孫　娟,黃業(yè)傳,李婷婷

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

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豬肉超氧化物歧化酶超高壓失活動(dòng)力學(xué)研究

孫娟,黃業(yè)傳*,李婷婷

(西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

以豬背最長(zhǎng)肌為材料,用不同壓力(400～750 MPa)結(jié)合熱(20～60 ℃)處理,以研究豬肉中超氧化物歧化酶(SOD)的超高壓失活動(dòng)力學(xué)情況。結(jié)果表明:在某一恒定的溫度下(20 ℃≤T≤60 ℃),豬肉中SOD的失活速率常數(shù)k隨著處理壓力的增加而增大。各溫度條件下的反應(yīng)活化體積Va都是負(fù)值,表明隨著壓力的增加SOD失活速率常數(shù)在增大。SOD反應(yīng)活化體積Va的絕對(duì)數(shù)值在40 ℃及60 ℃時(shí)達(dá)到最小,表明此溫度下SOD超高壓失活速率常數(shù)受壓力影響最小,具有較高的壓力穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)壓力范圍之內(nèi)(400 Mpa≤P≤750 Mpa),反應(yīng)活化能Ea值總體呈減小趨勢(shì),說(shuō)明隨著壓力的增加,溫度對(duì)SOD失活速率常數(shù)的影響在減弱。

超高壓,超氧化物歧化酶,豬肉,失活,動(dòng)力學(xué)

高壓處理是一種食品冷殺菌技術(shù),與傳統(tǒng)的熱處理相比,它對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)破壞更小[1-3],能改變?nèi)獾臓I(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味、凝膠性、嫩度[4-5]、色澤[6-10]等。高壓處理也會(huì)產(chǎn)生對(duì)食品不利因素,如一定壓力處理肉制品能加快脂肪氧化,從而導(dǎo)致肉制品品質(zhì)敗壞[11],而脂肪氧化產(chǎn)生游離自由基[12-15],影響肉質(zhì)品的安全性,對(duì)人體健康造成威脅。目前高壓處理對(duì)肌肉中脂肪氧化影響的研究比較多[16-18],但有關(guān)高壓處理對(duì)肌肉中各種酶活性影響的研究卻很少。動(dòng)物肌肉中很多酶可能與高壓處理下的脂肪氧化有關(guān),如脂肪氧化酶、脂肪酶等能加速脂肪氧化或降解[19-20],但動(dòng)物肌肉中的抗氧化酶,如過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶[21]、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等可以清除自由基、起到抑制或者減緩脂肪氧化的作用。

超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中的一種酸性蛋白質(zhì),在抵御氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷及修復(fù)受損細(xì)胞中起著重要作用。動(dòng)物肌肉中的超氧化物歧化酶能清除自由基減緩脂肪氧化,酶活性越高,清除自由基的能力越強(qiáng),肌肉保水能力就越高、顏色越鮮艷,肉的品質(zhì)就越好。由此可見(jiàn),超氧化物歧化酶對(duì)肉的品質(zhì)具有很大的影響,而高壓結(jié)合熱處理對(duì)肌肉中的超氧化物歧化酶[22]是否有顯著影響,有必要進(jìn)行研究。因此本課題以豬背最長(zhǎng)肌為材料,探究不同壓力(400～750 MPa)結(jié)合熱(20～60 ℃)處理后豬肉中超氧化物歧化酶(SOD)活性變化情況和動(dòng)力學(xué)特征,為豬肉品質(zhì)的研究、改善及加工貯藏過(guò)程中酶活性的控制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

四川綿陽(yáng)市青義鎮(zhèn)青義市場(chǎng)土豬,6～8個(gè)月月齡,體重80～110 kg,早上宰殺,取新鮮背最長(zhǎng)肌約4 kg,快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,去掉表面可見(jiàn)脂肪、筋膜及結(jié)締組織,切成長(zhǎng)寬高約1 cm左右的小塊,迅速混合均勻后按每份10 g左右分裝于透明聚乙烯包裝袋中,并真空包裝,在-20條件下冷凍備用。氯化鈉四川成都市科龍化工試劑廠,分析純;SOD試劑盒江蘇南京建成生物工程研究所,分析純。

