時(shí) 群， 陳麗文， 陳乃明， 何貴整， 楊利平， 梁 剛， 蔡 林

(廣西欽州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西欽州 535000)

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牛大力種子組培快繁技術(shù)研究

時(shí) 群， 陳麗文， 陳乃明， 何貴整， 楊利平， 梁 剛， 蔡 林

(廣西欽州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西欽州 535000)

[目的]研究牛大力組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)。[方法]以牛大力種子為外植體，采用以芽繁芽途徑，比較3種不同種源牛大力種子無(wú)菌發(fā)芽率、繼代增殖、生根培養(yǎng)的表現(xiàn)差異。[結(jié)果]以MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L為誘導(dǎo)培養(yǎng)基, 種子無(wú)菌發(fā)芽率分別為98.23%、92.13%和95.01%；以改良MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L為繼代增殖培養(yǎng)基，添加半胱氨酸8 mg/L, FeSO4·7H2O加至MS用量的1.2倍， 增殖系數(shù)分別達(dá)5.57、3.20、5.30；以1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L、1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L、1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L為生根培養(yǎng)基，生根率分別達(dá)78.00%、67.33%、70.33%；生根苗移栽在V黃心土∶V細(xì)河沙∶V泥炭土=8∶1∶1基質(zhì)中培育60 d后，成活率分別達(dá)94.00%、85.43%和89.97%。采用控根容器培育大苗，可實(shí)現(xiàn)育苗與種植同步。[結(jié)論]該研究為牛大力種苗快速繁殖及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

牛大力；組織培養(yǎng)；種子；種源

牛大力(MillettiaspeciosaChamp.)為蝶形花科雞血藤屬藥食兩用植物，又名美麗崖豆藤、甜牛大力、扒山虎、大力薯、山蓮藕，主治肺熱、肺虛咳嗽、肺結(jié)核、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損、慢性支氣管炎、慢性肝炎等[1-2]，是生產(chǎn)多種中成藥的主要原料。其主產(chǎn)于我國(guó)廣東、廣西、海南和越南，不同牛大力種源葉片、花、果及薯的形態(tài)、長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)各異[3-4]，根系穿透力強(qiáng)，輻射范圍大[5]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求與日劇增，對(duì)牛大力苗木繁殖技術(shù)研究也逐漸深入和全面，主要有播種育苗、扦插育苗和組培育苗[6-11]，組培育苗作為牛大力苗木規(guī)模化繁殖的有效方法之一，目前多采用幼嫩莖段為外值體，消毒較困難[12]，以種子為材料通過(guò)愈傷組織途徑進(jìn)行組培快繁已有研究[13],尚未見以種子為材料通過(guò)以芽繁芽途徑進(jìn)行牛大力組培快繁研究的報(bào)道。不同種源植株組織培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基不同[14-16]，筆者以3種不同種源的牛大力種子為材料，采用無(wú)菌萌發(fā)芽苗帶腋芽莖段為材料，建立以芽繁芽組培快繁體系，并采用控根容器培育大苗[17],可實(shí)現(xiàn)育苗與種植同步。

1　材料與方法

1.1材料試驗(yàn)所用牛大力種源分別來(lái)自廣西欽州(Ⅰ)、廣西上林(Ⅱ)、海南五指山(Ⅲ)，引進(jìn)種植在欽州市林業(yè)科學(xué)研究所林地3年，采收成熟新鮮莢果種子。

1.3方法

1.3.1種子無(wú)菌萌發(fā)。11月至次年1月果實(shí)成熟時(shí)采收，分2種處理。處理①：當(dāng)天剝開果殼，取出種子作為外植體，溫開水冷至30 ℃浸泡4 h，在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸泡5 s，再用0.1%HgCl2溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次。在無(wú)菌條件下，點(diǎn)播在發(fā)芽培養(yǎng)基①上，每瓶點(diǎn)播1粒種子，接種40瓶，先暗培養(yǎng)7 d，選取獲得的無(wú)菌種子，置于弱光下培養(yǎng)， 觀察種子萌動(dòng)時(shí)間，50 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率及每株腋芽數(shù)，重復(fù)3次；處理②：剝開果殼，取出種子，室內(nèi)放置30 d，取種子消毒后點(diǎn)播在發(fā)芽培養(yǎng)基①上進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，同處理①。

