張喜峰,張芬琴,羅光宏

(1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院,甘肅張掖 734000;2.河西學院凱源生物技術開發(fā)中心,甘肅省微藻工程技術研究中心,甘肅張掖 734000)

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[C4mim]BF4/MgSO4雙水相萃取鎖陽總黃酮及抗氧化分析

張喜峰1,張芬琴1,羅光宏2,*

(1.河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院,甘肅張掖 734000;2.河西學院凱源生物技術開發(fā)中心,甘肅省微藻工程技術研究中心,甘肅張掖 734000)

對[C4mim]BF4(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽)/MgSO4雙水相萃取鎖陽總黃酮的工藝條件及抗氧化作用進行研究。以[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)、MgSO4質(zhì)量分數(shù)、鎖陽總黃酮粗提物質(zhì)量分數(shù)為響應因子,利用三因素三水平的響應面分析對鎖陽總黃酮萃取條件進行優(yōu)化,初步評價鎖陽總黃酮抗氧化作用。結果表明,鎖陽黃酮的最佳萃取條件為:[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為13.025%、MgSO4質(zhì)量分數(shù)為17.5%及粗提液質(zhì)量分數(shù)12%,萃取率達到98.4%。鎖陽總黃酮的抗氧化性隨著濃度升高而升高,當總黃酮濃度為0.6 mg/mL時,OH自由基清除率和DPPH自由基清除率分別達到65%和67.2%。

鎖陽,雙水相體系,總黃酮,抗氧化

鎖陽(CynomoriumsongaricumRuPr.)是鎖陽科(Cynomoriaceae)鎖陽屬多年生肉質(zhì)草本植物,多寄生于蒺黎科(Zygophvllaceae)白刺屬(Nityaria L.)植物根部,是全寄生種子植物[1]。主要產(chǎn)于甘肅、新疆、青海、寧夏、內(nèi)蒙古等地。黃酮是鎖陽中主要活性成分之一[2],具有抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老作用[3-6]。

目前鎖陽黃酮提取方法主要有醇提法[7]、超聲波輔助提取[8]、超臨界CO2萃取法[9]。這些提取方法存在提取效率較低、溶劑殘留、能耗高、成本高等缺點。雙水相是指兩種水溶性的物質(zhì)不相容而造成它們的混合溶液分離形成兩相,通過溶質(zhì)在兩相之間分配系數(shù)的差異而進行萃取純化或直接用其作為提取劑的體系[10]。離子液體雙水相具有無毒、不易乳化、粘度低、分相時間短、操作簡單等特點[11],已被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離[12-15]。

本實驗以鎖陽為材料,采用單因素實驗和響應面分析法,優(yōu)化C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系萃取黃酮的工藝,并探討鎖陽黃酮抗氧化能力,為其進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鎖陽產(chǎn)地甘肅,由甘肅凱源生物技術開發(fā)中心提供。

蘆丁標準品(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;[C4mim]BF4中國科學院蘭州化學物理研究所;MgSO4,無水乙醇,VC天津光復精細化工研究所;亞硝酸鈉,硝酸鋁,硫酸亞鐵,雙氧水,鄰二氮菲均為分析純天津百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)天津市富宇精細化工有限公司。

722可見分光光度計上海光譜儀器有限公司;旋轉蒸發(fā)儀上海青浦滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1鎖陽粗黃酮的制備精確稱取鎖陽干粉約10 g,置于500 mL燒杯中,按照1∶25(g/mL)加入80%乙醇,在325 W功率超聲提取其中黃酮10 min,2000 r/min,離心10 min,得上清液,在旋轉蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮,轉入50 mL容量瓶中,加80%乙醇定容,即得鎖陽黃酮粗提液[16]。

1.2.2鎖陽黃酮雙水相萃取方法體系總質(zhì)量為10.00 g,加入適量的[C4mim]BF4、MgSO4和黃酮粗提液,充分振蕩使成相物質(zhì)溶解,靜置至兩相達到分離,鎖陽黃酮富集于雙水相系統(tǒng)的上相中,讀取上下相體積,求相比R;分別測定上下相黃酮濃度,計算鎖陽黃酮的分配系數(shù)K及提取率Y[14],如下式:

R=上相體積(Vt)/下相體積(Vb)

K=上相黃酮濃度(Ct)/下相黃酮濃度(Cb)

Y(%)=RK/(1+RK)×100

1.2.3標準曲線的繪制采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定黃酮[17]。

1.2.4雙水相萃取單因素實驗室方法[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響:在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,MgSO4質(zhì)量分數(shù)為20%,粗提液質(zhì)量分數(shù)為10%,分別設定[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為10%、12.5%、15%、17.5%、20%進行雙水相萃取;MgSO4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響:在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為15%,粗提液質(zhì)量分數(shù)為10%,改變MgSO4質(zhì)量分數(shù)為15%、17.5%、20%、22.5%、25%進行雙水相萃取;在[C4mim]BF4/MgSO4雙水相體系中,[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為15%,MgSO4的質(zhì)量分數(shù)為17.5%,改變粗提液質(zhì)量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%進行雙水相萃取。

1.2.5Box-Behnken組合設計研究最佳萃取條件在單因素實驗的基礎上,選取[C4mim]BF4、MgSO4和粗提液三個自變量,采用Design-Expert 7.0軟件設計三因素三水平Box-Behnken實驗,因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken實驗因素與水平

1.2.6鎖陽總黃酮抗氧化分析

1.2.6.1鎖陽總黃酮對·OH的清除實驗參照加列西·那甫等[16]的方法。取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL于試管中,依次加入0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液2 mL,0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL,搖勻,加入0.01%過氧化氫溶液1 mL,于37 ℃水浴加熱60 min,在536 nm波長處測定吸光度,所測得吸光度為損傷管的吸光值(A損傷)。未損傷管以1 mL水代替損傷管中過氧化氫,利用1.2.5萃取后的總黃酮溶液,配制不同濃度的樣品溶液。依次取0.2 mL代替損傷管中的水,操作方法同損傷管,可測的536 nm波長處未損傷管的吸光值(A空白,A樣品);蘆丁、維生素C對羥自由基的清除效果測定方法同上。

1.2.6.2鎖陽黃酮對DPPH的清除實驗利用1.2.5萃取后的總黃酮溶液,配制不同濃度的樣品溶液。分別取2 mL樣品溶液,分別加入濃度為3×10-4mol/L的DPPH溶液2.0 mL,混合搖勻,反應20 min后在517 nm測定其吸光值A1。以2 mL無水乙醇代替DPPH的吸光值為A2,以2 mL蒸餾水代替樣品溶液的吸光值為A0,以無水乙醇作空白對照[16]。DPPH自由基清除率可表示:

E(%)=[(1-(A1-A2)/A0]×100

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

單因素實驗數(shù)據(jù)和響應面分析分別采用Excel2003和Design-Expert7.0.5軟件分析,所有實驗均重復三次,取平均值。

2　結果與分析

2.1標準曲線繪制

在510 nm處測定不同含量的蘆丁的吸光值,以蘆丁含量(mg)為橫坐標(X),吸光值為縱坐標(Y),計算得到回歸方程:Y=1.367X-0.0134,R2=0.9912。

2.2單因素實驗結果與分析

2.2.1[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響由圖1可知,隨著[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)逐漸增大,黃酮萃取率和分配系數(shù)先增加后減小,在[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為15%時,萃取率和分配系數(shù)達到最大值。主要原因是離子液體[C4mim]BF4和黃酮化合物之間形成π-π體系,促使黃酮轉移至上相,當離子液體質(zhì)量分數(shù)過大時,使得體系的黏稠度高,阻止相間分子轉移,不利于黃酮的轉移、分配及萃取。我們的觀點與Yan etal等[17]的觀點是一致的。因此,確定[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為15%。

