李　瑩,高　晨,賀進(jìn)田

(河北師范大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,河北石家莊 050024)

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培養(yǎng)基優(yōu)化對兩種乳鏈菌肽效價(jià)測定方法的影響

李瑩,高晨,賀進(jìn)田*

(河北師范大學(xué),生命科學(xué)學(xué)院,河北石家莊 050024)

為了提高瓊脂擴(kuò)散法和分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià)的效率,對檢驗(yàn)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,考察使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對這兩種測定乳鏈菌肽效價(jià)方法的影響。以測定結(jié)果的相對誤差與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為衡量指標(biāo),判斷使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基是否有利于以上兩種檢測方法測定乳鏈菌肽效價(jià)的準(zhǔn)確度與精密度的提高。結(jié)果表明:培養(yǎng)基優(yōu)化后,分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià)的準(zhǔn)確度和精密度得到了提高;瓊脂擴(kuò)散法使用優(yōu)化培養(yǎng)基測定乳鏈菌肽效價(jià)的結(jié)果相對誤差較大,且在乳鏈菌肽濃度較低時(shí)無法形成抑菌圈,而使用基本培養(yǎng)基時(shí),瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)的靈敏度高且相對偏差小,測定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高,故利用瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)時(shí)應(yīng)選用基本培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基優(yōu)化,乳鏈菌肽,效價(jià)測定

乳鏈菌肽(nisin)是從乳酸乳球菌的代謝產(chǎn)物中提取得到的一種多肽物質(zhì),由34個(gè)氨基酸組成[1],能顯著抑制革蘭氏陽性菌的增長[2],可用于乳和乳制品、肉和肉制品的防腐保鮮[3],是一種公認(rèn)的安全無毒的天然生物性食品防腐劑和抗菌劑,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),目前已有60多個(gè)國家批注允許使用[4]。

目前已報(bào)道的乳鏈菌肽效價(jià)檢測方法主要有瓊脂擴(kuò)散法[5]、分光光度法[6]、ATP熒光法[7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8]等。其中瓊脂擴(kuò)散法和分光光度法簡便易行,最為常用[9-10]。利用瓊脂擴(kuò)散法對乳鏈菌肽進(jìn)行定量測定是由英國Aplin & Barrett公司的Tramer J & Fowler GG[11]首次發(fā)表于Sci Food Agric雜志,該方法成為國際公認(rèn)的乳鏈菌肽效價(jià)檢測法[12],但利用該方法測定乳鏈菌肽效價(jià)時(shí)間較長,一般需要培養(yǎng)20 h以上才能觀察到清晰的抑菌圈,不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要[13];利用分光光度法檢測乳鏈菌肽效價(jià)檢測時(shí)間較短,操作簡便,但測定結(jié)果的準(zhǔn)確度仍有待提高[14]。這些方法都是以藤黃微球菌作為指示菌,目前普遍使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基對其進(jìn)行培養(yǎng)[15](以下稱為基本培養(yǎng)基),使用該培養(yǎng)基制備指示菌菌懸液一般需要20 h以上,大大延長了效價(jià)時(shí)間,故首先對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,并將優(yōu)化后的培養(yǎng)基作為效價(jià)檢測培養(yǎng)基,考察其對以上兩種測定乳鏈菌肽效價(jià)方法的影響,希望通過對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化使目前常用的這兩種乳鏈菌肽效價(jià)測定方法得到改進(jìn),在縮短檢測時(shí)間的同時(shí)提高其效價(jià)檢測的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度。其中,根據(jù)乳鏈菌肽效價(jià)檢測的測定值與真值的差距計(jì)算相對誤差,以表征測定結(jié)果的準(zhǔn)確度;根據(jù)計(jì)算各測定值間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)測定結(jié)果的精密度;同時(shí)觀測了低乳鏈菌肽濃度下的效價(jià)測定結(jié)果,判斷使用優(yōu)化培養(yǎng)基是否有利于乳鏈菌肽效價(jià)測定靈敏度的提高。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種藤黃微球菌(Micrococcusluteus)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,CICC編號(hào):10269。

