張　珉,孫化鵬,唐效蓉,黃　帆,夏合新,許忠坤

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南長沙 410004;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長沙 410128)

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星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化馬尾松花粉總黃酮提取工藝

張珉1,孫化鵬2,唐效蓉1,黃帆1,夏合新1,許忠坤1

(1.湖南省林業(yè)科學(xué)院,湖南長沙 410004;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長沙 410128)

采用超聲輔助提取法從馬尾松花粉中提取總黃酮,通過單因素實驗考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比以及提取次數(shù)等4個因素對馬尾松花粉總黃酮得率的影響,并采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮提取工藝。結(jié)果表明:馬尾松花粉總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)62.5%,提取時間28.8 min,料液比1∶24,提取次數(shù)3次。在此優(yōu)化條件下,馬尾松花粉總黃酮的實際得率為1.37%,與理論值(1.32%)較為接近,表明采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化馬尾松花粉總黃酮提取工藝的方法可行。

馬尾松花粉,總黃酮,星點設(shè)計-效應(yīng)面法

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)屬松科松屬,是我國南方重要的用材及產(chǎn)脂樹種,在長江以南廣大丘陵和低山地區(qū)均有分布[1-3]。其花粉資源量大,且富含人體必需的多種蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、微量元素等營養(yǎng)成分和酶、黃酮、核酸等活性物質(zhì),是我國傳統(tǒng)食藥兼用的花粉品種[4-5]。其中,黃酮類物質(zhì)是馬尾松花粉中最具藥理效用的成分之一,具有調(diào)節(jié)血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生理功能[6-7],在保健品、藥品、化妝品以及飼料添加劑等方面都有廣闊的應(yīng)用前景[8-9]。

目前對馬尾松花粉的研究主要集中在原粉的藥用價值和保健作用的研究上,對其活性成分尤其是黃酮類物質(zhì)的提取研究則鮮見報道,且相關(guān)研究采取的是正交設(shè)計優(yōu)化提取工藝[10]。與正交設(shè)計相比,星點設(shè)計(central composite design,CCD)可采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合,具有簡便、實驗精度高等優(yōu)點,其結(jié)果可采用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計方法學(xué)于一體的效應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)進行優(yōu)化[11-12]。本研究采用超聲輔助法提取馬尾松花粉總黃酮,并運用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化馬尾松花粉總黃酮的提取工藝,以期為馬尾松花粉藥理活性基礎(chǔ)物質(zhì)的研究及保健產(chǎn)品的開發(fā)提供科技支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

馬尾松花粉湖南省桂陽縣馬尾松種子園;蘆丁對照品(≥98%)南京春秋生物工程有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

KQ-500DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;UV-1800紫外分光光度計日本Shimadzu;AL204-IC電子天平梅特勒-托利多國際股份有限公司;DHG-9146A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確吸取0.1 mg/mL的蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,各加30%乙醇使成5 mL,先加5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,再加10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加4% NaOH溶液4 mL,用蒸餾水稀釋到10 mL,搖勻,放置15 min,以第一管作空白,在吸收波長510 nm處測定吸光度值,以吸光度值為縱坐標(biāo),蘆丁對照品溶液濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[10,13],得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為:y=6.4815x-0.0145,R2=0.9989。

1.2.2樣品總黃酮含量測定及其得率計算馬尾松花粉經(jīng)晾曬后,過70目篩,再過200目篩,置于42 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干至恒重。精密稱取1.0 g馬尾松花粉,在不同條件下進行超聲提取,所得提取液定容于100 mL容量瓶中,然后從中取5 mL溶液按1.2.1所示方法進行操作,將所測樣品吸光度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,求得提取液中的總黃酮濃度,并計算出總黃酮的得率。

得率(%)=樣品溶液總黃酮濃度(mg/mL)×樣品溶液體積(mL)/樣品質(zhì)量(g)×100

1.2.3單因素實驗精密稱取1.0 g馬尾松花粉,利用超聲波輔助乙醇提取法,分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)(15%、30%、45%、60%、75%、90%)、提取時間(10、20、30、40、50 min)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)和提取次數(shù)(1、2、3、4次)對馬尾松花粉總黃酮得率的影響,每組實驗重復(fù)3次,以確定各因素的恰當(dāng)范圍。

1.2.4星點實驗

1.2.4.1星點設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3)3個因素作自變量,利用Design-Expert 8.0 軟件,按星點設(shè)計方法設(shè)定因素水平表,見表1。實驗安排見表2。每組實驗重復(fù)3次。

表1　星點設(shè)計因素與水平Table 1　Factors and levels of the central composite design

1.2.4.2模型擬合用Design-Expert 8.0軟件對結(jié)果進行多元線性回歸和二項式擬合,多元線性擬合模型:Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3,二項式擬合模型:Y=A0+A1X1+A2X2+A3X3+A4X12+A5X22+A6X32+A7X1X2+A8X1X3+A9X2X3。其中Y為效應(yīng)值(馬尾松花粉總黃酮得率),Ai為方程系數(shù),Xi為自變量編碼值。以擬合方程的R和P值作指標(biāo),選擇P和R較佳的方程為模型。