圖1　[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.1　Effect of the mass percent of [C4mim]BF4on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.2.2MgSO4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響由圖2可知,鎖陽黃酮的萃取率和分配系數(shù)隨MgSO4用量不同,呈規(guī)律性變化,表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢。在MgSO4質(zhì)量分數(shù)為17.5%時,萃取率和分配系數(shù)同時達到最大,分別為99.35%和42.5。因為隨著MgSO4質(zhì)量分數(shù)的增加,雙水相體系離開成相臨界點距離增大,使上下相電位差值增大,而電位差的大小直接影響到分配系數(shù)和萃取率;MgSO4的質(zhì)量分數(shù)過高,不僅影響黃酮的表面疏水性,而且擾亂雙水相系統(tǒng),改變各相中成相物質(zhì)的組成,使萃取率和分配系數(shù)降低。因此,確定MgSO4的質(zhì)量分數(shù)為17.5%。

圖2　MgSO4質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.2　Effect of the mass percent of MgSO4on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.2.3粗提液質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響結果表明,粗提液質(zhì)量分數(shù)為10%時,鎖陽黃酮的分配系數(shù)和萃取率達到最大,分別為98.16%和46.2(圖3),原因可能是黃酮類化合物羥基基團破壞水分子之間的氫鍵網(wǎng)絡,黃酮類化合物和水分子之間形成新的氫鍵網(wǎng)絡促使粗提物中其他類物質(zhì)轉移至下相;當粗提液質(zhì)量分數(shù)大于10%時,萃取率和分配系數(shù)均逐漸降低;這是由于過量黃酮類化合物集聚在兩相間,影響兩相中傳質(zhì)過程。因此確定粗提液質(zhì)量分數(shù)10%為最佳萃取條件。

圖3　粗提液質(zhì)量分數(shù)對鎖陽黃酮分配行為的影響Fig.3　Effect of the mass percent of crude flavone on partitioning behaviour of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.3響應面分析實驗結果

2.3.1Box-Behnken Design實驗數(shù)據(jù)分析根據(jù)以上單因素實驗結果,采用響應面方法進一步優(yōu)化實驗條件。根據(jù)Box-Behnken組合設計原理,以萃取率為響應值,以[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)(A)、MgSO4質(zhì)量分數(shù)(B)和粗提液質(zhì)量分數(shù)(C)為實驗因素設計實驗,分析實驗結果見表2。

表2　Box-Behnken實驗設計與結果

以鎖陽黃酮萃取率Y(%)為響應值,根據(jù)表2的實驗結果,用Design-Expert7.0軟件對各因素進行二元多次回歸擬合,得到[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)(A)、MgSO4質(zhì)量分數(shù)(B)和粗提液質(zhì)量分數(shù)(C)與鎖陽黃酮之間的二次多項回歸方程:

Y=98.876-0.46875A+0.0175B+0.02875C+0.0625AB-1.155AC+0.0525BC-1.048A2-0.3655B2-0.323C2

由表3可以看出,本模型擬合程度明顯,p=0.001<0.01,模型極顯著。失擬項p為0.3653(p>0.05)沒有顯著意義,說明數(shù)據(jù)中沒有異常點。模型決定系數(shù)為94.82%,說明該模型具有較好的可信度,自變量與響應值之間的線性關系顯著,可用于實驗的理論預測。模型一次項A(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義,B、C對黃酮萃取率不顯著;二次項A2(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義;交互項AC(p<0.01)對黃酮萃取率有極顯著意義,AB、BC對黃酮萃取率不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi),各因素的主效應關系為:[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)(A)>粗提液質(zhì)量分數(shù)(C)>MgSO4質(zhì)量分數(shù)(B)。

表3　對擬合二次多元模型的方差分析結果

2.3.2雙水相萃取鎖陽黃酮的響應面圖分析根據(jù)回歸模型作出相應的響應面圖,如圖4所示,每個響應面圖分別代表2個獨立變量之間的相互作用,由響應面可以看出,AC之間有一定相互作用,AB、BC交互作用較小。

圖4　各因素交互作用的響應面立體圖Fig.4　Response plots for the pairwise interactive effects

2.3.3模型優(yōu)化及驗證實驗以響應面優(yōu)化實驗得到雙水相體系組成條件:[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為13.025%、MgSO4質(zhì)量分數(shù)為17.5%,粗提液質(zhì)量分數(shù)12%,此時鎖陽黃酮的萃取效果最佳,萃取率為99.21%。在此條件下做三組平行實驗進行驗證,所得結果為98.4%,與模型預測值基本一致,實驗結果具有一定的使用參考價值。