1.1.2試劑和培養(yǎng)基乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、NaCl、葡萄糖、酵母浸粉、K2HPO4、Tween 20、瓊脂、HCl均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

基本培養(yǎng)基:蛋白胨0.5%,牛肉膏0.3%,NaCl 0.5%,固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂,121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器BioPhotometer plus核酸蛋白檢測儀Eppendorf 公司;SKY-211B型大容量恒量培養(yǎng)搖床上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Mettler Toledo AL104電子分析天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;標(biāo)準(zhǔn)游標(biāo)卡尺601-02-150×0.02哈爾濱量具刃具基團(tuán)有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基配方由于藤黃微球菌在基本培養(yǎng)基中生長緩慢,故使用正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化。在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,選取葡萄糖、K2HPO4和MgSO4作為實(shí)驗(yàn)因素,按L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),各成分的分析水平見表1。按1%的接種量向各培養(yǎng)基中分別接種藤黃微球菌,30 ℃,120 r/min搖床培養(yǎng),每隔半小時(shí)取菌液測定其在600 nm處的吸光度值,以吸光度值結(jié)果確定培養(yǎng)基優(yōu)化方案。

表1　培養(yǎng)基優(yōu)化正交設(shè)計(jì)因素與水平Table 1　Optimization of medium composition based on orthogonal design

1.2.2藤黃微球菌生長曲線測定在無菌條件下,將已活化的藤黃微球菌菌液按1%的接種比例分別接種于基本培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中,放入搖床培養(yǎng)(轉(zhuǎn)速120 r/min,溫度30 ℃),每隔半小時(shí)取樣測定其在波長600 nm條件下的OD值,以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.2.3分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià)取OD600約為1.5的菌液按1%的接種量分別加入到基本培養(yǎng)基和優(yōu)化后的培養(yǎng)基中,加入乳鏈菌肽母液,使每個(gè)試管中的乳鏈菌肽分別為0、10、20、30、40、50 U/mL,另取一支試管加入處理后的發(fā)酵液樣品,搖床培養(yǎng),30 ℃,120 r/min,6 h后測量每個(gè)樣品中的OD值。分析數(shù)據(jù),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)分別向30 mL的基本固體培養(yǎng)基和優(yōu)化后的固體培養(yǎng)基中各加入300 μL OD600為0.5(濃度約為1.76×107CFU/mL)的菌液,培養(yǎng)基溫度約為45 ℃,震蕩混勻倒平板待凝固后用內(nèi)徑為3.5 mm的打孔器打出若干大小一致的孔洞,依次加入不同濃度梯度的乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液,其中乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度分別為1、5、10、30、50、70、100、200、300 U/mL,置于4 ℃冰箱中預(yù)擴(kuò)散若干小時(shí),待加入樣品充分?jǐn)U散后置于恒溫箱靜置培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為30 ℃,24 h后取出,用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量抑菌圈直徑,分析數(shù)據(jù),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算分光光度法:向液體效價(jià)培養(yǎng)基中加入乳鏈菌肽母液,使乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別為15 U/mL和45 U/mL,每個(gè)梯度重復(fù)做三個(gè),計(jì)算相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

瓊脂擴(kuò)散法:配制10 U/mL和100 U/mL的乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)液,打孔加樣,每個(gè)梯度均做三個(gè),培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑,計(jì)算相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測定結(jié)果采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)處理。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化對藤黃微球菌生長速度的影響

2.1.1正交設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)結(jié)果正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示,影響藤黃微球菌生長的主次順序?yàn)镽A>RB>RC,即葡萄糖的添加量對藤黃微球菌的生長影響最為顯著,其次為K2HPO4,MgSO4的影響相對較小。培養(yǎng)基的最佳組合為A3B2C3,即葡萄糖0.5%、K2HPO40.2%,MgSO4·7H2O 0.03%。

表3　基本培養(yǎng)基中測定乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with basic medium

表4　優(yōu)化培養(yǎng)基中測定乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with optimized medium

表2　培養(yǎng)基優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　The result of orthogonal design

