姜昊聲　曹　燕　吳紹秋　劉冰妍　賈一平　王振磊　尚鳴異

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·基礎(chǔ)研究·

乳腺癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型構(gòu)建及其藥物敏感性研究

姜昊聲曹燕吳紹秋劉冰妍賈一平王振磊尚鳴異

目的觀察乳腺癌MCF-7細(xì)胞在3D與2D培養(yǎng)模式下對(duì)阿霉素的敏感性。方法應(yīng)用模板印制凝膠微孔支架技術(shù)建立體外3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，通過(guò)倒置顯微鏡等方法觀察3D細(xì)胞球的生長(zhǎng)特性；采用AlamarBlue法獲得不同培養(yǎng)模式下藥物阿霉素作用的細(xì)胞抑制率；采用流式細(xì)胞術(shù)比較2D培養(yǎng)和3D培養(yǎng)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的差異。結(jié)果3D與2D培養(yǎng)相比，G1/G0期胞增多，S期、G2/M期細(xì)胞減少，細(xì)胞周期受阻滯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；活細(xì)胞減少，早期凋亡、晚期凋亡、壞死細(xì)胞比例增大(P<0.05)。阿霉素作用3 d后，3D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為23.77 μg/ml [95% CI 15.80～35.77]，2D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75)，MCRI為51.7。結(jié)論3D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞在細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面與2D培養(yǎng)細(xì)胞存在明顯差異，可能是導(dǎo)致乳腺癌多細(xì)胞耐藥的重要原因。

乳腺癌；腫瘤多細(xì)胞球；3D培養(yǎng)；阿霉素；抗藥性

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:871～874)

近年來(lái)，3D細(xì)胞培養(yǎng)在藥物研究和生物學(xué)研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。研究表明，相比于傳統(tǒng)的2D平面培養(yǎng)，在3D立體培養(yǎng)狀態(tài)中細(xì)胞的形態(tài)和功能更加貼近動(dòng)物體內(nèi)活細(xì)胞的真實(shí)生長(zhǎng)狀況，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實(shí)情況。腫瘤多細(xì)胞球(multicellular tumor spheroids,MCTs)是1種經(jīng)典的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，近似于腫瘤發(fā)生早期的無(wú)血管瘤或?qū)嶓w瘤組織中遠(yuǎn)離血管的區(qū)域，其通過(guò)模擬腫瘤異質(zhì)性結(jié)構(gòu)、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，從而能模擬腫瘤組織的生理學(xué)特征[1-3]。MCTs已廣泛的應(yīng)用于藥物篩選與作用機(jī)制研究。目前3D培養(yǎng)已有多種技術(shù)，如旋轉(zhuǎn)瓶技術(shù)(spinner flask)、生物反應(yīng)器技術(shù)(bioreactor)[4]、瓊脂-液體覆蓋法(soft agar-liquid overlay)[5]、懸滴法(hanging drop)[6]、3D多孔支架(porous 3-D scaffold)等[7-8]，但這些方法存在一定的局限性，產(chǎn)生的細(xì)胞球大小差異大、大規(guī)模制備受限、細(xì)胞球收集困難，或者需要較先進(jìn)的設(shè)備等。

本文中，利用凝膠微孔支架技術(shù)構(gòu)建得到了MCTs，系統(tǒng)性觀察細(xì)胞球的生長(zhǎng)變化，檢測(cè)乳腺癌MCF-7多細(xì)胞球的形成對(duì)阿霉素敏感性的影響，以及觀察細(xì)胞周期分布，細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤多細(xì)胞球耐藥產(chǎn)生的影響。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器

胰蛋白酶、高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；阿霉素(Sigma，美國(guó))；瓊脂糖、AlamarBlue細(xì)胞活性試劑盒(Invitrogen，美國(guó))；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))；倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)；酶標(biāo)儀(TECAN，瑞士)；流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD，美國(guó))；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國(guó))。人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.13D立體凝膠微孔支架的制備采用高分子材料模板[9]來(lái)制備3D立體凝膠微孔支架。主要步驟為：以滅菌后的2%瓊脂糖平鋪于培養(yǎng)板孔底部，再將模板印置于其上，待冷卻后移除模板，培養(yǎng)板孔底部遂形成含有大量一致孔徑的凝膠層，見圖1。細(xì)胞培養(yǎng)板紫外光照射2 h以備用。