2.4鎖陽黃酮抗氧化活性分析

2.4.1羥自由基清除能力由圖5可知,萃取后鎖陽黃酮對羥自由基清除能力隨著黃酮濃度增加而升高,當黃酮濃度為0.6 mg/mL時,鎖陽黃酮對羥自由基清除能力達到65%,鎖陽黃酮對羥自由基清除能力的IC50值為0.445 mg/mL;同樣條件下,VC對羥自由基清除能力強于鎖陽黃酮。

圖5　鎖陽黃酮對羥自由基的清除能力Fig.5　Hydroxyl Radical Scavenging effect of total flavonoids of cynomorium songaricum

2.4.2DPPH自由基清除能力由圖6可知,隨著黃酮濃度不斷增大,對DPPH自由基清除能力也增大;當黃酮濃度為0.6 mg/mL時,鎖陽黃酮對DPPH自由基清除能力達到67.2%。鎖陽黃酮DPPH自由基清除能力的IC50值為0.469 mg/mL;在黃酮濃度0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi),VC對DPPH自由基清除能力優(yōu)于鎖陽黃酮。

圖6　鎖陽黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.6　DPPH free radical scavenging effect of total flavonoids of cynomorium songaricum

3　結論

采用離子液體雙水相萃取鎖陽黃酮,在單因素實驗的基礎上,以鎖陽黃酮萃取率為響應值,得到鎖陽黃酮的最佳提取工藝為[C4mim]BF4質(zhì)量分數(shù)為13.025%、MgSO4質(zhì)量分數(shù)為17.5%和粗提液質(zhì)量分數(shù)12%,在此提取條件下鎖陽黃酮的萃取率為98.4%,說明采用響應面法優(yōu)化離子液體雙水相萃取鎖陽黃酮是比較可靠的。

萃取后鎖陽黃酮的抗氧化能力實驗結果表明,當黃酮濃度在0.1～0.6 mg/mL時,黃酮對羥自由基和DPPH清除能力逐漸增大的;鎖陽黃酮對羥自由基清除能力的IC50值為0.445 mg/mL;鎖陽黃酮DPPH自由基清除能力的IC50值為0.469 mg/mL;同樣條件下,對羥自由基和DPPH自由基清除能力低于VC。

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Aqueous two phase system based on[C4mim]BF4/MgSO4for isolation of total flavonoids fromCynomoriumSongaricumand its antioxidation activity analysis

ZHANG Xi-feng1,ZHANG Fen-qin1,LUO Guang-hong2,*

(1.The College of Agriculture and Biotechnology(CAB),Hexi University,Zhangye 734000,China;2.Microalgae Engineering Research Center of Gansu Province,Kaiyuan Bio-tech Development Center,Hexi University,Zhangye 734000,China;)

An efficient aqueous two-phase based on[C4mim]BF4/MgSO4extraction technique was developed to extract total flavonoids fromCynomoriumSongaricumand evaluate the antioxidant activity.[C4mim]BF4concentration(%w/w),MgSO4concentration(%w/w),and crude extract concentration(%w/w)were selected as response factors,and the yield of total flavonoids was used as response value. The optimum conditions for total flavonoids extraction were obtained based on three-factor-three-level experiment design according to the principles of response surface methodology,and antioxidation activity was evaluated. The optimum conditions were 13.025%(w/w),17.5%(w/w),and 12%(w/w)for[C4mim]BF4concentration,MgSO4concentration,and crude extract concentration respectively. Maximum yield of extracted total flavonoids from the experiments was determined to be 98.4% under the optimal conditions. The antioxidant property of total flavonoids enhanced with flavonoids concentration increased. Hydroxy radical scavenging rate and DPPH free radical reached 65% and 67.2% respectively when total flavonoids concentration was 0.6 mg/mL.

CynomoriumSongaricum;aqueous two-phase system;total flavonoids;antioxidation

2015-03-10

張喜峰(1982-)，男，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)，E-mail：curiouslysxsd@163.com 。

羅光宏(1965-)，男，碩士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)，E-mail:464690924@qq.com。

甘肅省中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(1047GCCG001)；河西學院校長基金項目(XZ2014-29)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000