1.3.2芽繼代增殖培養(yǎng)。待種子萌發(fā)的無(wú)菌苗長(zhǎng)至5～6 cm時(shí)，剪取上部約4 cm長(zhǎng)帶腋芽莖段，剪成2段，每段帶2個(gè)腋芽，橫放接種至培養(yǎng)基②～⑦上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種30瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d觀察芽生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。種子剪去部分根，保留約1 cm長(zhǎng)的根，連同上部帶1個(gè)腋芽的莖一起轉(zhuǎn)至新配制的培養(yǎng)基中，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)萌發(fā)新芽。

1.3.4煉苗移栽及幼苗管護(hù)。將生根組培苗在自然光下煉苗10～15 d，待小苗充分木質(zhì)化，開蓋2 d，噴水保濕，取出洗去培養(yǎng)基，移栽在3種不同基質(zhì)中：黃心土(J1)、黃心土：細(xì)河沙(J2，體積比9∶1)、黃心土∶細(xì)河沙∶泥炭土(J3，體積比8∶1∶1)，用16cm×14cm的營(yíng)養(yǎng)袋裝好備用。移栽場(chǎng)所選在覆蓋塑料薄膜及黑網(wǎng)的大棚內(nèi)，棚內(nèi)相對(duì)濕度保持在70%～90%，溫度控制在30 ℃以下，交替噴施殺菌劑、葉面肥和復(fù)合肥，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.3.5控根容器栽種。組培苗木移栽180 d后，待苗高20～50 cm，地徑0.2 cm以上，葉片有5片以上即可出圃栽種至直徑40 cm、高60 cm控根容器中，基質(zhì)用黃心土∶細(xì)河沙∶泥炭土(體積比8∶1∶1)，用地布覆蓋地面，栽種100株；另將組培苗栽種在大田中作為對(duì)照，株行距0.8 m×1.0 m。栽種時(shí)間達(dá)30 d時(shí)，每種栽培方式隨機(jī)抽取10株，觀察根生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理采用DPS軟件對(duì)以上各處理的3次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1種子放置時(shí)間對(duì)發(fā)芽率的影響 采集新鮮牛大力莢果，用當(dāng)天剝開果殼的種子和放置30 d的種子作為外植體，消毒處理后接種在培養(yǎng)基①中進(jìn)行無(wú)菌芽萌發(fā)，50 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，結(jié)果見表1。 從表1可以看出，采用當(dāng)天剝開果殼取出的種子作為外植體，種子萌動(dòng)時(shí)間10～12 d，比放置30 d的種子萌動(dòng)時(shí)間早10 d左右；種子發(fā)芽率也較高，與同種源室內(nèi)放置30 d的種子相比，種子發(fā)芽率差異顯著；不同種源之間，種子發(fā)芽率無(wú)顯著差異；當(dāng)種子萌出的芽苗長(zhǎng)至5～6 cm，每株芽苗段萌發(fā)的腋芽有7～8個(gè)可用于擴(kuò)繁增殖。帶1個(gè)腋芽的種子轉(zhuǎn)至新配制的培養(yǎng)基中，繼續(xù)誘導(dǎo)萌發(fā)2～5株叢生新芽，可重復(fù)2次，能為莖段增殖提供20～30個(gè)帶腋芽莖段。

表1　種子放置時(shí)間對(duì)發(fā)芽率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ?yàn)閺V西上林牛大力，Ⅲ為海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)繼代增殖的影響由表2可知，種子無(wú)菌苗帶腋芽莖段經(jīng)30 d增殖培養(yǎng)，不同種源牛大力種子無(wú)菌苗帶腋芽莖段在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況不同，同種源牛大力在不同培養(yǎng)基中增殖系數(shù)差異極顯著，均在⑦號(hào)培養(yǎng)基中表現(xiàn)最佳，繼代增殖30 d，廣西欽州牛大力增殖系數(shù)達(dá)5.57，廣西上林牛大力增殖系數(shù)達(dá)3.20，海南五指山牛大力增殖系數(shù)達(dá)5.57，對(duì)培養(yǎng)基⑦中3種源牛大力種子無(wú)菌苗莖段增殖系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同種源間差異極顯著。

