高　琳,陳萬義,徐　煜,劉振民,游春蘋,*

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;2.上海海洋大學(xué),上海201306)

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食品中熒光假單胞菌雙重PCR法檢測體系的建立和評價

高琳1,2,陳萬義1,徐煜1,劉振民1,游春蘋1,*

(1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心,光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院,上海 200436;2.上海海洋大學(xué),上海201306)

根據(jù)熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)促旋酶(gyrase)的B亞單位基因以及金屬蛋白酶(apr)基因設(shè)計出兩對引物,經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了用于熒光假單胞菌快速檢測的雙重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法,并對該體系進(jìn)行評價。結(jié)果顯示,Pseudomonasfluorescens菌株經(jīng)普通PCR擴(kuò)增均可見2條特異性條帶(384 bp和194 bp),而其它陰性對照菌株P(guān)CR擴(kuò)增均為陰性?；诨蚪MDNA的雙重PCR檢測靈敏度為16.9 fg/μL(3～4拷貝/μL),1.8 CFU/mL 的UHT牛奶樣品(250 mL)經(jīng)增菌24 h后用該雙重PCR方法均可檢出。本研究建立的雙重PCR檢測方法具有良好的特異性和靈敏度,能克服乳制品樣品基質(zhì)的干擾,可應(yīng)用于乳制品中熒光假單胞菌的快速檢測。

熒光假單胞菌,gyrB基因,apr基因,雙重PCR,食品檢測

熒光假單胞菌(PseudomonasFluorescens)是一種嗜冷菌,隸屬于假單胞菌科的假單胞菌屬(Pseudomonas),菌體細(xì)胞為直的短桿狀,大小為(0.7～0.8)×(2.3～2.8)μm,兩端圓形,無菌毛,不產(chǎn)芽孢,革蘭氏染色陰性[1],冷藏的牛奶、高蛋白以及脂類豐富的食品一旦被熒光假單胞菌感染,該菌便會大量繁殖,逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢菌群[2]。熒光假單胞菌能夠分泌耐熱的蛋白酶和脂肪酶,這些酶經(jīng)過高壓滅菌和超高溫瞬時滅菌后依然會有殘留,從而影響牛奶的物理品質(zhì)和感官品質(zhì)[3]。臨床研究表明,熒光假單胞菌自溶后會釋放內(nèi)毒素,內(nèi)毒素中的磷脂成分若污染了血液制品,會導(dǎo)致病人輸血后產(chǎn)生不可逆的休克[4]。隨著冷藏設(shè)備的普及,冷凍食品在人類的飲食構(gòu)成中占據(jù)了極大的比例,嗜冷的熒光假單胞菌對于人類而言便是一種潛在的威脅。目前尚未有關(guān)于熒光假單胞菌導(dǎo)致食品中毒事件的報道,但是隨著人們生活質(zhì)量的提高,食品安全越來越引起人們的重視,如何能夠快速的檢測出食品中的熒光假單胞菌這一難題便被提上食品安全的日程。

目前,國內(nèi)對熒光假單胞菌的檢測鑒定依然以傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法為標(biāo)準(zhǔn),其優(yōu)點(diǎn)是能夠根據(jù)特征顏色反應(yīng)直觀地鑒別出熒光假單胞菌并反應(yīng)出活菌數(shù)[5]。然而檢測時間長,重復(fù)性低,不能滿足快速高通量監(jiān)測食品的要求[6]。2004年Scarpellini[7]等針對16S rRNA基因設(shè)計了引物16SPSEfluF/R,目前常被應(yīng)用于檢測和鑒定熒光假單胞菌。自此,對熒光假單胞菌的檢測進(jìn)入了分子生物學(xué)的領(lǐng)域。2005年Martins等基于apr基因設(shè)計了引物并特異性的檢測出了熒光假單胞菌[8];2009年Irenehanning等利用gyrB基因的特性,檢測出熒光假單胞菌,但沒有對引物作進(jìn)一步評價;2013年Fran?ois Baglinière等針對apr基因從原料乳中檢測出熒光假單胞菌,并且深入研究了熒光假單胞菌堿性金屬蛋白酶的危害機(jī)制[9]。