2.1.2藤黃微球菌的生長曲線藤黃微球菌在基本培養(yǎng)基與優(yōu)化后的培養(yǎng)基中的生長情況如圖1所示,藤黃微球菌在基本培養(yǎng)基中生長緩慢,5.5 h后達(dá)到最大OD值僅為1.3左右。在這種情況下,使用藤黃微球菌作為指示菌測定乳鏈菌肽的效價(jià),不僅耗時(shí)長,且初步實(shí)驗(yàn)表明以其作為指示菌測定乳鏈菌肽效價(jià)準(zhǔn)確度較差。使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對藤黃微球菌進(jìn)行培養(yǎng)約4 h OD值即能達(dá)到1.5左右,且大大增加了指示菌的生長量,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基作為檢測乳鏈菌肽效價(jià)培養(yǎng)基對其測定結(jié)果的影響。

圖1　培養(yǎng)基優(yōu)化前后藤黃微球菌生長曲線對比Fig.1　The growth curve of Micrococcus luteus

圖2　基本培養(yǎng)基測定的乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of nisin with basic medium

2.2分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用基本培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基建立分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖2、圖3所示。與基本培養(yǎng)基相比,培養(yǎng)基優(yōu)化后建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系有了明顯提高,R2由0.933提高到0.978。分析這兩種培養(yǎng)基用于乳鏈菌肽效價(jià)檢測的相對誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表3、表4。培養(yǎng)基優(yōu)化后,測定乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差明顯低于基本培養(yǎng)基,當(dāng)乳鏈菌肽濃度較高時(shí),測定結(jié)果的相對誤差由14.04%降低到了5.67%,即測定結(jié)果的準(zhǔn)確度更高;優(yōu)化培養(yǎng)基測得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯比基本培養(yǎng)基小,當(dāng)乳鏈菌肽濃度較低時(shí),測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差由14.29%降低到了2.10%,即測定結(jié)果的精確度更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用分光光度法測定乳鏈菌肽效價(jià),優(yōu)化培養(yǎng)基有利于測定準(zhǔn)確度和精確度的提高。

圖3　優(yōu)化培養(yǎng)基測定的乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of nisin with optimized medium

2.3瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別使用基本培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基,利用瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià),結(jié)果如圖4、圖5所示(1～9號(hào)孔乳鏈菌肽標(biāo)準(zhǔn)品加入順序?yàn)?、5、10、30、50、70、100、200、300 U/mL。乳鏈菌肽濃度相同時(shí),優(yōu)化培養(yǎng)基上抑菌圈明顯比基本培養(yǎng)基小,且1、2、3號(hào)孔均未出現(xiàn)抑菌圈,表明用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行乳鏈菌肽效價(jià)測定的靈敏度較低;根據(jù)抑菌圈直徑建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(優(yōu)化培養(yǎng)基中前三個(gè)孔未出現(xiàn)抑菌圈,故舍去),結(jié)果如圖6、圖7所示,優(yōu)化培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系(R2為0.94)明顯低于基本培養(yǎng)基(R2為0.99)。分析這兩種培養(yǎng)基用于乳鏈菌肽效價(jià)檢測的相對誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表5、表6。乳鏈菌肽濃度相同時(shí),優(yōu)化培養(yǎng)基測得的乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差比基本培養(yǎng)基的大,表明優(yōu)化后培養(yǎng)基用于測定乳鏈菌肽效價(jià)的準(zhǔn)確度較低;二者測定乳鏈菌肽效價(jià)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差總體較小,優(yōu)化培養(yǎng)基略高于基本培養(yǎng)基,表明瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)的精確度較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)時(shí),優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行乳鏈菌肽的效價(jià)測定的靈敏度與準(zhǔn)確度均低于基本培養(yǎng)基。

表5　基本培養(yǎng)基中乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with basic medium

表6　優(yōu)化培養(yǎng)基中乳鏈菌肽效價(jià)的相對誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 6　The relative error and relative standard deviation of determining nisin with optimized medium

圖4　基本培養(yǎng)基效價(jià)圖Fig.4　Determination of nisin with basic medium

圖5　優(yōu)化培養(yǎng)基效價(jià)圖Fig.5　Etermination of nisin with optimized medium

圖6　基本培養(yǎng)基測定乳鏈菌肽效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of nisin with basic medium

