沈美榮,李云龍,俞月麗,王　敏,*,寇莉萍,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山西太原 030031)

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超聲輔助雙水相體系提取苦蕎籽黃酮

沈美榮1,李云龍2,俞月麗1,王敏1,*,寇莉萍1,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,山西太原 030031)

為提高苦蕎黃酮分離純化效率,本文采用雙水相體系超聲輔助提取苦蕎籽黃酮。本文探討了15種有機(jī)試劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系萃取苦蕎黃酮的能力,并考察了液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度、硫酸銨和丙酮質(zhì)量濃度在丙酮/硫酸銨雙水相體系對(duì)黃酮分配行為的影響,同時(shí)采用響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件。結(jié)果表明:15種有機(jī)試劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系中,丙酮/硫酸銨雙水相體系具有最佳的苦蕎黃酮提取能力;苦蕎黃酮最佳提取條件為:液料比46.65 g/g,超聲溫度 44.75 ℃,硫酸銨質(zhì)量濃度22.86%,在此條件下,黃酮得率可達(dá)20.01±0.26 mg/g;與80%乙醇提取法相比,本法所得黃酮提取物總黃酮含量和蘆丁含量沒(méi)有顯著性差異,但黃酮純度高達(dá)62.35%,純度提高了38.86%;提取物DPPH·和ABTS+·清除率分別提高了22.52%、43.82%。因此,本法是一種更經(jīng)濟(jì)快速的苦蕎黃酮初步提取純化方法,有效提高了黃酮功能性整體研究進(jìn)度。

苦蕎籽,黃酮,雙水相

苦蕎(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn),又名韃靼蕎麥,起源于中國(guó)西南部和喜馬拉雅山,在東北、華北和西北等地區(qū)廣有分布[1],是一種獨(dú)特的藥食兩用糧食作物。大量研究資料表明:苦蕎具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[2-3]。而文獻(xiàn)報(bào)道,苦蕎的保健功能主要?dú)w功于其富含的黃酮類物質(zhì)[4],且黃酮類化合物更是以其廣譜的藥理作用引人矚目。因此,越來(lái)越多的科學(xué)家集中以黃酮為目標(biāo)物質(zhì)研究苦蕎潛在的健康益處,而苦蕎黃酮的提取純化則成為研究者首要解決的問(wèn)題。

目前,苦蕎黃酮的提取方法主要有浸漬提取、微波提取、超聲波提取、酶解法和超臨界流體萃取法,但這些方法存在溶劑消耗大,提取時(shí)間長(zhǎng),或提取溫度高,熱敏成分易失活,能耗大等不足[5],且提取后的黃酮類化合物成分復(fù)雜,需進(jìn)一步分離純化。近年來(lái),雙水相萃取技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)日益受到重視,與常規(guī)提取方法相比較,具有操作條件溫和、提取時(shí)間短、能耗低、被分離物質(zhì)純度高等優(yōu)點(diǎn)[6],已被廣泛應(yīng)用于黃酮類化合物的分離和提純。Liu等人[7]采用乙醇/K2HPO4雙水相體系提取金銀花總黃酮,提取物中總黃酮純度為49.73%,顯著高于70%乙醇提取物(8.86%);Zhang等人[8]采用乙醇/K2HPO4雙水相體系從木豆中提取染料木黃酮和芹黃素,純度比80%乙醇提取分別提高了110%和85%。雙水相萃取技術(shù)在苦蕎黃酮中的應(yīng)用也有報(bào)道,徐春明等人[9-10]采用微波輔助乙醇/硫酸銨雙水相體系分別提取苦蕎麥麩皮和粉中的黃酮類化合物,黃酮得率依次為16.17、13.82 mg/g。但對(duì)于富含淀粉的天然植物有效成分,微波提取很容易使它們變性和糊化,堵塞通道,不利于胞內(nèi)物質(zhì)的釋放[11]。

因此,本研究將實(shí)驗(yàn)室常用集成方式-超聲波提取,與雙水相技術(shù)耦合集成,比較了不同有機(jī)試劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系對(duì)苦蕎籽黃酮的萃取能力,并考察了黃酮在丙酮/硫酸銨雙水相體系萃取的分配規(guī)律,以期得到較高收率和純度的黃酮提取物,為苦蕎進(jìn)一步研究提供更加經(jīng)濟(jì)快速的實(shí)驗(yàn)方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

