賈宗平,袁　靜,俞詩源，3*

(1．西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州　730070;2．甘肅政法學院公安技術學院,甘肅蘭州　730070;3.西北師范大學學報編輯部,甘肅蘭州　730070)

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山丹黃參多糖對四氯化碳致急性損傷小鼠肝組織Caspase-3和TNF-α表達的影響

賈宗平1，2,袁靜1,俞詩源1，3*

(1．西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州730070;2．甘肅政法學院公安技術學院,甘肅蘭州730070;3.西北師范大學學報編輯部,甘肅蘭州730070)

為研究山丹黃參多糖對四氯化碳(CCl4)致小鼠急性損傷的影響，對50只小鼠分別灌胃山丹黃參多糖(12.5，25，37.5g·L-1)或等量的生理鹽水7d，最后一次灌胃1h后腹腔注射1%的CCl4橄欖油溶液，16h后處死小鼠，用免疫組織化學法檢測Caspase-3，TNF-α在肝組織表達的變化，用比色法檢測血漿堿性磷酸酶(ALP)和肝組織谷胱甘肽(GSH)活性的變化.結果顯示實驗對照組肝組織Caspase-3，TNF-α陽性表達均明顯增強(P<0.01)，肝組織GSH活力明顯降低(P<0.01)，血漿ALP含量顯著升高(P<0.01).而丹黃黃參粗多糖各組肝組織Caspase-3，TNF-α的陽性表達明顯減少(P<0.01)，肝組織GSH活力顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，血漿ALP活性明顯降低(P<0.01).表明一定劑量的山丹黃參多糖可提高小鼠抗氧化能力，促進新陳代謝，降低Caspase-3，TNF-α的陽性表達，對四氯化碳造成的急性肝組織損傷有一定的保護作用.

山丹黃參多糖；四氯化碳；小鼠；肝臟；Caspase-3；TNF-α

四氯化碳(CCl4)是有機化工、石油化工等生產中常用的溶劑和民用化學品，由于工業(yè)廢水和生活垃圾的處理滯后，對環(huán)境產生了嚴重污染[1]，直接影響了人們的生活與健康，因此，研究開發(fā)對CCl4毒性作用有影響的植物或中草藥，對于治理環(huán)境污染和維護動物或人體健康具有重要意義.山丹黃參是多年生野生草本植物，具有抗氧化、鎮(zhèn)咳、增強免疫等生理功能[2-4].本課題組研究了山丹黃參對CCl4慢性肝損傷的影響[5-6]，但有關山丹黃參對CCl4致急性肝損傷是否有影響、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)和腫瘤壞死因子(Tumornecrosisfactor)是否參與肝損傷過程等尚未見報道，本文給小鼠連續(xù)灌胃山丹黃參多糖后，再給小鼠注射CCl4橄欖油，通過檢測肝組織Caspase-3和TNF-α表達及谷胱甘肽酶活性的變化，分析研究山丹黃參對CCl4致動物急性損傷的影響.

1　材料與方法

1.1實驗藥品和動物處理

從甘肅省山丹軍馬場購買山丹黃參，根據文獻[5，7]方法冷凍粉碎后用蒸餾水提取山丹黃參多糖，按1∶50的料液比70 ℃水浴，離心，取上清液減壓濃縮，再加95%乙醇，離心，棄上清液冷凍干燥，制成12.5，25，37.5g·L-1黃參多糖水溶液.

四氯化碳(CCl4)分析純，Caspase-3和TNF-α抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)、谷胱甘肽(Glutathione，GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所).

從蘭州大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心選購昆明小鼠50只(20±2)g，隨機分為空白對照組、實驗對照組、實驗1，2，3組共5個組.實驗1，2，3組小鼠分別連續(xù)灌胃濃度為12.5，25，37.5g·L-1的山丹黃參多糖7d(每天2次，Am10.00，Pm4.00，每次0.2mL)，空白對照組和實驗對照組小鼠灌胃等量的生理鹽水.實驗第8d實驗對照組和實驗1，2，3組小鼠分別腹腔注射1%CCl4橄欖油溶液0.2mL，空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水.注射1%CCl4橄欖油溶液16h后，經眼眶采血、處死，切取部分肝組織塊后在-20 ℃下冷凍備用，其余肝組織入15%福爾馬林溶液中固定.

