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        三七總皂苷對子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

        2016-09-13 03:13:37譚宏偉楚光華胡春艷張恩娣西北婦女兒童醫(yī)院婦科陜西西安710061
        中國醫(yī)藥導報 2016年14期
        關鍵詞:皂苷癌細胞內膜

        譚宏偉 楚光華 胡春艷 張恩娣西北婦女兒童醫(yī)院婦科,陜西西安 710061

        三七總皂苷對子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

        譚宏偉楚光華胡春艷張恩娣
        西北婦女兒童醫(yī)院婦科,陜西西安710061

        目的 探討三七總皂苷(PNS)對子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其作用機制。方法 應用不同濃度的PNS分別作用于Ishikawa和HEC-1A細胞24、48、72 h,采用MTT法檢測細胞增殖率;Transwell檢測細胞侵襲能力;流式細胞儀檢測細胞凋亡水平;采用RT-PCR和Western blot分別檢測VEGF、PI3K、AKT的mRNA和蛋白表達水平。 結果PNS可以顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖。與control組比較,PNS處理的Ishikawa和HEC-1A細胞侵襲顯著下降(P<0.05),細胞凋亡率明顯升高(P<0.05),VEGF和PI3K的表達水平下降(P<0.05)。結論PNS能夠抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖和侵襲,誘導細胞凋亡,其過程可能與VEGF/PI3K/AKT信號通路的抑制有關。

        三七總皂苷;子宮內膜癌;血管內皮生長因子;PI3K/AKT信號通路

        [Abstract]Objective To investigate the effects of Panaxnotoginsengsaponins(PNS)on the cell proliferation,invasion and apoptosis in endometrial cancercell line Ishikawa and HEC-1A and its underlying mechanism.Methods Ishikawa and HEC-1A cells were treated with different density of PNS for 24,48,72 h.The MTT method was used to detect the cell proliferation rate after Ishikawa and HEC-1A;cell invasion ability was detected by Transwell method;cell apoptosis was measured by flow cytometry;the mRNA and protein expression level of VEGF,PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Results PNS could significantly inhibited the cell proliferation of Ishikawa and HEC-1A cells.Compared with control group,the cell invasion ability of Ishikawa and HEC-1A apparently decreased(P<0.05),and the cell apoptosis were elevated with PNS treatment(P<0.05),the expression of VEGF and PI3K decreased with PNS treatment(P<0.05).Conclusion PNS inhibits the proliferation,invasion and induces apoptosis in Ishikawaand HEC-1A cells,which may be related to the inhibition of VEGF/PI3K/AKT signaling pathway.

        [Key words]Panaxnotoginsengsaponins;Endometrial cancer;Vascular endothelial growth factor;PI3K/AKT

        子宮內膜癌是三大婦科惡性腫瘤之一[1-2]。目前子宮內膜癌的治療方法較多,以手術和放療為主,輔助化學治療或激素治療,然而化學及激素治療存在明顯的復發(fā)癥和毒副作用[3-4]。因此,尋找高效、安全、使用范圍廣的子宮內膜癌治療新藥是現(xiàn)今的研究熱點。三七總皂苷(panaxnotoginsengsaponins,PNS)三七的主要有效成分,具有擴張血管、降低血脂和抗炎等藥理作用[5-6]。已有研究表明,PNS對多種癌細胞的增值、凋亡和代謝等有影響[7-10]。但PNS在子宮內膜癌中的作用還未見報道。本研究擬以子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞系為細胞模型,探討PNS對子宮內膜癌細胞增殖、侵襲和凋亡的影響,并探討其分子機制,為PNS治療子宮內膜癌的臨床應用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1細胞培養(yǎng)

        Ishikawa和HEC-1A細胞(American Type Culture Collection,ATCC)用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