苦蕎種子(川蕎1號(hào)):2013年購(gòu)于四川涼山彝族自治州,處理后粉碎,全粉過(guò)40目篩,置于4 ℃冰箱中備用;DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)、ABTS(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)、Trolox(6-hydroxyl-2,5,7,8-tetramethylcroman-2-carboxylic acid)Sigma公司;蘆丁、槲皮素(色譜級(jí))上海試劑二廠;甲醇(色譜級(jí))安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?其他均為市售分析純?cè)噭?/p>

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司;JD400-3電子分析天平沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;HC-2516高速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;UV-1800紫外分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;LC20A高效液相色譜儀日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1雙水相體系的選擇雙水相體系按質(zhì)量配制,系統(tǒng)總量為20 g。分別稱取15%(w/w)不同無(wú)機(jī)鹽(K2HPO4,(NH4)2SO4,Na2CO3),33%(w/w)不同有機(jī)溶劑(乙醇、丙酮、正丁醇、異丙醇、乙酸乙酯)與一定質(zhì)量的蒸餾水,于漩渦混合器上混勻,靜置,待溶液分相完全后加入0.5 g苦蕎粉,25 ℃,420 W超聲提取10 min,10000 r/min離心5 min后,分別取樣分析上下相中苦蕎黃酮的含量。有關(guān)的計(jì)算公式如下[8]:

K=Ct/Cb

式(1)

R=Vt/Vb

式(2)

Y1(%)=R×K/(1+R×K)×100

式(3)

Y2=mt/ms

式(4)

注:Ct、Cb為雙水相系統(tǒng)上、下相苦蕎黃酮的濃度(mg/mL);Vt、Vb為雙水相體系上、下相體積(mL);mt為雙水相體系上相黃酮的質(zhì)量(mg);ms為苦蕎粉干物質(zhì)的質(zhì)量(g);K為黃酮在雙水相體系分配系數(shù);R為雙水相體系上下相的體積比;Y1為黃酮在上相中的收率(%);Y2為黃酮在上相中的得率(mg/g)。

1.2.2苦蕎黃酮含量的測(cè)定黃酮含量采用經(jīng)典的Al(NO3)3顯色法[3]測(cè)定。取一定量的樣品提取液與200 μL 5% NaNO2溶液混勻,避光反應(yīng)6 min,然后加入200 μL 10% Al(NO3)3溶液再反應(yīng)6 min,加入2 mL 4% NaOH溶液后再用蒸餾水定容至5 mL,混勻后置于室溫下避光反應(yīng)15 min,510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3丙酮/硫酸銨雙水相體系相圖的繪制丙酮/硫酸銨雙水相體系相圖采用濁點(diǎn)滴定法[8]測(cè)定。精確稱取定量(NH4)2SO4(ms)于錐形瓶中,加入定量去離子水(mw)配制成一定濃度的鹽溶液,然后緩慢滴入丙酮,并不斷振蕩使其充分混合,觀察溶液的澄清程度,直至試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁為止,記錄加入丙酮的質(zhì)量(mi);再次加入一定量去離子水(mw2),溶液澄清;繼續(xù)向試管中加丙酮并不斷混勻,直至再次達(dá)到渾濁,如此反復(fù)操作。計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí),丙酮和(NH4)2SO4在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù),并以丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo),(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制相圖。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)以1.2.1的提取條件為固定反應(yīng)條件,在其他條件相同的情況下,采用不同液料比(20、30、40、50、60 g/g)、超聲時(shí)間(15、20、25、30、35 min)、超聲溫度(25、30、35、40、45 ℃)、硫酸銨質(zhì)量濃度(17%、19%、21%、23%、25%)、丙酮質(zhì)量濃度(19%、23%、27%、31%、35%)進(jìn)行超聲波輔助丙酮/硫酸銨雙水相體系提取實(shí)驗(yàn),以苦蕎黃酮得率和分配系數(shù)為響應(yīng)值,逐個(gè)考察各提取條件對(duì)提取效果的影響。

1.2.5Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以影響苦蕎黃酮得率的主要因素為變量,以黃酮得率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,對(duì)超聲波輔助提取苦蕎黃酮工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平如表1。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels used in response surface analysis

1.2.6HPLC分析蘆丁、槲皮素含量HPLC分析樣品的制備:稱取適量樣品,按照響應(yīng)面所得最優(yōu)工藝提取苦蕎黃酮后,取上相溶液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后用甲醇溶解并定容至10 mL,-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。測(cè)試前用0.45 μm針頭式過(guò)濾器過(guò)濾,液相條件參照Gao[12]等人的方法。