表1　菌株及PCR檢測結(jié)果Table 1　Strains used in the study to characterize PCR specificity

續(xù)表

注:編號為IQCC的菌株均來自中國檢科院食品安全微生物菌種保藏管理中心,編號為AS的菌株均購自廣東省微生物研究所菌種保藏管理中心,編號為CICC的菌株均購自中國工業(yè)微生物菌種庫,編號為BDPF的皆為本實(shí)驗(yàn)室收藏菌株。

由于假單胞菌屬是一個很大的群體,可以分為5個生物變型[6],龐大的分支及相鄰近的親緣關(guān)系,往往會導(dǎo)致在熒光假單胞菌檢測中出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。多重PCR技術(shù)是PCR技術(shù)的一種[10],它是在一個反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增兩對或者兩對以上目的基因的PCR技術(shù),自1988年Chamberlain提出這一改良概念并應(yīng)用于杜氏營養(yǎng)不良癥基因外顯子缺失的檢測以來[11],已經(jīng)在遺傳病診斷、轉(zhuǎn)基因鑒定、病原體檢測等各個領(lǐng)域成功的得到應(yīng)用[12]。對系統(tǒng)分類較復(fù)雜的熒光假單胞菌來說,常規(guī)的單一PCR檢測方法特異性差,容易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象,檢測結(jié)果上具有一定的局限性。本研究試圖建立針對兩個目的基因的雙重PCR檢測方法,建立并完善熒光假單胞菌的檢測體系,并對體系進(jìn)行評價。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

細(xì)菌菌株研究所用菌株見表1,實(shí)驗(yàn)菌株均為-80 ℃甘油管保存,其中熒光假單胞菌(陽性菌株)43株,假單胞菌屬其他細(xì)菌(陰性菌株)39株。

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)和營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(LA培養(yǎng)基)[13],選擇性增菌液[14];實(shí)驗(yàn)所用特異性引物交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,測序工作由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成;DNA Marker 以及Takara酶等PCR反應(yīng)試劑均自Takara公司。

BIOER TC-25/H 基因擴(kuò)增儀日本BIOER公司;MLS-3750 高壓蒸汽滅菌鍋日本SANYO公司;BIO-RAD 凝膠圖像處理系統(tǒng)北京五業(yè)嘉科技有限公司;5424N小型臺式高速離心機(jī)德國Eppendorf公司;制冰機(jī)AF100意大利SCOTSMAM公司;NANODROP 2000C微量分光光度計美國Thermo Fisher Scientific公司;Thermo Scientific超凈工作臺上海輔澤商貿(mào)有限公司;SAYNO恒溫培養(yǎng)箱日本SANYO公司。

表2　引物序列信息Table 2　Information about the primers used in this research

表3　雙重PCR引物濃度配比Table 3　The optimization of primers concentration of duplex PCR

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的活化與培養(yǎng)菌株活化:將凍干管保存的熒光假單胞菌菌株接入NB培養(yǎng)基28 ℃搖床活化,其他非熒光假單胞菌接入NB培養(yǎng)基37 ℃搖床活化?；罨木簞澗€在假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基CM0599,熒光假單胞菌在28 ℃培養(yǎng)過夜,其他假單胞菌屬菌株在37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.2基因組DNA的提取在不同的實(shí)驗(yàn)中,分別采用苯酚-氯仿-異戊醇法或煮沸法提取基因組DNA[15]。

1.2.3引物設(shè)計與合成根據(jù)熒光假單胞菌gyrB基因以及已有文獻(xiàn)報道的以apr為靶點(diǎn)的引物[8],利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0軟件設(shè)計兩對引物[16](表2),引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4PCR反應(yīng)體系和程序建立單重PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1.0 μL,Taq酶1μL,DNA模板2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。經(jīng)過多組重復(fù)實(shí)驗(yàn),本體系選擇的雙重PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)1.0 μL,Taq酶1 μL,DNA模板2 μL,gyrB引物1 μL,apr引物1.6 μL,模板2 μL,加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性處理5 min,94 ℃變性處理30 s,58 ℃退火處理40 s,72 ℃延伸40 s,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