1.2肝組織Caspase-3、TNF-α表達的檢測

取上述固定的肝組織塊，常規(guī)石蠟包埋、切片(6μm)、脫蠟至水，按文獻[8]方法觀察、檢測各組小鼠肝組織Caspase-3、TNF-α蛋白陽性表達產物的平均光密度.

1.3肝組織GSH和血漿ALP活性檢測

取上述凍存的各組小鼠肝組織0.5g，按文獻[5]方法加生理鹽水研磨成組織勻漿、冷凍離心后，上清液按試劑盒要求用全自動分光光度計(日本，島津UV-1800)在420nm波長處檢測各組小鼠肝組織GSH活性.上述采集的血液經冷凍離心，取血漿按試劑盒操作要求用全自動分光光度計在520nm波長處檢測各組小鼠血漿中ALP的OD值.

1.4數據統(tǒng)計

實驗數據用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示.

2　結果

2.1肝組織Caspase-3表達的變化

Caspase-3蛋白在肝細胞漿內表達，陽性表達部位被染成棕黃色(圖1).注射CCl4和灌胃山丹黃參多糖后各組小鼠肝組織都有不同程度的Caspase-3蛋白陽性表達，與空白對照組相比，實驗對照組小鼠肝組織Caspase-3蛋白的陽性表達極顯著增加(P<0.01)，陽性細胞數量多而密集(圖1：A，B)，但與實驗對照組相比實驗1，2，3組Caspase-3蛋白陽性表達顯著減少(P<0.05或P<0.01)，且表達量與多糖劑量呈負相關(圖1：C-E)(表1).

表1　小鼠肝組織Caspase-3和TNF-α蛋白表達的平均光密度值

注：**P<0.01 與空白對照組比較；#P<0.05，##P<0.01 與實驗對照組比較.

圖1　小鼠肝組織Caspase-3,TNF-α的表達Fig 1The Caspase-3,TNF-α expression of mice liver tissue

A．空白對照組小鼠肝組織Caspase-3的表達，標尺示25μm(下同)；B．實驗對照組小鼠肝組織Caspase-3的表達；C．實驗1組小鼠肝組織Caspase-3的表達；D．實驗2組小鼠肝組織Caspase-3的表達；E.實驗3組小鼠肝組織Caspase-3的表達；F．空白對照組小鼠肝組織TNF-α蛋白的表達；G．實驗對照組小鼠肝組織TNF-α蛋白的表達；H．實驗1組小鼠肝組織TNF-α蛋白的表達；I．實驗2組小鼠肝組織TNF-α蛋白的表達；J．實驗3組小鼠肝組織TNF-α蛋白的表達.

A．TheCaspase-3expressionofnaturecontrolgroup，Bar=25μm(Thesamebelow)；B．TheCaspase-3expressionofexperimentalcontrolgroup；C．TheCaspase-3expressionofexperimental1group；D．TheCaspase-3expressionofexperimental2group；E．TheCaspase-3expressionofexperimental3group；F．TheTNF-αexpressionofnaturecontrolgroup；G．TheTNF-αexpressionofexperimentalcontrolgroup；H．TheTNF-αexpressionofexperimental1group；I．TheTNF-αexpressionofexperimental2group；J．TheTNF-αexpressionofexperimental3group.

2.2肝組織TNF-α表達的變化

腫瘤壞死因子TNF-α在肝細胞胞漿內表達，陽性表達呈棕黃色(圖1).與空白對照組相比，實驗對照組TNF-α蛋白表達極顯著增加(P<0.01)，染色較深(圖1：F，G)，但與實驗對照組相比山丹黃參多糖各組TNF-α蛋白陽性表達細胞減少，差異極顯著(P<0.01，圖1：H-J，表1).

2.3肝組織GSH活性的變化

各實驗組小鼠肝組織GSH活性都有不同程度的變化(表2).實驗對照組肝組織GSH活性與空白對照組相比極顯著降低(P<0.01)，但與實驗對照組相比實驗1，2，3組肝組織GSH活性均又升高，差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01).