2.4不同基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響由表4可知，不同基質(zhì)對(duì)牛大力移栽成活率有較大影響，廣西欽州、廣西上林、海南五指山牛大力在J3基質(zhì)中移栽成活率分別達(dá)94.00%、85.43%、89.97%，最高的是廣西欽州牛大力；在J1基質(zhì)中，移栽成活率較低，分別為77.03%、70.87%、72.10%；在J2基質(zhì)中，移栽成活率比J1高，分別為84.57%、75.60%、80.43%，

表2　不同培養(yǎng)基對(duì)繼代增殖的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ?yàn)閺V西上林牛大力，Ⅲ為海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

表3　 不同培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)生根的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力，Ⅱ廣西上林牛大力，Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and 0.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

但苗木生長(zhǎng)中少數(shù)葉逐漸變黃，生長(zhǎng)緩慢。方差分析結(jié)果表明，不同種源牛大力移栽成活率和不同基質(zhì)間移栽成活率達(dá)極顯著水平。牛大力苗木在黏性強(qiáng)、通透性差的J1基質(zhì)中，生長(zhǎng)緩慢，移栽成活率低；在疏松的J2和 J3基質(zhì)中，移栽成活率較高，增施有機(jī)肥泥炭土的J3基質(zhì)中成活率最高，且苗木莖軸伸長(zhǎng)，葉色翠綠。

表4 不同基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響

Table 4 Effects of different transplanting medium on survival rate

%

注：同列數(shù)據(jù)后不同大小寫字母分別表示處理間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。Ⅰ為廣西欽州牛大力、Ⅱ廣西上林牛大力、Ⅲ海南五指山牛大力。

Note: Data followed by different capital letters and lowercases in the same column stand for extremley significant and significant difference at 0.01 and o.05 level.Ⅰ.M.Mspeciosa from Qinzhou,Guangxi,Ⅱ.Mspeciosa from shanglin,Guangxi,Ⅲ.M.speciosa from wuzhishan,Hainan.

2.5牛大力在控根容器中的生長(zhǎng)情況由表5可知，與大田栽種相比，利用控根容器栽種的牛大力根數(shù)多，根總重量大，平均根長(zhǎng)略短于大田栽種的牛大力。

3　 結(jié)論與討論

3.1種子放置時(shí)間對(duì)發(fā)芽率的影響以牛大力種子作為外植體進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，解決了牛大力種子自然萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，一粒種子通過(guò)重復(fù)誘導(dǎo)，能為繼代繁殖提供20～30個(gè)無(wú)菌材料，保證以芽繁芽方式進(jìn)行組培擴(kuò)繁材料來(lái)源充足。3種源牛大力種子在無(wú)菌條件下，經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)，溫度在25～28 ℃下均有較高的發(fā)芽率，與室外進(jìn)行牛大力種子萌發(fā)特性研究一致[7]，當(dāng)天剝開果殼的種子比放置30 d的種子萌動(dòng)時(shí)間早、發(fā)芽率高。

3.2繼代增殖存在的問(wèn)題3種源牛大力種子無(wú)菌苗莖段在不同培養(yǎng)基中增殖系數(shù)和生長(zhǎng)情況不同，均在改良MS+6-BA 0.6 mg/L+ IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L+半胱氨酸8 mg/L +1.2倍FeSO4·7H2O用量(MS)培養(yǎng)基中表現(xiàn)最佳，在其他培養(yǎng)基中表現(xiàn)出一定缺陷:①芽玻璃化。③號(hào)培養(yǎng)基與②號(hào)培養(yǎng)基相比，對(duì)MS培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，降低了銨態(tài)氮濃度，提高了硝態(tài)氮含量，芽苗玻璃化減少；②褐化。④號(hào)培養(yǎng)基加入半胱氨酸，芽苗褐化消失；③莖基部產(chǎn)生異常愈傷組織。⑤號(hào)培養(yǎng)基將④號(hào)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)素NAA改為IBA,莖基部產(chǎn)生異常愈傷組織減少，有利于芽苗生長(zhǎng)；④無(wú)葉片分化。⑥號(hào)培養(yǎng)基在⑤號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入KT,芽苗分化出的葉片增多；⑤葉黃白色。⑦號(hào)培養(yǎng)基在⑥號(hào)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加大FeSO4·7H2O用量后，芽苗葉片由黃白色轉(zhuǎn)為翠綠色。通過(guò)不斷優(yōu)化MS培養(yǎng)基，有效解決了牛大力繼代培養(yǎng)過(guò)程中存在的問(wèn)題，促進(jìn)芽苗分化復(fù)葉，葉片變綠，莖軸伸長(zhǎng)、粗壯，保持芽苗3～5倍的增殖系數(shù)。