1.2.5雙重PCR體系及條件優(yōu)化雙重PCR反應(yīng)體系和條件優(yōu)化主要通過退火溫度和引物濃度配比(表3)的優(yōu)化來確定[17]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳(100 V,30 min),Gelred染色10 min,用GIS凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果[18]。

1.2.6退火溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參考引物設(shè)計軟件的推薦Tm值,在Tm±5 ℃范圍內(nèi)設(shè)置6個溫度梯度(52～62 ℃),以熒光假單胞菌IQCC12601基因組DNA為模板分別進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)電泳結(jié)果的條帶亮度和寬度以及是否存在非特異性擴(kuò)增,確定最終退火溫度。

1.2.7特異性檢測對表1中所列出的菌株DNA進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,以滅菌蒸餾水為空白對照。如電泳結(jié)果顯示在194 bp和384 bp大小處都出現(xiàn)條帶,則表明檢測結(jié)果為陽性[19]。將陽性條帶割膠回收,送交上海生工生物工程公司測序,并對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線比對,確定擴(kuò)增產(chǎn)物序列是否與設(shè)計目的片段一致。

1.2.8靈敏性評價提取熒光假單胞菌AS1.55基因組DNA[13],使用含100 μg/mL RNaseA的無菌水處理,測定核酸濃度。10倍梯度稀釋至10-10水平,對每個濃度梯度分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以滅菌蒸餾水為空白對照,檢測本體系的引物靈敏度。

1.2.9人工污染食品樣本檢測將活化的熒光假單胞菌(AS1.55)菌液接入LB培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)(28 ℃,150 r/min)至穩(wěn)定期,10倍梯度稀釋,平板計數(shù)。向225 mL選擇性增菌液中接入25 mL UHT殺菌牛奶,分別接入1～10,10～100,100～1000 CFU/mL 三個梯度的菌液,平行三次,于0,4,6,8,10,12,24 h分別取樣一次,然后煮沸法提取基因組DNA[20],分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以滅菌蒸餾水為空白對照。所選食品樣品經(jīng)培養(yǎng)法[13]證實(shí)不含有目的菌。

1.2.10實(shí)際食品樣品檢測采集上海地區(qū)10個分散牧場的97份原料乳樣品,每份原料乳取25 mL,加入到225 mL選擇性增菌液中進(jìn)行搖床培養(yǎng)(28 ℃,150 r/min),增菌時間為24 h。增菌后使用煮沸法提取DNA,每份樣品取5 μL為模板,使用本研究建立的雙重PCR檢測體系檢測。對陽性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測序,確定其與目的結(jié)果一致[13]。選擇性增菌培養(yǎng)24 h后采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測樣品,每份樣品平行3次實(shí)驗(yàn),以防漏檢。與此同時用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法開展對照實(shí)驗(yàn),檢測原料乳中的熒光假單胞菌。

2　結(jié)果與分析

2.1反應(yīng)體系及條件優(yōu)化

調(diào)整引物濃度,選擇能同時擴(kuò)增2條條帶的引物配比,根據(jù)圖1A,得到最優(yōu)的雙重PCR體系。優(yōu)化結(jié)果顯示,最適引物濃度配比為gyrB 0.64 μmol/L,apr0.4 μmol/L。根據(jù)圖1B可以得出最優(yōu)的退火溫度為60 ℃。

圖1　雙重PCR體系優(yōu)化Fig.1　Optimization of duplex PCR注：A:引物濃度 Primers concentration(1～10:同表3);M:標(biāo)準(zhǔn)品；B:退火溫度 annealing temperation(1～12 退火溫度 52、52、54、54、56、56、58、58、60、60、62、62 ℃)M:標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2特異性檢測

本實(shí)驗(yàn)建立的PCR體系檢測實(shí)驗(yàn)菌株(表1),結(jié)果顯示陽性菌株均可擴(kuò)增出預(yù)期的384 bp和194 bp片段,而其它菌株擴(kuò)增為陰性,說明2對引物均具有很好的特異性[13]。將擴(kuò)增產(chǎn)物割膠回收送交杰李生物技術(shù)有限公司測序,對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST在線比對,證實(shí)擴(kuò)增條帶與設(shè)計目的片段一致。