表2　小鼠肝組織GSH和血漿ALP活性的變化

注：**P<0.01 與空白對照組比較；#P<0.05，##P<0.01 與實驗對照組比較.

2.4血漿ALP活性的變化

各實驗組小鼠血漿ALP的活性都有不同程度的變化(表2).實驗對照組小鼠血漿ALP活性極顯著高于空白對照組(P<0.01)，而實驗1，2，3組小鼠血漿ALP活性均低于實驗對照組(P<0.05或P<0.01).

3　討論

3.1山丹黃參多糖對CCl4致急性損傷小鼠肝組織Caspase-3表達的影響

細胞凋亡也稱程序性細胞死亡(Programmedcelldeath，PCD)，凋亡信號首先活化不同的Caspase起始因子，然后由起始因子激活級聯下游的Caspase效應分子，最終由效應分子特異地水解細胞中的一系列底物分子從而導致細胞解體[9].CCl4進入機體后可能通過脂質過氧化等途徑激活了Caspase-3蛋白，使Caspase-3蛋白在肝細胞中廣泛表達，造成肝細胞的凋亡.研究表明植物多糖具有修復受損細胞等功能，可阻止凋亡蛋白激活信號通路[10]，山丹黃參多糖可能通過清除自由基及減少凋亡前體物質形成等途徑，抑制細胞凋亡的級聯反應，可以減少Caspase-3蛋白在肝組織中的活化或表達，從而減輕四氯化碳所致的組織損傷和細胞凋亡，表明山丹黃參多糖對肝組織損傷有一定的保護作用.

3.2山丹黃參多糖對CCl4致急性損傷小鼠肝組織TNF-α表達的影響

TNF-α是由巨噬細胞、單核細胞等產生的一種多肽，它對不同的細胞類型有不同的作用，在某些生理條件下是一種重要的介質[11].正常狀態(tài)下這種多肽在肝組織中不表達或表達甚少，對肝細胞無殺傷作用，并可誘導肝再生.但在肝臟受到損傷或自由基積累過度時，其促進肝細胞再生的作用就會逆轉，通過一系列的信號傳導途徑促使細胞凋亡[12].CCl4在機體中會生成大量自由基，這些自由基會破壞核酸分子的完整性和構型.通過破壞DNA分子上氫鍵或改變其特殊密碼、改變DNA多聚酶特異位點、改變合成DNA模板的結構,使DNA多聚酶發(fā)生錯誤旋轉等途徑對DNA造成損傷,最終導致肝細胞的凋亡或壞死[13].本研究中在四氯化碳和炎性因子的作用下，實驗對照組TNF-α陽性表達比空白對照組顯著增多，但灌胃山丹黃參多糖的各組小鼠肝組織TNF-α的表達與實驗對照組相比又明顯減少，其原因可能與山丹黃參多糖具有抗氧化作用、可提高機體對自由基的清除能力和速度[3]、增強肝細胞的抗氧化能力有關.

3.3山丹黃參多糖對四氯化碳致急性損傷小鼠肝組織GSH活性的影響

自由基是啟動脂質過氧化的關健因素，其含量越高則肝損傷程度越嚴重.GSH可與毒性基團相互結合然后排出體外，防止蛋白質和細胞膜遭受自由基的損傷[14].GSH活力的高低間接反映機體清除氧自由基的能力，因此，測定GSH活力可了解肝細胞受損傷的程度和肝細胞對毒性物質損傷的拮抗作用[15].CCl4進入體內后，經P450酶系代謝產生三氯甲烷自由基并迅速與氧結合為過氧三氯甲烷自由基，從而引起線粒體膜、內質網膜和細胞膜的變性損傷[16]，同時產生大量的羥自由基和氧自由基，這些產物會造成核酸交聯錯誤或無法分裂，干擾細胞能量代謝以及蛋白質分解等[11].本研究中實驗對照組小鼠肝組織GSH活性顯著下降，說明肝組織受到嚴重損傷.有文獻報道植物多糖可提高組織過氧化氫酶含量，阻斷自由基連鎖反應[17]，山丹黃參多糖各組肝組織中GSH活力又升高，表明山丹黃參多糖對肝組織有一定的保護作用.

