朱威，饒雷平，趙登秋，王叢（岳陽市二人民醫(yī)院，湖南岳陽44000；上海市第六人民醫(yī)院；上海市公共衛(wèi)生臨床中心）

NS-398聯(lián)合奧曲肽對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

朱威1，饒雷平2，趙登秋2，王叢3
（1岳陽市二人民醫(yī)院，湖南岳陽414000；2上海市第六人民醫(yī)院；3上海市公共衛(wèi)生臨床中心）

目的 探討選擇性Cox-2抑制劑NS-398和生長抑素類似物奧曲肽對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖、凋亡的影響及機(jī)制。方法 取對數(shù)生長期人胃癌SGC-7901細(xì)胞，隨機(jī)分為空白組、對照組、NS-398組、奧曲肽組及聯(lián)合用藥組，空白組僅含培養(yǎng)液和等體積的DMSO，對照組為SGC7901細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μL+等體積的DMSO，NS-398組給予NS-398 100 μmol/L，奧曲肽組給予奧曲肽10 μmol/L，聯(lián)合用藥組給予NS-398 100 μmol/L+奧曲肽10 μmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h，采用CCK-8法檢測各組胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)時(shí)定量熒光PCR及蛋白印跡法檢測Cox-2蛋白表達(dá)。結(jié)果 干預(yù)后72 h，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組SGC7901細(xì)胞增殖抑制率分別為（39.0±3.2）%、（41.3± 1.8）%、（78.8±1.4）%，聯(lián)合用藥組與NS-398組、奧曲肽組比較，P均＜0.01。顯微鏡下觀察NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)改變，尤以聯(lián)合用藥組為著。NS-398組、奧曲肽組和聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率分別為（12.06±1.26）%、（19.87±1.45）%和（29.74±2.52）%，顯著高于對照組的（2.13±0.28）%（P均＜0.01），聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于NS-398組、奧曲肽組（P均＜0.01）。NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組Cox-2表達(dá)均顯著下降（P均＜0.01），尤以聯(lián)合用藥組降低更明顯。結(jié)論 NS-398聯(lián)合奧曲肽可協(xié)同抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)Cox-2表達(dá)有關(guān)。

胃癌；NS-398；奧曲肽；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

胃癌指發(fā)生于胃上皮組織的惡性腫瘤，為世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一［1］。臨床以處于進(jìn)展期的胃癌患者多見，手術(shù)根治率低，部分患者甚至無法手術(shù)切除，而化療又存在一定不良反應(yīng)及多重耐藥性等缺點(diǎn)。近年發(fā)展起來的選擇性環(huán)氧合酶2（Cox-2）抑制劑不僅使選擇性地抑制Cox-2發(fā)揮抗腫瘤作用成為可能，且避免了傳統(tǒng)NSAIDs由于同時(shí)抑制Cox-1而導(dǎo)致的不良反應(yīng)。奧曲肽是人工合成的生長抑素類似物，通過與靶細(xì)胞上的生長抑素受體（SSTR）結(jié)合后發(fā)揮抗腫瘤作用。目前研究已證實(shí)選擇性Cox-2抑制劑和生長抑素類似物對胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖均有抑制作用［2，3］，但兩種藥物聯(lián)用能否增強(qiáng)對胃癌的抑制作用研究較少。2013年6月～2014年6月，我們探討了NS-398和奧曲肽對體外培養(yǎng)的人胃癌SGC-7901細(xì)胞株增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購于上海博谷生物科技有限公司。Cox-2抑制劑NS-398購自Sigma公司；奧曲肽購自瑞士諾華公司；RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，Gibco公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；Annexin-FITC/PI雙染色試劑盒（BD公司）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit （Perfect Real Time）和SYBR Premix Ex TaqTM（寶生物工程大連有限公司）；Cox-2和GAPDH引物合成（上海博尚生物技術(shù)有限公司）；Cox-2多克隆抗體（兔來源）（Santa Cruz公司）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀（Thermo公司）；倒置相差顯微鏡（Leica公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；iCycler iQ多色實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)（Bio-rad公司）；蛋白SDS-PAGE電泳儀（Amersham Pharmacia Biotech）。