HPP.L2-800/1型食品高壓設(shè)備天津華泰森淼生物工程技術(shù)股份有限公司;DZ400-DZ(2L)型真空封裝機(jī)四川成都瑞昌儀器制造有限公司;TDL-60B型低速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;FSH-2A型可調(diào)高速勻漿器金壇市金玻實(shí)驗(yàn)儀器廠;HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇常州澳華儀器有限公司;UV1000型單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豬肉的超高壓處理樣品解凍24 h后按設(shè)定的壓力(400～750 MPa),溫度(20～60 ℃)和時(shí)間(5～20 min)進(jìn)行處理,經(jīng)處理的樣品立即置于4 ℃冷藏待測(cè),每組處理設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。超高壓設(shè)備的工作參數(shù)為:壓力范圍0～800 MPa,升壓速度約為50 MPa/s,卸壓速度約為100 MPa/s?？岫刘プ鳛楦邏禾幚淼膫鲏航橘|(zhì)。

1.2.2SOD活性測(cè)定取一定量高壓處理后的豬肉組織,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所確定的最佳取樣濃度制備上清液,在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)550 nm處測(cè)定吸光值,再通過(guò)吸光值及蛋白質(zhì)含量計(jì)算出SOD的活力。根據(jù)試劑盒說(shuō)明,每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn),溫度一定的情況下,酶失活速率常數(shù)k與高壓處理時(shí)間t滿足一階反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程(1),本實(shí)驗(yàn)用一階反應(yīng)動(dòng)力學(xué)來(lái)描述超氧化物歧化酶的超高壓失活情況[23],對(duì)方程(1)進(jìn)行積分得到方程(2),方程(1)、(2)如下所示:

dA/dt=-kA

式(1)

ln(A/A0)=-kt

式(2)

式中:A為高壓處理時(shí)間為t時(shí)的樣品酶活,U/mgprot;t為超高壓處理時(shí)間,min;k為酶的失活速率常數(shù),min-1;A0為高壓處理時(shí)間為0時(shí)的樣品酶活,U/mgprot。

由此,利用SPSS的線性回歸程序,繪制出酶活力的自然對(duì)數(shù)ln(A/A0)與時(shí)間t的線性圖,而相應(yīng)溫度或壓力下豬肉中超氧化物歧化酶的失活速率常數(shù)k可以從線性圖的斜率中求得。

在本實(shí)驗(yàn)中,用Eyring方程(3)和Arrhenius方程(4)來(lái)評(píng)價(jià)處理溫度和壓力對(duì)超氧化物歧化酶反應(yīng)速率常數(shù)k的影響[24],具體表現(xiàn)為反應(yīng)活化體積Va(cm3/mol)和反應(yīng)活化能Ea(kJ/mol)。

式(3)

式(4)

式中:krefT,krefP為參考溫度或壓力下的失活速率常數(shù),min-1;R為通用氣體常數(shù),8.314J/(mol·K);T為溫度,K;Tref為參考溫度,K;P為壓力,MPa;Pref為參考?jí)毫?MPa。

2　結(jié)果與分析

2.1超氧化物歧化酶超高壓失活速率常數(shù)的確定

圖1　ln(A/A0)與高壓結(jié)合熱處理時(shí)間t的關(guān)系圖Fig.1　Relationship between ln(A/A0)and processing time

從圖1可以看出,不同壓力及溫度處理豬肉后超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)k值不同,根據(jù)公式(2)可得,k值越小表明酶的活性越高,k值越大酶活性越小。根據(jù)圖中5種不同處理?xiàng)l件下k的大小可以判斷出四種樣品中SOD活性是:675 MPa-30 ℃>550 MPa-50 ℃>650 MPa-40 ℃>750 MPa-20 ℃>400 MPa-60 ℃。不同壓力、溫度處理下的超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)偏差如表1所示。

表1　豬肉中超氧化物歧化酶的超高壓失活速率常數(shù)(×10-2 min-1)

注:表中SOD失活速率常數(shù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,是3次重復(fù)測(cè)定的結(jié)果。