色譜條件:Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),紫外檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:10 μL,流速:0.8 mL/min,流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:超純水(用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.6)。梯度洗脫程序:0 min,15% A;15～25 min,25% A;65 min,75% A;70 min,15% A。

1.2.7苦蕎黃酮對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定參照Guo等人[3]的方法。準(zhǔn)確稱取0.0013 g DPPH,用甲醇定容至25 mL,配制成DPPH溶液。取1 mL稀釋樣品液與1 mL DPPH溶液混合搖勻,室溫避光反應(yīng)30 min后,于517 nm下測(cè)定吸光值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.6308x-1.9265,R2=0.9993。樣品清除DPPH·的能力以100 g樣品干基中所含Trolox的當(dāng)量毫摩爾數(shù)表示(mmol Trolox eq./g 100 DW)。

1.2.8苦蕎黃酮對(duì)ABTS+·清除能力的測(cè)定參照Sogi等人[13]的方法并加以改動(dòng)。7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8等體積混勻后在室溫下避光放置12 h得ABTS+·溶液,在734 nm下用甲醇將ABTS+·溶液的吸光值調(diào)至0.700(±0.002)得ABTS+·工作液。取200 μL稀釋提取液與3.0 mL ABTS+·工作液迅速混勻后于734 nm處測(cè)定吸光度值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品,得標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.32887x-0.9362,R2=0.9998。樣品的ABTS+·清除能力以100 g樣品干基中所含Trolox的當(dāng)量毫摩爾數(shù)表示(mmol Trolox eq./100 g DW)。

1.2.9數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 7.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。其他數(shù)據(jù)均采用Excel 2007和Spass 18.0分析軟件進(jìn)行比較分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1雙水相體系的選擇

小分子有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽形成雙水相是鹽溶液與有機(jī)溶劑爭(zhēng)奪水分子形成締合水合物的結(jié)果。苦蕎黃酮在小分子有機(jī)試劑/無(wú)機(jī)鹽雙水相體系中的分配情況如表2所示。如表可知,苦蕎黃酮被富集于雙水相體系的上相,其在15種雙水相體系均有較大的收率,而不同體系上相黃酮的得率則有較大差別,其中以丙酮/硫酸銨體系提取效果最佳,得率高達(dá)19.58 mg/g。在15種不同的體系中,固定無(wú)機(jī)鹽種類,對(duì)于有機(jī)試劑在雙水相體系中萃取黃酮的能力由表可知,丙酮具有最強(qiáng)的萃取效果,其次為異丙醇,乙酸乙酯最弱;而無(wú)機(jī)鹽在體系中的黃酮萃取能力依次為(NH4)2SO4>K2HPO4>Na2CO3。綜合考慮,選擇丙酮/硫酸銨雙水相體系,以苦蕎黃酮在體系上相的得率作為主要指標(biāo)進(jìn)一步研究。

表2　雙水相體系的選擇Table 2　The selection of aqueous two-phase system

2.2丙酮/硫酸銨雙水相相圖分析

雙水相形成的條件和定量關(guān)系可用相圖來(lái)表示,它是研究雙水相萃取的基礎(chǔ)。丙酮/硫酸銨雙水相體系測(cè)得的相圖如圖1所示,結(jié)果與Bensch等人[14]的研究結(jié)果一致。如圖所示,雙節(jié)線將相圖劃分為上下兩相,下方為單相區(qū),不分相;上方為兩相區(qū),在兩相區(qū)內(nèi),上相富含丙酮,下相富含(NH4)2SO4。由圖1可知,加入丙酮的量越大,恰好分相時(shí),所需鹽的量就越小;反之,體系中(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,恰好分相時(shí)所需的丙酮體積分?jǐn)?shù)就越低。同時(shí)從該圖也可看出,當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為一定值時(shí),丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須高于上圖所對(duì)應(yīng)的最低值才能保證分相。如,當(dāng)(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%時(shí),丙酮在整個(gè)體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須達(dá)到15%以上才能形成穩(wěn)定的雙水相體系。因此,雙水相萃取的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)從曲線上方的區(qū)域選取,但丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)需相互協(xié)調(diào)。