1.2 細(xì)胞增殖抑制率測算 采用CCK-8法。SGC-7901細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液加10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化，制成細(xì)胞懸液。取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、對照組、NS-398組、奧曲肽組及聯(lián)合用藥組，空白組僅含培養(yǎng)液和等體積的DMSO，對照組為SGC7901細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μL+等體積的DMSO，NS-398組NS-398濃度為100 μmol/L，奧曲肽組奧曲肽濃度為10 μmol/L，聯(lián)合用藥組NS-398濃度為100 μmol/L，奧曲肽濃度為10 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h，向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液37℃下孵育4 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)各組OD值求得各組抑制率后，用金正均［4］法判斷兩藥的相互作用，根據(jù)在量效曲線線性區(qū)內(nèi)，兩藥合并用藥的抑制率及兩個(gè)單用藥的抑制率，用以下公式計(jì)算q值：q值=兩藥合用的抑制率/兩單藥預(yù)計(jì)抑制率= E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。當(dāng)q值=1±0.15時(shí)，兩藥有相加作用，q值＞1.15時(shí)，兩藥有協(xié)同作用，當(dāng)q值＜0.85時(shí)，兩藥有拮抗作用。

1.3 細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期細(xì)胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化（顯微鏡放大倍數(shù)為100倍）。

1.4 細(xì)胞凋亡率測算 取對數(shù)生長期細(xì)胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，常規(guī)收集各組細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，將含細(xì)胞的培養(yǎng)液吸至離心管內(nèi)，PBS離心、清洗2次，用預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞Annexin V-FITC和PI雙染色法，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 胃癌細(xì)胞內(nèi)Cox-2 mRNA表達(dá)檢測 采用Real-time PCR法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，常規(guī)收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系測定Cox-2 mRNA表達(dá)，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算相對值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 胃癌細(xì)胞內(nèi)Cox-2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，NS-398、奧曲肽和聯(lián)合用藥組處理后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)收集各組細(xì)胞。提取細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測定Cox-2蛋白濃度，SD-PAGE電泳，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)膜成功后，用5%脫脂奶粉封閉2 h；加一抗，Cox-2多克隆抗體以1∶500稀釋，GAPDH單克隆抗體以1∶2 000稀釋，4℃放置過夜。用PBS-T液洗滌3次，每次10 min。加二抗，振蕩孕育1 h。用PBS-T洗滌3次，每次10 min。使用Image J圖像分析軟件測定蛋白條帶積分光密度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NS-398和奧曲肽對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 見表1。藥物的相互作用結(jié)果：q24 h=1.19，q48 h=1.20，q72 h=1.23。兩藥聯(lián)用對SGC-7901細(xì)胞增殖有協(xié)同抑制作用，且呈時(shí)間依賴性。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率比較（%±s）

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率比較（%±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與NS-398組及奧曲肽組比較，#P ＜0.01。

SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率組別24 h48 h72 h對照組000 NS-398組14.3±3.1*27.2±1.9*39.0±3.2*奧曲肽組22.4±3.4*28.1±2.0*41.3±1.8*聯(lián)合用藥組39.5±2.8*#57.2±3.8*#78.8±1.4*#q 1.19 1.20 1.23

2.2 SGC-7901細(xì)胞凋亡形態(tài)改變 光鏡下對照組SGC-7901胃癌細(xì)胞呈多邊形或梭形，貼壁生長。NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組24 h后開始出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞懸浮、細(xì)胞胞體縮小、細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞核濃縮，部分細(xì)胞發(fā)生融合，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，聯(lián)合用藥組與NS-398組、奧曲肽組相比，上述改變更明顯。

2.3 NS-398和奧曲肽對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 SGC-7901細(xì)胞被干預(yù)24 h后，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組細(xì)胞凋亡率分別為12.06%±1.26%、19.87%±1.45%、29.74%± 2.52%、2.13%±0.28%，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