由表1可知在一定的處理溫度下(20 ℃≤T≤60 ℃),豬肉中超氧化物歧化酶的失活速率常數(shù)隨著處理壓力的增加而增大,表明在一定溫度下增加壓力可以加快超氧化物歧化酶失活。當(dāng)處理溫度為60 ℃時(shí),SOD失活速率常數(shù)均大于2×10-2min-1,明顯高于20～50 ℃時(shí)的失活速率常數(shù)。在一定的處理壓力下(400～750 Mpa),豬肉中超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)隨著溫度的增加而增大,說(shuō)明升高溫度可以加速超氧化物歧化酶失活。在王韌[25]等人研究的大豆脂肪氧合酶超高壓失活情況中,發(fā)現(xiàn)10～20 ℃時(shí)脂肪氧合酶具有較高的壓力穩(wěn)定性,在此溫度之外增加或減小溫度都會(huì)降低酶的穩(wěn)定性,但本研究的溫度范圍是20 ℃以上,因此未發(fā)現(xiàn)溫度有臨界點(diǎn)。苗文娟[26]進(jìn)行了小麥胚芽脂肪酶和脂肪氧化酶的微波鈍化動(dòng)力學(xué)研究,研究表明在45～60 ℃區(qū)間內(nèi),微波、水浴處理脂肪酶和脂肪氧化酶,隨著溫度的增大,兩種酶的失活速率常數(shù)均在升高。本研究的結(jié)論與他們的研究基本一致。

2.2壓力對(duì)超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)得出在某一特定的溫度下,豬肉中超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)隨著處理壓力的增加而增大,壓力對(duì)超氧化物歧化酶反應(yīng)速率常數(shù)k的影響規(guī)律可以用熱力學(xué)方程Eyring方程(式3)來(lái)評(píng)價(jià)。利用SPSS,對(duì)SOD失活速率常數(shù)的自然對(duì)數(shù)ln(k)差與壓力P線性回歸后得到的斜率即為反應(yīng)活化體積Va值,從而可以從數(shù)量上客觀衡量處理壓力對(duì)SOD失活速率常數(shù)k的影響情況。不同溫度條件下的Va值如表2所示。

表2　不同溫度條件下超氧化物歧化酶

注:a為標(biāo)準(zhǔn)偏差,**為極顯著,*為顯著,表3同。

從表2可知,在實(shí)驗(yàn)溫度20～60 ℃之間,各溫度條件下的反應(yīng)活化體積Va都是負(fù)值,這說(shuō)明隨著壓力的增加SOD失活速率常數(shù)k在增大。表中反應(yīng)活化體積Va的絕對(duì)數(shù)值隨著溫度的增加呈先減小后增大再減小的趨勢(shì),Va絕對(duì)數(shù)值在40 ℃時(shí)相對(duì)較小,在60 ℃時(shí)最小,說(shuō)明40 ℃和60 ℃相比其他溫度條件下的壓力對(duì)SOD超高壓失活速率常數(shù)影響較弱。壓力對(duì)食物中SOD影響情況的研究還未有報(bào)道,但一些學(xué)者研究了其它酶,如王韌等人研究了大豆脂肪氧合酶的超高壓失活情況,Ludikhuzye等人研究了超高壓下純酶緩沖液失活情況,Indrawati[27]等對(duì)綠豆脂肪氧合酶超高壓失活進(jìn)行了研究,他們的研究中Va絕對(duì)值比本實(shí)驗(yàn)中的要高,說(shuō)明在他們的實(shí)驗(yàn)中壓力對(duì)酶失活速率常數(shù)的影響比較明顯;而Katsaros[28]等人對(duì)獼猴桃汁中蛋白水解酶高壓結(jié)合熱處理進(jìn)行研究中的Va絕對(duì)值比本實(shí)驗(yàn)的小,表明壓力對(duì)蛋白水解酶失活速率常數(shù)的影響不明顯。本研究中Va的變化趨勢(shì)與他們的研究結(jié)論不完全一致。