A為制備凝膠微孔支架的模板，B為凝膠微孔支架，C為3D細(xì)胞球培養(yǎng)板

圖13D立體凝膠微孔支架制備

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)單層培養(yǎng)采用常規(guī)貼壁法，3D多細(xì)胞球培養(yǎng)應(yīng)用凝膠微孔支架技術(shù)，主要步驟為：①消化對(duì)數(shù)期平面培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，制成4×105/ml的單細(xì)胞懸液；②用PBS和完全培養(yǎng)基依次潤(rùn)洗3D細(xì)胞球培養(yǎng)板，排除微孔內(nèi)氣泡；③取2 ml細(xì)胞懸液加入已用凝膠微孔支架鋪底的3D多細(xì)胞球培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；④隔天換液。

1.2.3多細(xì)胞球生長(zhǎng)觀察使用倒置顯微鏡觀察并照像記錄，應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行多細(xì)胞球直徑(n=30)的計(jì)算。

1.2.4藥物敏感性測(cè)定收集對(duì)數(shù)期平面培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度，按2×104/cm2的密度接種于96孔板，每孔加完全培養(yǎng)基100 μL，置于孵箱中培養(yǎng)24 h。3D多細(xì)胞球按上述凝膠微孔支架方法，培養(yǎng)3 d。2D和3D培養(yǎng)系統(tǒng)各分為10組，每組4孔。對(duì)照組換普通培養(yǎng)液，9個(gè)實(shí)驗(yàn)組各孔分別換含10-3、10-2、10-1、1、5、10、20、40、60 μg/ml阿霉素的培養(yǎng)液。于加藥后3 d行AlamarBlue檢測(cè)。各組分別更換培養(yǎng)液，每孔加入含10% AlamarBlue完全培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h。用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的熒光強(qiáng)度。根據(jù)測(cè)得的數(shù)值，以濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件繪制藥物劑量反應(yīng)曲線，計(jì)算50%抑制濃度(50% inhibition concentration，IC50)和多細(xì)胞耐藥指數(shù)(multicellular resistance index，MCRI)。

1.2.5細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的測(cè)定將MCF-7細(xì)胞2D平面培養(yǎng)3 d，凝膠微孔支架培養(yǎng)6 d，分別酶解成單個(gè)細(xì)胞，收集，用預(yù)冷70%乙醇4 ℃固定12 h，碘化丙啶37 ℃避光溫浴染色30 min，流式檢測(cè)和FlowJo分析細(xì)胞周期分布。將2D平面培養(yǎng)3 d的MCF-7細(xì)胞，凝膠微孔支架培養(yǎng)8 d的MCF-7細(xì)胞球，分別酶解成單個(gè)細(xì)胞，收集，用500 μl結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后再加入5 μl的碘化丙啶，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，流式檢測(cè)和FlowJo分析細(xì)胞凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式呈現(xiàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MCF-7細(xì)胞球的生長(zhǎng)特點(diǎn)

用預(yù)制的模板來(lái)制備凝膠微孔支架，這一支架含有大量孔徑一致的微孔。當(dāng)單細(xì)胞懸液均勻接種于凝膠微孔支架鋪底的3D多細(xì)胞球培養(yǎng)板時(shí)，細(xì)胞在微孔中相互聚集，形成多細(xì)胞聚集體，多個(gè)細(xì)胞聚集體在細(xì)胞連接的作用下開始融合，形成邊界光滑連續(xù)的多細(xì)胞球；隨著培養(yǎng)時(shí)間的加長(zhǎng)，細(xì)胞球外層細(xì)胞的增殖，球體邊緣開始變毛糙，球體體積逐漸增大；培養(yǎng)7 d后，大多數(shù)細(xì)胞球直徑和形態(tài)不再發(fā)生明顯的變化(圖2)。圖3顯示的是細(xì)胞球直徑變化曲線圖。細(xì)胞球形成后，直徑經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的減小后逐漸的增大，大約一周后，直徑進(jìn)入平臺(tái)期，不再明顯增大。應(yīng)用凝膠微孔支架技術(shù)制備出的細(xì)胞球，大小較一致(SD≤ 10%)，且細(xì)胞連接牢固，可以通過(guò)移液槍吹打來(lái)大量的收集。圖4顯示的是培養(yǎng)3 d后收集的細(xì)胞球。

