mL時(shí),各生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的堿蓬總黃酮幾乎均達(dá)到最大的清除率,對(duì)DPPH·的清除作用在花期達(dá)到最大,為91.43%,而在展葉期最低,為69.87%,發(fā)芽期的清除作用最高為89.36%。

表2　堿蓬總黃酮提取物最低抑菌濃度

注：“+”表示有抑菌圈;“-”表示無(wú)抑菌圈。

圖5　堿蓬在不同生長(zhǎng)時(shí)期的總黃酮對(duì)DPPH·的清除作用Fig.5　DPPH radical scavenging activity of total flavonoids extract from Suaeda

2.6對(duì)·OH的清除作用

從圖6可以看出,在一定范圍內(nèi),堿蓬黃酮提取物對(duì)·OH的清除率隨黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大。表明堿蓬總黃酮含量與清除作用存在量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為60 μg/mL時(shí),發(fā)芽期和花期的堿蓬總黃酮達(dá)到最大的清除率,為50.3%和54.46%。而展葉期的堿蓬總黃酮在40 μg/mL時(shí)達(dá)到最大的清除率,為33.5%。黃酮濃度在10～40 μg/mL范圍時(shí),堿蓬在發(fā)芽期的總黃酮提取物對(duì)·OH的清除作用要大于其在展葉期和花期的清除作用,而濃度范圍在40～100 mg/mL時(shí),花期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)·OH的清除作用大于其在展葉期和發(fā)芽期的清除作用。

圖6　堿蓬不同生長(zhǎng)時(shí)期的總黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6　The ·OH radical scavenging ability of total flavonoids extract from Suaeda

2.7抑菌作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7.1抑菌能力的測(cè)定從表1可以看出,不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有較明顯的抑制作用,對(duì)后者的抑制作用要高于對(duì)前者的抑制作用。處在花期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)大腸桿菌(19.54 mm)和金黃色葡萄球菌(29.46 mm)的抑菌圈直徑要大于其在發(fā)芽期(13.10 mm,15.27 mm)和展葉期(14.19 mm,14.53 mm)的抑菌圈直徑。

表1　不同生長(zhǎng)時(shí)期堿蓬黃酮提取物(1 mg/mL)對(duì)供試菌的抑菌效果

2.7.2最低抑菌濃度的確定由表2可知,同一生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)堿蓬總黃酮提取物對(duì)不同菌的最低抑菌濃度不同,而不同生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)同一種菌的最低抑菌濃度也不同。發(fā)芽期,展葉期和花期的堿蓬總黃酮提取物對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.25、0.25、0.125 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.125、0.125、0.00625 mg/mL。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在花期的堿蓬總黃酮含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在發(fā)芽期和展葉期,因此,提取堿蓬中的總黃酮的最佳時(shí)期為花期。

抗氧化實(shí)驗(yàn)證明,不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的堿蓬總黃酮有一定的還原力與抗脂質(zhì)過(guò)氧化性,對(duì)DPPH·和·OH均具有一定的清除作用。還原力強(qiáng)弱順序?yàn)檎谷~期>花期>發(fā)芽期。三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的堿蓬在Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過(guò)不飽和脂肪酸過(guò)氧化體系中的抗氧化活性大小順序?yàn)榛ㄆ?展葉期>發(fā)芽期,但是濃度范圍在200 mg/mL時(shí),花期的總黃酮抑制率是最低的。

不同生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的堿蓬總黃酮對(duì)DPPH·的清除效果要大于對(duì)·OH的清除效果,這可能是因?yàn)椴煌L(zhǎng)時(shí)期的堿蓬所含的黃酮的種類(lèi)不同。

堿蓬總黃酮提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用大于對(duì)大腸桿菌的抑制作用。

我國(guó)堿蓬資源豐富但是利用并不充分。隨著科技的進(jìn)步和對(duì)安全因素的考慮,合成抗氧化劑被天然抗氧化劑取代是必不可擋的趨勢(shì),因此,開(kāi)發(fā)天然的,安全的,成本低廉的抗氧化劑必然成為今后研究的熱點(diǎn)。本研究證明堿蓬是一種具有開(kāi)發(fā)前景的抗氧化劑,同時(shí)本實(shí)驗(yàn)對(duì)植物提取物的開(kāi)發(fā)和植物資源的綜合利用提供了新的思路和途徑。

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Antioxidation and antibacterial property of flavonoids compounds extracted fromSuaeda

ZHAO Xue-si1,SHI Ren-li2,LI Yan2,YU Wen-long2,WANG Xiang-hong2，*

(1.Vocational and technical college of Cangzhou,061000,China;2.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

In this study,the flavonoid compounds in different growth periods ofSuaedasalsawere extracted,and their antioxidant and antimicrobial were studied. Ultrasonic method was used to extract flavonoids. Four methods(reducing power,resisting lipid peroxidation,eliminating DPPH·,·OH)were used to evaluate the antioxidant activity of flavonoids extracted fromSuaedasalsa.The antibacterial activity was evaluated by Oxford cup method. The results demonstrated that the content of the obtained total flavonoids from Leaf expansion,Germination and Florescence was determined to be 0.728%,0.518%,and 1.461%,respectively.Different growth periods of the alkaline flavonoids had different reduction ability,and activity of removing DPPH· and · OH. The flavonoids of Suaeda in different growth period had a certain of bacteriostatic effect toEscherichiacoli,Staphylococcusaureusbut that of in florescence expansion inhibition capability(19.54 mm,29.46 mm)was the strongest. It indicated that the flavonoids extracted fromSuaedacan be used as a natural antioxidant and antibacterial agent extensively.

Suaeda;flavonoids;antioxidation;antibacterial

2015-11-23

趙學(xué)思(1972-),男,本科,講師,農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工方向,E-mail:shp14181514@163.com。

王向紅(1973-),女,博士,教授,食品營(yíng)養(yǎng)與安全方向,E-mail:wangxianghong73@sina.com。

河北省科技支撐項(xiàng)目(12277117D)；國(guó)家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205031)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)13-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.004