表5　牛大力在控根容器中及大田栽種生長(zhǎng)情況

3.3生根培養(yǎng)基的篩選以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的生長(zhǎng)素配比，3種源牛大力無(wú)菌芽苗在低濃度生長(zhǎng)素配比 NAA 0.6 mg/L+ IBA 0.4 mg/L中，莖基部褐化，不生根。通過(guò)提高激素配比，無(wú)菌芽苗生根率提高，不同種源牛大力芽苗生根所需的NAA 和 IBA 濃度不同，添加的NAA濃度太大，莖基部形成膨大的愈傷組織，生根質(zhì)量差。牛大力生根較困難，要提高生根質(zhì)量，需進(jìn)一步調(diào)試生根培養(yǎng)基。

3.4基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響生根質(zhì)量對(duì)移栽成活率有較大影響，莖基部膨大成愈傷組織，從愈傷組織中生出的根易斷，移栽成活率低，直接從莖皮部生出的根不易斷，移栽成活率高。不同基質(zhì)對(duì)牛大力移栽成活率有較大影響，在疏松的黃心土、細(xì)河沙、泥炭土混合基質(zhì)中移栽成活率高，在黏性強(qiáng)、易板結(jié)、通透性差的黃心土中栽成活率低。

3.5牛大力在控根容器中根生長(zhǎng)情況 利用控根容器栽種的一年生牛大力根短而粗，根數(shù)多，根總重量大。由于牛大力的根系穿透力強(qiáng)，輻射范圍大，采收時(shí)挖掘的人力成本大，利用控根容器培育大苗及栽種，扭開螺釘即可觀測(cè)及采收，達(dá)到既省工又高產(chǎn)的效果，對(duì)2年及多年生牛大力的根生長(zhǎng)情況有待進(jìn)一步觀察。

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Study on Tissue culture and Rapid Prapagation ofMillettiaspeciosaSeeds

SHI Qun, CHEN Li-wen, CHEN Nai-ming et al

(Qinzhou Forestry Research Institute, Qinzhou, Guangxi 535000)

[Objective] The aim was to research the tissue culture and rapid propagation ofMillettiaspeciosa. [Method] UsingM.speciosaseeds as explant, the seeds germination rate, the proliferation coefficient, the rooting rate ofM.speciosafrom three provenances were compared. [Result] The results showed that the seeds germination rate was 98.23%, 92.13% and 95.01% respectively under sterile condition in medium of MS+6-BA 0.4 mg/L+ NAA 0.2 mg/L, the proliferation coefficient was 5.57, 3.20 and 5.30 respectively in medium of modified MS+6-BA 0.6 mg/L + IBA 0.3 mg/L+KT 0.2 mg/L, added with cysteine 8 mg/L and 1.2 times of FeSO4·7H2O to MS, the rooting rate was 78.00%, 67.33% and 70.33% respectively in medium of 1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 1.5 mg/L,1/2MS+ NAA 1.0 mg/L+ IBA 3.0 mg/L and 1/2MS+ NAA 1.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L, and the transplanting survival rate was 94.00%, 85.43% and 89.97% respectively on yellow subsoil, fine sand and peat soil at the rate of 8∶1∶1. The root controlling container seedlings cultivation, breeding and planting can achieve synchroniaztion. [Conclusion] The research can provide the scientific basis for seedling rapid propagation and industrial production ofM.speciosa.

MillettiaspeciosaChamp.; Tissue culture; Seed; Provenances

欽州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20143002)。

時(shí)群(1970- )，女，廣西全州人，高級(jí)工程師，從事植物生物技術(shù)研究與推廣應(yīng)用工作。

2016-05-20

S 188

A

0517-6611(2016)21-138-04