2.3溫度對(duì)超氧化物歧化酶失活速率常數(shù)的影響

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得出在壓力400～750 Mpa之間,超氧化物歧化酶的失活速率常數(shù)k隨著溫度的升高而增大,因此Arrhenius(動(dòng)力學(xué))式(4)在整個(gè)溫度20～60 ℃之間都適用,通過(guò)動(dòng)力學(xué)方程計(jì)算SOD的反應(yīng)活化能Ea進(jìn)而了解SOD失活速率常數(shù)的變化情況。不同壓力條件下的Ea值見(jiàn)表3。

由表3知,在整個(gè)實(shí)驗(yàn)壓力范圍之內(nèi)(400～750 Mpa),反應(yīng)活化能Ea全部是正值,說(shuō)明在特定壓力下SOD失活速率常數(shù)隨著溫度的升高而增大,Ea值呈先減小后增大再減小的趨勢(shì),說(shuō)明隨著壓力的增大,溫度對(duì)SOD失活速率常數(shù)的影響先減小后增大再降低。SOD反應(yīng)活化能Ea總體呈現(xiàn)減小的趨勢(shì),說(shuō)明隨著壓力的增大,溫度對(duì)SOD失活速率常數(shù)的總體影響在減弱,但結(jié)合表2可知隨著壓力的增大,其對(duì)SOD失活速率常數(shù)的影響增加。高壓結(jié)合熱處理對(duì)食物中SOD影響情況的研究幾乎沒(méi)有報(bào)道,學(xué)者對(duì)其他酶的研究如王韌等人關(guān)于大豆脂肪氧合酶超高壓失活及Katsaros等人對(duì)獼猴桃汁中蛋白水解酶高壓結(jié)合熱處理進(jìn)行研究中的Ea值要比本實(shí)驗(yàn)的大,而Ludikhuyze等關(guān)于高壓結(jié)合熱處理I型大豆脂肪氧合酶的部分Ea比本實(shí)驗(yàn)的低,說(shuō)明不同的酶,不同的體系對(duì)酶的超高壓失活動(dòng)力學(xué)影響不同,本研究中Ea值的變化趨勢(shì)與他們的研究基本一致。

表3　不同壓力條件下超氧化物

3　結(jié)論

在一定的處理溫度下(20 ℃≤T≤60 ℃),SOD的失活速率常數(shù)隨處理壓力增加而增加。各實(shí)驗(yàn)溫度條件下的反應(yīng)活化體積Va都是負(fù)值,說(shuō)明隨壓力的增加SOD失活速率常數(shù)在增大;40 ℃及60 ℃時(shí)SOD超高壓失活速率常數(shù)受壓力的影響最弱。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)壓力范圍內(nèi)(400～750 Mpa),反應(yīng)活化能Ea值總體呈減小趨勢(shì),說(shuō)明溫度對(duì)SOD失活速率常數(shù)的影響隨著壓力的增加而減弱。

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Study on the ultrahigh pressure inactivation kinetics of pork superoxide dismutase

SUN Juan,HUANG Ye-chuan*,LI Ting-ting

(College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

The superoxide dismutase(SOD)activity of pork under different pressure(400～750 MPa)combined with different tempreture(20～60 ℃)were determined. and the ultrahigh-pressure inactivation kinetics of SOD was researched in the further study. The results showed that at a constant temperature(20 ℃≤T≤60 ℃),the deactivation constants of SOD in the pork was increased with the increasing of pressure. The reaction activation volumeVawas negative in the various temperature conditions,which showed that the inactivation constants of SOD increased with the increasing of pressure. The absolute value of SOD reaction activation volume was minimum at 40 ℃ and 60 ℃,which showed that the pressure had the minimal effect on ultrahigh-pressure inactivation of SOD,and SOD had a high pressure stability in these temperature conditions. Throughout the test pressure range(400 Mpa≤P≤750 Mpa),the activation energyEavalues were decreased generally,which indicated that the influence of temperature on SOD inactivation constants were weakening with the increasing of pressure.

ultrahigh pressure;superoxide dismutase;pork;inactivation;kinetics

2015-05-15

孫娟(1988-),女,在讀碩士,研究方向?yàn)榛瘜W(xué)工程,E-mail:631160547@qq.com。

黃業(yè)傳(1975-),男,副教授,研究方向:肉制品加工與酶工程,E-mail:hyc2005@sina.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31271892);西南科技大學(xué)博士基金(12zx7110)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000