本研究設(shè)計的雙重引物具有穩(wěn)定的種特異性,可準(zhǔn)確區(qū)分熒光假單胞菌與非熒光假單胞菌,特異性檢測結(jié)果良好[7]。

2.3靈敏性檢測

提取Pseudomonasfluorescens(編號AS1.55)基因組DNA[7],使用RNA酶水純化,10倍梯度稀釋至10-10水平,以滅菌蒸餾水為空白對照,對梯度稀釋的DNA進(jìn)行雙重PCR檢測。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)反應(yīng)體系中模板終濃度為1.69 fg/μL時,檢測結(jié)果為陰性。因此本體系檢測靈敏性為16.9 fg/μL。此外,對引物16SPSfluF/R的靈敏度評價顯示(圖3,雙重PCR引物DNA靈敏度水平與其相當(dāng)。

圖2　引物gyr384B與apr194的 PCR檢測純DNA靈敏度檢測電泳圖Fig.2　Detection sensitivity of PCR using primers gyrB384 and apr194 to pure DNA注：M:標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1～9.濃度分別為1.69×109,1.69×108, 1.69×107,1.69×106,1.69×105,1.69×104, 1.69×103,1.69×102,1.69 fg/μL，圖3同。

圖3　引物16SPSEfluF/R的 PCR檢測純DNA靈敏度檢測電泳圖Fig.3　Detection sensitivity of PCR using primer16SPSEfluF/R to pure DNA

2.4人工污染食品樣本檢測

將活化的Pseudomonasfluorescens(菌株編號AS1.867)菌液接入LB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期,平板計數(shù)得初始菌濃度為1.8×109cfu/mL。將25 mL UHT奶樣品用選擇性增菌液稀釋10倍,分別接入濃度為18、1.8、0.18 cfu/mL的熒光假單胞菌1 mL,3次平行實(shí)驗(yàn)。分別于0、4、6、8、10、12、24 h時各取樣1次,用煮沸法提取基因組DNA,分別進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增,以滅菌蒸餾水為空白對照。檢測結(jié)果如表4所示。

表4　模擬污染樣本PCR測試結(jié)果Table 4　PCR test results of artificially contaminated samples

注:增菌24 h后,前兩個濃度的三組平行PCR檢測結(jié)果皆為陽性,說明增菌24 h后可檢測出熒光假單胞菌,濃度為0.18 CFU/mL的實(shí)驗(yàn)組均檢測為陰性,即增菌后無法檢測出Pseudomonasfluorescens。

從表4結(jié)果可知,本研究建立的雙重PCR檢測體系在樣品含菌量低至1.8 CFU/mL時,經(jīng)適當(dāng)時間增菌,可準(zhǔn)確檢測到熒光假單胞菌[7]。

2.5實(shí)際食品樣品檢測

采集97份原料乳樣品,具體檢測結(jié)果如表5所示。擴(kuò)增產(chǎn)物已送交上海杰李公司測序驗(yàn)證。培養(yǎng)法檢測結(jié)果19份原料乳樣品分離出熒光假單胞菌,本研究設(shè)計的引物則檢測出32份陽性結(jié)果。本研究建立的雙重PCR擴(kuò)增體系能夠應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。

表5　食品樣品檢測結(jié)果Table 5　Detective results of the natural food samples

3　結(jié)論與討論

與其他食源性致病微生物相比,PseudomonasFluorescens對正常人不具有致病性,發(fā)病率也不高。但其一旦進(jìn)入人體血液,可導(dǎo)致諸如敗血癥、感染性休克以及血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果。利用PCR方法對PseudomonasFluorescens進(jìn)行檢測,具有靈敏度高,特異性強(qiáng),操作迅速等優(yōu)點(diǎn)。使用單重PCR方法檢測容易出現(xiàn)“假陽性”現(xiàn)象,而且特異性不好,在實(shí)際使用過程中具有一定的局限性,不能推廣使用。多重PCR具有單重PCR所不具有的優(yōu)越性,如消耗時間和試劑少,一次反應(yīng)針對多個目的基因,可以減少假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究針對兩個基因片段建立了特異性更高的雙重PCR方法。