圖2　MCF-7細(xì)胞球生長(zhǎng)變化圖

圖3　細(xì)胞球直徑變化曲線圖

圖4　凝膠支架上收集到的大量培養(yǎng)3 d后的MCF-7細(xì)胞球

2.23D與2D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性

阿霉素對(duì)3D與2D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞劑量反應(yīng)結(jié)果見圖5。與2D培養(yǎng)相比，各濃度組3D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥物敏感性明顯降低，二者有顯著性差異(P<0.05)。隨著藥物濃度加大，3D與2D培養(yǎng)細(xì)胞抑制率都明顯升高。阿霉素作用3 d后，3D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為23.77 μg/ml[95% CI 15.80～35.77]，2D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75)，MCRI 為51.7，可見3D培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性增加，這一結(jié)果與H?kanson 等[10-11]學(xué)者的研究結(jié)果一致。

2.33D與2D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期分布

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2種培養(yǎng)系統(tǒng)下MCF-7細(xì)胞周期的分布，3D培養(yǎng)與2D培養(yǎng)相比，存在細(xì)胞阻滯，G1/G0期細(xì)胞增多，S期、G2/M期細(xì)胞減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

圖5　阿霉素對(duì)3D與2D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞劑量反應(yīng)曲線

培養(yǎng)系統(tǒng)G1/G0SG2/M2D40.76±1.9049.44±2.635.81±0.303D59.48±3.10*30.70±2.52*4.42±0.17*

注：與2D平面培養(yǎng)比較，*為P<0.05。

2.43D與2D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡比較

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2種培養(yǎng)系統(tǒng)下MCF-7細(xì)胞凋亡，3D培養(yǎng)與2D培養(yǎng)相比，活細(xì)胞減少，早期凋亡、晚期凋亡、壞死細(xì)胞比例增大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2　3D立體和2D平面培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞凋亡率比較/%

注：與2D平面培養(yǎng)比較，*P<0.05。

3　討論

目前，進(jìn)行體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)一般采用傳統(tǒng)的平面培養(yǎng)，而體內(nèi)藥物的作用靶點(diǎn)通常是具有一定組織結(jié)構(gòu)的實(shí)體瘤，瘤體內(nèi)細(xì)胞異質(zhì)性明顯，在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間存在著廣泛的相互作用和相互影響，因而與單層培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)存在差異。腫瘤細(xì)胞體外三維培養(yǎng)可得到近似于體內(nèi)腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實(shí)情況。而腫瘤多細(xì)胞球作為一種經(jīng)典的3D細(xì)胞培養(yǎng)模型越來(lái)越受學(xué)者們的重視。本研究采用預(yù)制的模板制備立體凝膠微孔支架，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)。當(dāng)單細(xì)胞懸液接種于凝膠微孔支架鋪底的3D細(xì)胞球培養(yǎng)板時(shí)，細(xì)胞在微孔中相互聚集、融合，短時(shí)間內(nèi)(24 h)就能自發(fā)形成腫瘤多細(xì)胞球。形成的細(xì)胞球大小也較一致(SD≤10%)，這對(duì)于在藥物研究中獲得可重復(fù)的結(jié)果非常重要。因制備的細(xì)胞球具有牢固的三維立體結(jié)構(gòu)，我們能夠輕松的通過(guò)移液槍沖洗來(lái)收集，并對(duì)單個(gè)細(xì)胞球進(jìn)行定性或者定量的分析。這一經(jīng)凝膠微孔支架鋪底的3D細(xì)胞球培養(yǎng)板，能夠大規(guī)模的制備多細(xì)胞球，在高效藥物篩選中具有廣泛的應(yīng)用前景，可進(jìn)行商業(yè)化的生產(chǎn)。

腫瘤細(xì)胞耐藥是影響化療療效和患者預(yù)后的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：阿霉素作用3 d后，3D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為23.77 μg/ml，2D培養(yǎng)細(xì)胞的IC50值為0.46 μg/ml。3D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的多細(xì)胞耐藥指數(shù)為51.7，與2D培養(yǎng)細(xì)胞相比，對(duì)化療藥物阿霉素明顯耐藥，表明實(shí)驗(yàn)所建立的乳腺癌多細(xì)胞耐藥模型是成功的。