        1.2MTT法檢測細胞增殖率

        細胞以6×104個/孔接種置96孔板,應用不同濃度的PNS(50、100、150、200 μg/mL)(西安飛達生物公司)分別作用于Ishikawa和HEC-1A細胞24、48、72 h。棄去原培養(yǎng)液,每孔加入MTT(5 g/L)20 μL,37℃培養(yǎng)4 h。棄上清,每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩10 min使結晶充分溶解,于酶標儀上檢測各組細胞吸光度值(A490),細胞增殖率=處理組A490/對照組A490×100%。

        1.3Transwell法檢測細胞侵襲

        以正常培養(yǎng)的子宮內膜癌細胞為對照,以200μg/mL 的PNS處理的細胞為實驗組。在Transwell上室聚碳酸酯膜上涂70 μL 1 mg/mL的matrigel膠,在37℃下靜置60 min使其在微孔濾膜上重組為基底膜。胰酶消化待測細胞,收集細胞懸液后在離心半徑為10 cm的離心機中1000 r/min離心5 min。重懸細胞后接種于Transwell上室內,并于下室中加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μL,孵育24 h。隨后將濾膜上層的細胞用棉簽抹去,用甲醇固定濾膜,Giemsa染色15 min。于200倍光鏡下計算遷移到下層的細胞數(shù)量。

        1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡

        將待測細胞以2×105/孔的密度接種置6孔板,消化細胞,離心后棄去上清液收集細胞。PBS洗滌后離心棄上清液收集細胞,每孔加入100 μL結合緩沖液緩慢吹打,在懸浮細胞中分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI進行染色,搖勻后置于閉光孵育15 min。每管再加入400 μL結合緩沖液,于1 h內用流式細胞儀檢測。

        1.5RT-PCR檢測mRNA表達

        Trizol法提取待測細胞的總RNA,紫外分光光度計測定RNA的純度及濃度,逆轉錄成cDNA后PCR擴增。取5 μL擴增產物行瓊脂糖凝膠電泳,自動凝膠成像分析儀分析。實驗結果以目的基因灰度值/內參灰度值表示。

        1.6Western blot檢測蛋白的表達

        細胞用0.05%胰蛋白酶消化后,PBS洗滌3次。加入65 μL RIPA細胞蛋白裂解液裂解細胞,隨后進行SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白。電轉膜后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h,加入相應蛋白鼠抗一抗(Pierce,Rockford,USA),4℃輕搖過夜。隨后加入HRP標記的羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h。最后用X線膠片曝光分析,結果用Image-Pro Plus處理。蛋白的相對表達量以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示。

        1.7統(tǒng)計學方法

        采用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計分析,正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1PNS抑制子宮內膜癌細胞Ishikawa和HEC-1A的生長

        PNS能顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖,同一濃度下,隨著PNS作用時間的延長細胞的增殖抑制率亦明顯升高(P<0.05);并且隨著PNS濃度增加,增殖抑制率明顯升高(P<0.05)。后續(xù)實驗采用200μg/mL PNS處理進行。見圖1。

        圖1 三七總皂苷對Ishikawa和HEC-1A細胞增殖的影響

        2.2PNS抑制子宮內膜癌細胞Ishikawa和HEC-1A的侵襲

        經 200 μg/mL PNS處理 48 h后,Ishikawa和HEC-1A細胞的侵襲顯著降低(P<0.05)。見圖2。

        圖2 三七總皂苷對Ishikawa和HEC-1A細胞侵襲能力的影響

        2.3PNS誘導子宮內膜癌細胞Ishikawa和HEC-1A的凋亡

        PNS處理48 h后,Ishikawa細胞的凋亡率升高至21.0%,HEC-1A的凋亡率升高至20.2%,與control比較,細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。見圖3。

        2.4PNS抑制VEGF的mRNA和蛋白表達

        分別檢測Ishikawa和HEC-1A細胞中VEGF的mRNA和蛋白。與control比較,PNS組的VEGF mRNA和蛋白表達均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