本實(shí)驗(yàn)選擇的2對引物對PseudomonasFluorescens的擴(kuò)增效果均很好,并且兩條條帶均可以通過瓊脂糖凝膠電泳很好的區(qū)分開。PCR反應(yīng)可以在1.5 h內(nèi)完成,與培養(yǎng)法需耗時4 d相比,本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR檢測體系極大的縮短了檢測時間。而且雙重PCR檢測純DNA的靈敏性為16.9 fg/μL,與已有文獻(xiàn)報道的16SPSEfluF/R引物靈敏度相當(dāng)。但引物16SPSEfluF/R的擴(kuò)增片段長達(dá)850 bp,理論上來說長片段的擴(kuò)增效率較低,再考慮上PCR體系中抑制劑的作用,因此,引物16SPSEfluF/R應(yīng)用受到條件的制約[13]。當(dāng)向乳制品中接入濃度為1.8 CFU/mL的熒光假單胞菌后[13],經(jīng)過24 h增菌后便可準(zhǔn)確檢測出。

多重PCR的技術(shù)要領(lǐng)主要包括目的基因片段的選擇,針對基因片段進(jìn)行引物設(shè)計,反應(yīng)體系中各反應(yīng)成分的用量的優(yōu)化,反應(yīng)過程中退火溫度及時間的優(yōu)化,延伸溫度和時間的優(yōu)化。多重PCR的目標(biāo)是多個目的片段的擴(kuò)增,因此目的片段的選擇是核心。目的片段必須具有高度特異性才能保證基因檢測的準(zhǔn)確性,這樣可以避免目的片段之間的競爭性擴(kuò)增,從而確保高效且特異的擴(kuò)增反應(yīng)。此外各個目的片段之間必須有明顯的長度差異以便于識別。本實(shí)驗(yàn)建立的體系經(jīng)過多次優(yōu)化及反復(fù)實(shí)驗(yàn),最終確立了兩組符合要求目的基因片段,特異性的擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶,因此,本研究基于gyrB基因以及apr基因建立的雙重PCR檢測體系可快速、準(zhǔn)確的檢測出熒光假單胞菌,特異性好,靈敏度高,值得在實(shí)際檢測中推廣使用。

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Development and evaluation of duplex pcr assays for detection ofPseudomonasfluorescensin foods

GAO Lin1,2,CHEN Wan-yi1,XU Yu1,LIU Zhen-min1,YOU Chun-ping1，*

(1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology,Shanghai Engineering Research Center of Dairy Biotechnology,Dairy Research Institute,Bright Dairy & Food Co.,Ltd.,Shanghai 200436,China;2.Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Duplex PCR assays were developed for the detection ofPseudomonasfluorescens,based on itsgyrB gene andaprgene. Among all the bacterial strains used in this research,duplex PCR amplified two specific products(384 bp and 194 bp)from the strains ofPseudomonasfluorescens,but not from the negatives. The specifity of our assays was 16.9 fg/μL for pure DNA and 1.8 CFU/mL for UHT milk(250 mL)with 24 h enrichment. So,the methods described in our study can be adopted to detectPseudomonasfluorescensin food samples with higher sensitivity and specificity.

PseudomonasFluorescens;gyrB gene;aprgene;duplex PCR;foods detection

2016-02-22

高琳(1991-),女,在讀碩士研究生,研究方向:食品安全,E-mail:wangyiIrene@163.com。

游春蘋(1982-),女,博士,高級工程師,研究方向:食品生物技術(shù)、分析化學(xué)、食品安全,E-mail:youchunping@brightdairy.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2012BAD12B08);上海市科學(xué)技術(shù)委員會工程中心能力提升項(xiàng)目(16DZ2280600);上海市科委優(yōu)秀技術(shù)帶頭人計劃(15XD1520300)。

TS252.7

A

1002-0306(2016)15-0294-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.048