圖1　丙酮/硫酸銨雙水相體系相圖Fig.1　The binodal curve of the acetone/(NH4)2SO4 ATPS

2.3苦蕎黃酮提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1料液比對(duì)黃酮提取的影響由圖2可知,苦蕎黃酮得率隨液料比的增大而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在液料比為40 g/g處有明顯的峰值,而分配系數(shù)則隨液料比的增大而增大。這是因?yàn)殡p水相體系存在黃酮提取和雙水相萃取兩個(gè)過(guò)程,當(dāng)上相尚未飽和,增加苦蕎粉的量,得率相應(yīng)增加;當(dāng)苦蕎黃酮濃度超過(guò)該雙水相萃取能力時(shí),上相所能容納苦蕎黃酮達(dá)到飽和,多余的苦蕎黃酮轉(zhuǎn)移至下相,導(dǎo)致得率降低;而下相黃酮含量持續(xù)增加,則分配系數(shù)持續(xù)下降。因此,確定液料比以40 g/g為宜。

圖2　液料比對(duì)黃酮得率和分配系數(shù)的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on the yield and partition coefficients of flavonoids

2.3.2超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響由圖3可知,苦蕎黃酮得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高而后降低的趨勢(shì),分配系數(shù)呈先略有降低后升高再降低的趨勢(shì)。在超聲時(shí)間為25 min時(shí),黃酮得率達(dá)到最大值,而分配系數(shù)則在30 min時(shí)達(dá)到最大值。這說(shuō)明延長(zhǎng)提取時(shí)間可使目標(biāo)產(chǎn)物提取更徹底,但超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)卻可能對(duì)樣品中的黃酮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用,不利于黃酮的提取。因此,確定超聲提取時(shí)間以25 min為宜。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率和分配系數(shù)的影響Fig.3　Effect of ultrasonic time on the yield and partition coefficients of flavonoids

2.3.3超聲溫度對(duì)黃酮提取的影響由圖4可知,在超聲提取溫度25～35 ℃的范圍內(nèi),隨著提取溫度的升高,苦蕎黃酮得率和分配系數(shù)也逐漸提高,但超過(guò)35 ℃后,繼續(xù)升高溫度黃酮得率和分配系數(shù)不再提高反而降低。分析其原因可能為,超聲溫度低,黃酮不能完全溶出,而溫度升高,提取液黏度減小,擴(kuò)散系數(shù)增加,促使傳質(zhì)速度加快,萃取更完全,但是隨著溫度繼續(xù)升高,硫酸銨在水中的溶解度增大,上相鹽向下相富集,上相溶液極性改變,不利于黃酮溶出,進(jìn)而導(dǎo)致黃酮得率和分配系數(shù)降低[15]。因此,確定超聲波提取溫度以35 ℃為宜。

圖4　超聲提取溫度對(duì)黃酮得率和分配系數(shù)的影響Fig.4　Effect of ultrasonic temperature on the yield and partition coefficients of flavonoids

2.3.4硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)黃酮提取的影響由圖5可知,在硫酸銨質(zhì)量濃度在17%～21%的范圍內(nèi),隨著硫酸銨質(zhì)量濃度的增大,苦蕎黃酮得率和分配系數(shù)也隨之逐漸提高,但是超過(guò)21%后,繼續(xù)增加硫酸銨質(zhì)量黃酮得率和分配系數(shù)不再提高反而降低。這可能是因?yàn)殡S著硫酸銨質(zhì)量濃度的增大,下相締合水的能力增強(qiáng),上相中的水減小,上相中的丙酮濃度間接增加,苦蕎黃酮更易增溶到上相中,但由于上相體積變小,增溶苦蕎黃酮的量有限,黃酮向下相遷移,故黃酮得率和分配系數(shù)均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)[6]。因此,確定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)以21%為宜。

圖5　硫酸銨質(zhì)量濃度對(duì)黃酮得率和分配系數(shù)的影響Fig.5　Effect of mass concentration of(NH4)2SO4on the yield and partition coefficients of flavonoids

圖6　丙酮質(zhì)量濃度對(duì)黃酮提取量的影響Fig.6　Effect of acetone mass concentration on the yield and partition coefficients of flavonoids

2.3.5丙酮質(zhì)量濃度對(duì)黃酮提取的影響由圖6可知,苦蕎黃酮得率隨丙酮質(zhì)量濃度增大而提高,而分配系數(shù)則呈現(xiàn)先增大后略微降低的趨勢(shì)。這可能是由于隨著丙酮質(zhì)量濃度的增加,黃酮更易增溶至上相,且丙酮爭(zhēng)奪水分子能力增強(qiáng),下相中更多的水分被競(jìng)爭(zhēng)吸附至上相,使上相體積顯著增加,黃酮得率和分配系數(shù)上升,但隨著丙酮質(zhì)量濃度繼續(xù)增加,體系變的不穩(wěn)定,下相有少量晶體析出,黃酮得率不再顯著上升,分配系數(shù)略微下降[6]。因此,考慮成本問(wèn)題,選擇丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)以31%為宜。