        圖3 三七總皂苷對Ishikawa和HEC-1A細胞凋亡的影響

        圖4 三七總皂苷對Ishikawa和HEC-1A細胞中VEGF mRNA和蛋白表達的影響

        2.5PNS抑制PI3K/AKT信號通路蛋白表達

        與control比較,p-AKT的mRNA、蛋白表達水平在PNS組中顯著降低 (P<0.05),AKT的mRNA、蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。如圖5所示,

        圖5 三七總皂苷對Ishikawa和HEC-1A細胞中PI3K/AKT信號通路蛋白表達的影響

        3 討論

        現(xiàn)今全球每年新發(fā)子宮內膜癌約14萬例,死亡人數(shù)約4萬人/年[11]。中藥因其較高的安全性在癌癥的治療中起重要作用[12]。PNS影響女性生殖惡性腫瘤細胞的增殖及凋亡[7,13-14]。但目前關于PNS對子宮內膜癌的作用還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn),PNS能顯著抑制體外培養(yǎng)的子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖和侵襲,促進其凋亡,提示PNS對子宮內膜癌可能具有一定治療作用。

        目前中藥抗子宮內膜癌的研究主要從抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤侵襲等方面展開。Wang等[7]研究證明PNS對乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力有抑制作用。Wang等[15]研究表明,PNS可以通過降低結直腸細胞的增殖,誘導細胞凋亡。本研究結果表明,PNS能顯著抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖,并且其抑制作用具有濃度、時間的依賴性,隨著PNS濃度的增加和作用時間的延長,細胞的增殖抑制也明顯增高。并且PNS可以有效抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的侵襲能力,對細胞的凋亡也有一定促進作用。以上結果表明,PNS能夠抑制子宮內膜癌細胞的生長和侵襲,并誘導細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用。

        近年來大量研究表明,VEGF是作用最強、特異性最高的調控因子,在腫瘤血管生成的各個環(huán)節(jié)中起到重要作用[16-17]。抑制VEGF可以達到抑制腫瘤血管新生并阻止腫瘤生長轉移的目的[18]。已有研究表明PNS可以通過降低VEGF的表達降低動脈粥樣硬化的血管新生[16]。本研究結果表明在PNS處理Ishikawa 和HEC-1A細胞中,VEGF的表達顯著下降,提示PNS可能通過抑制VEGF影響子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和凋亡。

        PI3K/AKT信號通路是細胞內重要的信號轉到通路之一,其異常激活與婦科腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移等密切相關[19]。研究表明VEGF可以通過激活PI3K/ AKT信號通路促進子宮內膜癌細胞的增生及轉移[20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)PNS處理抑制PI3K/AKT信號通路在的Ishikawa和HEC-1A中的表達,與VEGF的表達趨勢一致,說明PNS可能通過抑制子宮內膜癌細胞VEGF的表達,遏制PI3K/AKT信號通路激活。

        綜上所述,本研究表明PNS能夠抑制子宮內膜癌細胞Ishikawa和HEC-1A的增殖和侵襲,并促進細胞的凋亡,其過程可能與VEGF/PI3K/AKT信號通路的抑制有關。在以后的研究中應進一步對PNS在子宮內膜癌中的作用機制進行深入研究,為提高患者的治愈率和生存率,開發(fā)臨床有效新型治療藥物提供思路。

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        Effects of Panaxnotoginsengsaponins on proliferation,invasion,apoptosis of endometrial cancercell lines Ishikawa and HEC-1A

        TAN HongweiCHU GuanghuaHU ChunyanZHANG Endi
        Department of Gynaecology,Northwest Women and Children Hospital,Shaanxi Province,Xi'an710061,China

        R737.33

        A

        1673-7210(2016)05(b)-0013-04

        譚宏偉(1971-),男,碩士,副主任醫(yī)師;研究方向:婦科腫瘤以及婦科腹腔鏡微創(chuàng)技術。

        張恩娣(1953-),女,主任醫(yī)師;研究方向:婦科腫瘤。

        2016-02-15本文編輯:蘇暢)

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