3D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞與2D培養(yǎng)細(xì)胞相比，細(xì)胞周期明顯阻滯于G1/G0期，可能是導(dǎo)致乳腺癌多細(xì)胞耐藥的重要原因。腫瘤多細(xì)胞球(直徑>200 μm)可分為邊緣增殖細(xì)胞區(qū)，中間靜止細(xì)胞區(qū)、中心壞死區(qū)[12]，這種異質(zhì)性的細(xì)胞分布以及球樣體內(nèi)的物質(zhì)梯度極其類似于體內(nèi)腫瘤微轉(zhuǎn)移灶、局部無(wú)血管腫瘤組織和實(shí)體瘤組織中遠(yuǎn)離血管的區(qū)域。然而，MCTs內(nèi)大量腫瘤細(xì)胞滯留在細(xì)胞周期某個(gè)時(shí)相點(diǎn)，除導(dǎo)致一些細(xì)胞周期特異性化療藥物失效外，由于其增殖緩慢，處于相對(duì)靜止或者靜止?fàn)顟B(tài)，極易對(duì)其他許多化療藥物產(chǎn)生耐受[13]。結(jié)果還顯示，3D培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯升高，這一結(jié)果與Kim 等[13]學(xué)者的研究結(jié)果不一致。我們主要考慮以下原因：在培養(yǎng)8 d后進(jìn)行凋亡檢測(cè)的細(xì)胞球直徑已經(jīng)達(dá)到450 μm左右，球體直徑較大，球體中心區(qū)缺乏氧氣、營(yíng)養(yǎng)、代謝產(chǎn)物堆積和低pH值，細(xì)胞發(fā)生較多的凋亡和壞死。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠微孔支架技術(shù)，成功的建立了乳腺癌多細(xì)胞耐藥模型。近年來(lái)，許多對(duì)單層培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)殺傷作用的化療藥物在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)往往不能達(dá)到理想效果，而MCTs中細(xì)胞形態(tài)和功能更加貼近動(dòng)物體內(nèi)活細(xì)胞的真實(shí)生長(zhǎng)狀況，能夠更好的模擬藥物和腫瘤作用的真實(shí)情況，在藥敏研究中應(yīng)用前景光明。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)3D培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性和2D培養(yǎng)細(xì)胞相比發(fā)生明顯改變，特別是球體樣三維結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞間的相互作用可能是誘導(dǎo)多細(xì)胞耐藥的重要原因，其相關(guān)的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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(編輯：吳小紅)

Fabrication of Three Dimensional Cell Culture Model of Breast Adenocarcinoma and Detection of Its Drug Resistance

JIANGHaosheng,CAOYan,WUShaoqiu,etal.

TongrenHospital,ShanghaiJiaotongUniversityofMedicine,Shanghai,200072

ObjectiveTo observe the changes of sensitivity to doxorubicin on breast adenocarcinoma MCF-7 cells cultured as 3 dimensional model or monolayer.MethodsMCF-7 cells were cultured as 3 dimensional model using agarose scaffolds with highly ordered micro-wells.The spheroid growth characterization was observed by invert microscope.The sensitivity to doxorubicin on MCF-7 spheroids or monolayers was determined by AlamarBlue assay respectively.Cell cycle and apoptotic rate were detected by flow cytometry.ResultsFor 3D spheroid culture,the proportion of cells in G0～G1phase was higher,while the proportion of cells in S phase and G2-M phase were lower than the 2D culture(P<0.05).The cell viability declined in 3D culture than the 2D control,and the proportion of cells in the early-apoptotic,late-apoptotic phase increased significantly(P<0.05).After 3 days of DOX treatment,the IC50value obtained for spheroid culture was 23.77 μg/ml [95% CI 15.80～35.77],relative to 0.46 μg/ml (95% CI 0.28～0.75) for the monolayer culture.The MCRI value was 51.7.ConclusionThere are significant differences in cell cycle and apoptotic rate between MCF-7 spheroids and monolayer,which may be the important causes of the multicellular resistance of breast carcinoma.

Breast adenocarcinoma；Multicellular tumor spheroids；Three dimensional cell culture；Doxorubicin；Drug resistance

200072 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院

尚鳴異

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.06.001

R737.9

A

1001-5930(2016)06-0871-04

2016-04-01

2016-04-24)