3.4山丹黃參多糖對四氯化碳致急性損傷小鼠血漿ALP活性的影響

堿性磷酸酶(ALP)是一種同源二聚體蛋白，廣泛分布于人體肝臟、腸、骨骼、腎等組織，由肝臟向膽外排出，底物特異性很低，可在堿性環(huán)境中水解多種磷酸單酯化合物的酶，但需要鎂和錳離子為激活劑，是膽汁淤積性肝炎的重要檢測指標.膽汁淤積造成的肝損傷是由于內生性膽汁酸的積聚，這種損傷造成肝細胞凋亡的同時還伴隨著脂質過氧化反應的發(fā)生，相反這種氧化刺激的產生又加劇了膽汁淤積造成的細胞凋亡[18]，山丹黃參含有大量Mg、Mn等機體必須的微量元素，能增強免疫力、加快機體及細胞代謝，減少自由基的沉積[3]，多糖等抗氧化劑能減少肝細胞的凋亡[19]，本研究中實驗對照組血漿ALP活性比空白對照組明顯升高，山丹黃參多糖各組血漿ALP活性比實驗對照組明顯下降，表明CCl4造成了明顯肝臟損傷和膽汁淤積，而山丹黃參多糖能加快ALP的代謝、減少肝細胞凋亡，減輕內源性膽汁淤積，對CCl4造成的機體肝損傷有一定的保護作用.

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(責任編輯陸泉芳)

The effects of Shandan Sphallerocarpus gracilispolysaccharideonCaspase-3andTNF-αexpressioninlivertissueofacuteinjuryinmicecausedbycarbontetrachloride

JIAZong-ping1,2,YUANJing1,YUShi-yuan1，3

(1.CollegeofLifeScience,NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu，China;2.PoliceTechnologyDepartment,GansuPoliticalScienceandLawInstitute，Lanzhou730070，Gansu，China;3．EditoralDepartmentoftheUniversityJournal，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu，China)

ToinvestigatetheeffectsofSphallerocarpus gracilispolysaccharide(SGP)onacuteinjuryofmicecausedbycarbontetrachloride(CCl4),50micearegavagedwithSGPatdifferentconcentrations(12.5，25，37.5g·L-1)orphysiologicalsalinefor7d,andintraperitonealinjectionof1%CCl4oliveoilsolutionafterthelastgavage1h,themicearekilledafter16h,thechangesofCaspase-3andTNF-αexpressionoflivertissuearedeterminedbyimmunohistochemicalmethod,thechangesofplasmaalkalinephosphatase(ALP)andlivertissueglutathione(GSH)aredeterminedbycolorimetricmethod.TheresultsshowthattheexperimentalgroupoflivertissueCaspase-3andTNF-αexpressionaresignificantlyenhance(P<0.01),theactivityofGSHinlivertissueisdecrease(P<0.01),plasmaALPcontentisincreasesignificantly(P<0.01).AndSGPgroupsoflivertissueCaspase-3andTNF-αexpressionaresignificantlyreduce(P< 0.01),activityofGSHinlivertissueissignificantlyorverysignificantlyincrease(P<0.05orP<0.01),plasmaALPactivityisdecreasesignificantly(P<0.01).ItindicatesthatSGPcanimprovetheantioxidantabilityofmice,promotemetabolism,decreasethepositiveexpressionofCaspase-3andTNF-α,andhasaprotectiveeffectonacuteliverinjurycausedbyCCl4.

ShandanSphallerocarpus gracilispolysaccharide；carbontetrachloride；mice；liver；Caspase-3；TNF-α

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.018

2016-01-02;修改稿收到日期:2016-02-25

甘肅省自然科學基金資助項目(1107RJZA141)，蘭州市社會發(fā)展項目(2013-3-72，2014-1-102)

賈宗平(1982—)，男，甘肅環(huán)縣人，講師，碩士.主要研究方向為生物物證技術.

E-mail:jiazongping@126.com

R338.21

A

1001-988Ⅹ(2016)03-0096-05

*通訊聯系人，男，教授，博士，博士研究生導師.主要研究方向為組織發(fā)生.E-mail：syyu006@nwnu.edu.cn