2.4響應(yīng)面分析法對(duì)苦蕎黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.4.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以對(duì)超聲波輔助雙水相提取黃酮得率影響顯著的3個(gè)因素—液料比、超聲溫度和硫酸銨質(zhì)量濃度為自變量,黃酮得率Y為響應(yīng)值,按Box-Behnken模型進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3　Experimental design and result for response surface analysis

2.4.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及回歸方程根據(jù)表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,得回歸方程為:Y=18.38+0.78X1+0.62X2+0.71X3+0.26X1X2+0.20X1X3+0.22X2X3-1.39X12+0.55X22-0.80X32。

從表4可以看出,模型在α=0.01水平上回歸顯著,且失擬項(xiàng)的p=0.5122>0.1,失擬不顯著,因此模型選擇正確。Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析中的p值和構(gòu)建模型中變量的系數(shù)可以反映變量對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響程度,p值越小,系數(shù)越大,相應(yīng)變量對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響越大。由表4可知,各因素對(duì)苦蕎黃酮提取率的影響都達(dá)到極顯著水平(p<0.01),且對(duì)黃酮提取率的影響從大到小依次為:料液比>硫酸銨質(zhì)量濃度>超聲溫度。

表4　回歸方程方差分析表Table 4　Variance analysis of regression equation

注:**為差異極顯著(p<0.01),*為差異顯著(p<0.05)。

表5　模型的可信度分析Table 5　Confidence analysis of the regression equation model

由表5可知,相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9905,表明方程擬合較好。綜上說(shuō)明回歸方程給超聲波輔助雙水相提取苦蕎黃酮提供了一個(gè)合適的模型。

2.4.3各因素交互作用對(duì)黃酮得率的響應(yīng)面分析三維響應(yīng)面圖可直觀地反映自變量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。用 Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面的分析,得出兩個(gè)因素的交互作用對(duì)苦蕎黃酮得率的響應(yīng)曲面圖,結(jié)果如圖7所示。

由圖 7a、7c可以看到,超聲波提取溫度分別與液料比和硫酸銨質(zhì)量濃度有著顯著的交互作用,但液料比與硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用不顯著(圖7b)。這一結(jié)果與表3的結(jié)果相一致。因此,得出預(yù)測(cè)分析,確定響應(yīng)面的最優(yōu)條件為:液料比 46.65 g/g,超聲溫度 44.75 ℃,硫酸銨質(zhì)量濃度22.86%,預(yù)測(cè)苦蕎黃酮得率為19.98 mg/g。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃酮得率穩(wěn)定在(20.01±0.26)mg/g,與預(yù)測(cè)值接近,表明響應(yīng)面分析方法的模型擇合適,可以用來(lái)確定最佳萃取實(shí)驗(yàn)條件。

2.5兩種不同提取方法的比較

實(shí)驗(yàn)室對(duì)苦蕎黃酮類化合物的提取常采用乙醇為提取劑。因此,將本法與常規(guī)乙醇超聲輔助提取法進(jìn)行比較研究,本法與超聲輔助乙醇提取法的提取分離條件均為其工藝最優(yōu)條件,其中超聲輔助乙醇提取分離條件[16]為:液料比30 mL/g,乙醇濃度80%,提取溫度60 ℃,超聲時(shí)間30 min。比較結(jié)果如表6所示。

由表6可知,本法所提苦蕎黃酮得率為20.01±0.26 mg/g,高于徐春明等人采用微波輔助乙醇/硫酸銨雙水相提取苦蕎麩皮黃酮的得率(16.17 mg/g)[8],與80%乙醇所提黃酮的得率(19.93±0.30 mg/g)沒(méi)有顯著差異,但與80%乙醇提取法相比,雙水相提取所得黃酮粗提物的純度(62.35%)顯著高于80%乙醇所提粗提物(38.12%),純度提高近38.86%。分析其黃酮組成由表可知,雙水相體系提取蘆丁含量為1423.44±6.77 mg/100 g DW,與80%乙醇提取法所得蘆丁含量(1544.71±2.65 mg/100 g DW)沒(méi)有顯著差異,但其槲皮素含量(146.18±4.19 mg/100 g DW)與80%乙醇提取所得槲皮素含量(11.99±1.24 mg/100 g DW)差異顯著,分析其原因可能為雙水相體系中含有較多的水,從而在提取過(guò)程中導(dǎo)致部分蘆丁降解,槲皮素含量增加[17],這也可能是雙水相黃酮提取物較80%乙醇黃酮提取物抗氧化活性強(qiáng)的原因。