圖7　優(yōu)化培養(yǎng)基測定乳鏈菌肽效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7　Standard curve of nisin with optimized medium

3　結(jié)論與討論

作為一種安全高效的天然食品抑菌劑,乳鏈菌肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛[16]。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽的過程中,快速、準(zhǔn)確地測定乳鏈菌肽效價(jià)至關(guān)重要。但是,指示菌藤黃微球菌在效價(jià)測定基本培養(yǎng)基中生長速度非常緩慢,因而,首先根據(jù)L9(34)正交設(shè)計(jì)表對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,以促進(jìn)指示菌的生長。發(fā)現(xiàn)在基本培養(yǎng)基中添加葡萄糖、K2HPO4和MgSO4·7H2O可顯著促進(jìn)藤黃微球菌的生長。其中,葡萄糖作為主要的碳源對指示菌生長的促進(jìn)作用最為顯著,K2HPO4為主要的磷源作用次之,MgSO4·7H2O對指示菌生長的影響相對較小。培養(yǎng)基優(yōu)化后,藤黃微球菌的生長速度大幅度提高,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)而研究了優(yōu)化培養(yǎng)基對分光光度法和瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)的影響。

分光光度法使用優(yōu)化培養(yǎng)基測定乳鏈菌肽效價(jià),與使用基本培養(yǎng)基相比,測定結(jié)果的相對誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均明顯降低,表明培養(yǎng)基優(yōu)化后檢測乳鏈菌肽效價(jià)準(zhǔn)確度和精確度得到了提高。并且,指示菌生長速度加快可以大大縮短了檢測所用時(shí)間。瓊脂擴(kuò)散法使用優(yōu)化培養(yǎng)基測定乳鏈菌肽效價(jià)的結(jié)果并不理想,測定結(jié)果的相對誤差較大,且在乳鏈菌肽濃度較低時(shí)無法形成抑菌圈,其原因可能是指示菌生長速度過快,不利于抑菌圈的形成,而使用基本培養(yǎng)基時(shí),瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)的靈敏度高且相對偏差小,測定結(jié)果的準(zhǔn)確度較高,故優(yōu)化培養(yǎng)基并不適用于瓊脂擴(kuò)散法測定乳鏈菌肽效價(jià)。

因此,在乳鏈菌肽發(fā)酵生產(chǎn)過程中,可使用優(yōu)化培養(yǎng)基利用分光光度法快速、準(zhǔn)確地測定乳鏈菌肽效價(jià)單位,以便完成后續(xù)生產(chǎn)工作,乳鏈菌肽生產(chǎn)完成后可采用瓊脂擴(kuò)散法使用基本培養(yǎng)基測定效價(jià)單位,其測定結(jié)果準(zhǔn)確度較高,不足之處是測定時(shí)間較長。

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Effect of culture medium optimization on two methods of nisin detection

LI Ying,GAO Chen,HE Jin-tian*

(College of Life Science,Hebei Normal University,Shijiazhuang 050024,China)

To improve efficiency of the agar diffusion method and spectrophotometry for nisin detection,the culture medium was optimized. The influence of the optimized medium on two methods of nisin detection was further investigated. The relative error and relative standard deviation was used to evaluate whether the precision and sensitivity of nisin quantification were enhanced after medium optimization. The results showed that culture medium optimization improved the precision and accuracy of nisin quantification by using spectrophotometry. On the contrary,in determining nisin concentration by agar diffusion method,the basic medium obtained the higher sensitivity and smaller relative error compared with the optimized culture medium. In addition,it was difficult to form a clear bacteriostatic circle at the low concentration of nisin with the optimized culture medium. Therefore,basic culture medium was a suitable choice when the agar diffusion method was used to determine nisin concentration.

culture medium optimization;nisin;Titer

2016-01-27

李瑩(1992-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)及天然產(chǎn)物的研發(fā)，E-mail：LY5148739299@163.com。

賀進(jìn)田(1968-)，男，博士，副教授，主要從事多肽和蛋白質(zhì)藥物新型制劑的研發(fā)工作，E-mail：he_jintian@sina.com。

TS202

A

1002-0306(2016)15-0320-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.054