2.4 NS-398和奧曲肽處理對SGC-7901細(xì)胞Cox-2 mRNA表達(dá)的影響 NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組Cox-2 mRNA的相對表達(dá)量分別為23.069±2.033、19.763±2.168、6.133±0.554、52.913±4.723，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

2.5 NS-398和奧曲肽處理對SGC-7901細(xì)胞Cox-2蛋白表達(dá)的影響 NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組、對照組Cox-2蛋白的相對表達(dá)量分別為0.318± 0.040、0.465±0.029、0.182±0.014、0.721± 0.027，NS-398組、奧曲肽組、聯(lián)合用藥組與對照組比較，P均＜0.01；NS-398組、奧曲肽組與聯(lián)合用藥組比較，P均＜0.01。

3 討論

Cox-2是花生四烯酸（AA）轉(zhuǎn)化為PGH2的限速酶，近年來研究表明，Cox-2在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，其作用機(jī)制可能包括促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，參與腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移，抑制抗腫瘤免疫［5］。此外Cox-2還可通過參與致癌物代謝、影響細(xì)胞周期等途徑參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。Cox-2抑制劑可能通過Cox-2依賴和非依賴途徑發(fā)揮抗胃癌作用［6］。傳統(tǒng)的Cox-2抑制劑非甾體類抗炎藥可抑制Cox-2表達(dá)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但同時(shí)可抑制Cox-1，有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。近年發(fā)展起來的選擇性Cox-2抑制劑（如NS-398、塞來昔布等）使選擇性地抑制Cox-2發(fā)揮抗腫瘤作用成為可能，且不良反應(yīng)少。

奧曲肽是人工合成的生長抑素類似物，通過與靶細(xì)胞上的生長抑素受體（SSTR）結(jié)合后發(fā)揮抗腫瘤作用，但其確切機(jī)制尚不清楚，可能的機(jī)制［7］：①直接與腫瘤細(xì)胞表面的SSTR結(jié)合，通過多種信號傳導(dǎo)途徑，阻滯腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；②與非腫瘤細(xì)胞表面的SSTR結(jié)合，并通過抑制多種促腫瘤生長的激素或細(xì)胞因子的釋放，抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

本研究經(jīng)CCK-8試驗(yàn)證實(shí)選擇性Cox-2抑制劑NS-398聯(lián)合生長抑素類似物奧曲肽對胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖呈協(xié)同抑制作用，并隨作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。采用流式細(xì)胞技術(shù)對細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，NS-398和奧曲肽均能誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡，而兩藥聯(lián)用能顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，具有協(xié)同作用。選擇性Cox-2抑制劑和生長抑素類似物在胃癌細(xì)胞上雖有各自作用的靶點(diǎn)，但卻有共同的信號通路，如轉(zhuǎn)錄活化蛋白1（AP-1）是炎癥或腫瘤情況下調(diào)節(jié)Cox-2表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性Cox-2抑制劑可抑制p38 MAPK的磷酸化，抑制c-fos和c-jun二聚體復(fù)合物與AP-1 DNA位點(diǎn)的結(jié)合，下調(diào)AP-1的活性，從而降低Cox-2表達(dá)［8］。而生長抑素類似物奧曲肽亦能通過抑制ERK-1/ ERK-2表達(dá)，進(jìn)而抑制c-fos表達(dá)，降低AP-1結(jié)合DNA的能力，下調(diào)AP-1的活性［9］。當(dāng)兩者聯(lián)用時(shí)，可能抑制AP-1 DNA結(jié)合活性加強(qiáng)，使Cox-2的表達(dá)下調(diào)至很低水平，從而更加有效地阻斷了Cox-2促癌生長作用，發(fā)揮協(xié)同抗癌效應(yīng)［10］。本研究結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用抑制胃癌細(xì)胞生長的機(jī)制可能與協(xié)同下調(diào)胃癌細(xì)胞內(nèi)Cox-2表達(dá)有關(guān)。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.013

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A

1002-266X（2016）25-0041-03

上海市金山區(qū)衛(wèi)生計(jì)生委課題（GSKG-KTQN-2013-06）。

趙登秋（E-mail：zhaodengqiu@126.com）

2015-12-28）