表6　兩種提取方法的比較Table 6　Comparison of two different extraction methods

圖7　各因素對(duì)苦蕎黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface for the effects of cross-interactions among factors on extraction rate of polysaccharides

兩種方法所得黃酮提取物的抗氧化活性如表6所示,由表可知,超聲輔助雙水相提取所得黃酮提取物DPPH·清除能力(10.17±0.23 mmol Trolox eq./100 g DW)和ABTS+·清除能力(84.81±0.34 mmol Trolox eq./100 g DW)均顯著高于80%乙醇所得黃酮提取物。因此,與常規(guī)超聲輔助乙醇提取法相比,超聲輔助雙水相提取法所得黃酮粗提物有較高的純度和抗氧化活性。

3　結(jié)論

采用超聲波輔助丙酮/硫酸銨雙水相體系提取苦蕎籽黃酮,確定最佳工藝參數(shù)為:液料比46.65 g/g,硫酸銨質(zhì)量濃度22.86%,超聲溫度 44.75 ℃,超聲時(shí)間25 min,在此提取條件下黃酮提取率可達(dá)20.01 mg/g,與80%乙醇所提黃酮得率(19.93 mg/g)沒(méi)有顯著性差異。但雙水相體系所得黃酮提取物純度高達(dá)62.35%,遠(yuǎn)高于80%乙醇所得黃酮提取物純度(38.12%),這是由于在雙水相萃取過(guò)程中,黃酮類物質(zhì)往上相富集,而糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)往下相富集,進(jìn)而顯著提高了黃酮粗提物的純度。

因此,超聲輔助雙水相提取法可有效縮短提取時(shí)間、減小有機(jī)試劑使用量、提高提取物純度,與其他常用固液分離方法相比,雙水相提取法可省去1～2個(gè)純化步驟,使整個(gè)分離過(guò)程更經(jīng)濟(jì)快速,在抗氧化等活性物質(zhì)的提取純化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

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Ultrasonic-assisted aqueous two-phase extraction of flavonoids from tartary buckwheat seed

SHEN Mei-rong1,LI Yun-Long2,YU Yue-li1,WANG Min1,*,KOU Li-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Northwest A & F University,Yangling 712100,China;2.Shanxi Academy of Agricultural Science,Taiyuan 030031,China)

The flavonoids of tartary buckwheat seed were extracted in the aqueous two-phase system by ultrasonic cooperation to improve the efficiency of separation and purification. Fifteen different organic solvent/inorganic salt systerms were adapted to extract the flavonoids from tartary buckwheat,and the effects of solid-liquid ratio,ultrasonic time,ultrasonic temperature,mass concentration of ammonium sulfate and acetone on the partitioning behavior of flavonoids were discussed in detail,while the extraction conditions were optimized by response surface methodology(RSM). The results indicated that the acetone/(NH4)2SO4aqueous two-phase system had the best extraction effect. The optimum extraction conditions were as follows:liquid-solid ratio 46.65 g/g,ultrasonic temperature 44.75 ℃,mass concentration of ammonium sulfate 22.86%,the yield of the flavonoid was 20.01±0.26 mg/g at the optimum conditions. Compared with 80% ethanol extraction,there was no significant difference between flavonoid yield and rutin content,but the purity of flavonoids reached 62.35% with an increase of 38.86%,while the DPPH· and ABTS+· scavenging capacity was increased 22.52% and 43.82%,respectively. Therefore,the technique provide a more economical and quick method to extract flavonoids of tartary buckwheat seed,improve the research progress effectively.

tartary buckwheat seed;flavonoids;aqueous two-phase extraction

2016-01-29

沈美榮(1989-)，女，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)，E-mail：shenmrong0202@163.com。

王敏(1967-)，女，博士，教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與化學(xué)，E-mail：wangmin20050606@163.com。

寇莉萍(1972-)，女，博士，副教授，研究方向：果品蔬菜的儲(chǔ)藏與加工，E-mail：kouliping@nwsuaf.edu.cn。

蕎麥保健機(jī)理及其食品加工利用關(guān)鍵技術(shù)研究;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-08-D-2-2)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)15-0243-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.039