1.2.4.3效應(yīng)面分析以效應(yīng)值為縱坐標(biāo),固定3個自變量之一為中值,其他兩個自變量為橫坐標(biāo),利用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應(yīng)面圖及等高線圖。由圖中的效應(yīng)值選取最佳自變量值范圍,分析得出回歸模型最大值,并用效應(yīng)面法得出的最佳工藝條件提取馬尾松花粉總黃酮,經(jīng)驗證實驗,最終得到優(yōu)化的提取工藝條件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比和提取次數(shù)等因素對馬尾松花粉總黃酮得率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1　乙醇體積分?jǐn)?shù)(a)、提取時間(b)、料液比(c) 和提取次數(shù)(d)對馬尾松花粉總黃酮得率的影響Fig.1　Effects of ethanol concentration(a),extraction time(b), material-liquid ratio(c)and extraction numbers(d)on the extraction rate of flavone

由圖1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,馬尾松花粉總黃酮得率呈先升后降的趨勢,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時,總黃酮得率達(dá)到最高;提取時間在40 min內(nèi),隨著時間的延長,總黃酮得率呈上升趨勢,但當(dāng)提取時間達(dá)到40 min后,再增加提取時間,得率基本無變化;隨著料液比的增加,總黃酮得率呈先升后降的趨勢,當(dāng)料液比為1∶20時,得率達(dá)到最高;提取次數(shù)在1～3次之間,總黃酮得率隨提取次數(shù)的增加而顯著上升,提取次數(shù)超過3次后,得率再無明顯變化。

2.2星點實驗

2.2.1星點設(shè)計實驗結(jié)果由于提取次數(shù)為非連續(xù)性變量,不能進行回歸處理,考慮單因素實驗結(jié)果及生產(chǎn)實際,確定提取次數(shù)為3次。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定星點設(shè)計因素范圍,星點設(shè)計實驗結(jié)果如表2所示。

表2　星點設(shè)計實驗結(jié)果Table 2　Experimental results of central composite design

注:實驗號15～20為重復(fù)實驗,其值為平均值。

2.2.2回歸模型的建立及顯著性檢測以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3)為自變量,馬尾松花粉總黃酮得率為因變量,采用Design-Expert 8.0 軟件進行多元線性回歸和二項式擬合。

所得馬尾松花粉總黃酮得率的線性回歸方程為:

Y=0.41587-7.15439×10-4X1+7.86680×10-3X2+0.013443X3(r=0.5221,p>0.05)

結(jié)果顯示,該模型不能通過檢驗且擬合度不高,預(yù)測性相對較差,故不采用線性模型擬合。

所得馬尾松花粉總黃酮得率的非線性二次方程為:

Y=-6.94369+0.16835X1+0.075293X2+0.15986X3-1.65085×10-4X1X2-1.04605×10-3X1X3+3.54856×10-4X2X3-1.10784×10-3X12-1.27585×10-3X22-2.18228×10-3X32(r=0.9811,p<0.01)

二項式方程的r值高于線性方程,且p<0.01,說明較多元線性模型,二項式模型的擬合度好,預(yù)測可靠性更佳。對上述二項式模型進行顯著性檢驗(見表3),p值大小可判斷各因素對總黃酮得率的影響,結(jié)果顯示乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、料液比(C)三因素對總黃酮得率的影響大小順序為B>C>A;同時,AC、A2、B2的p值均在0.05以下,其中A2、B2對總黃酮得率的影響極顯著,說明具體實驗因子對效應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此,宜采用二項式模型進行擬合。

2.2.3效應(yīng)面分析根據(jù)二項式方程,以效應(yīng)值為縱坐標(biāo),固定3個自變量之一為中值,其他兩個自變量為橫坐標(biāo),應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件繪制三維效應(yīng)面圖,結(jié)果見圖2～圖4。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間 對馬尾松花粉總黃酮得率影響的效應(yīng)面圖Fig.2　Response surface of flavone yield rate as a function of ethanol concentration and extraction time

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比 對馬尾松花粉總黃酮得率影響的效應(yīng)面圖Fig.3　Response surface of flavone yield rate as a function of ethanol concentration and material-liquid ratio

表3　擬合二項式方程方差分析結(jié)果Table 3　Results of variance analysis of quadratic model

注:**表示差異極顯著,p<0.01;*表示差異顯著,p<0.05。

由圖2～圖4可知,馬尾松花粉總黃酮的較佳提取工藝范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%～65%,提取時間25～30 min,料液比1∶20～1∶25。通過軟件分析,得出回歸模型的最大值點,即馬尾松花粉總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)62.5%,提取時間28.8 min,料液比1∶24,提取次數(shù)3次。在此條件下,馬尾松花粉總黃酮的預(yù)測得率為1.32%。

2.2.4最佳工藝條件的驗證依照所得最佳工藝條件提取馬尾松花粉總黃酮,進行五組重復(fù)驗證實驗。結(jié)果表明,馬尾松花粉總黃酮平均得率為1.37%,與擬合方程預(yù)測值1.32%偏差較小。說明應(yīng)用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠,所選工藝條件重復(fù)性好,工藝優(yōu)化條件可行。

3　結(jié)論與討論

本研究采用超聲輔助提取法從馬尾松花粉中提取總黃酮,應(yīng)用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化了馬尾松花粉總黃酮的提取工藝。通過回歸分析和驗證,馬尾松花粉總黃酮最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)62.5%,提取時間28.8 min,料液比1∶24,提取次數(shù)3次。在此條件下,馬尾松花粉總黃酮的實際得率為1.37%,與理論預(yù)測值較為接近,表明采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化馬尾松花粉總黃酮提取工藝的方法準(zhǔn)確可行。

李雪梅等[10]采用乙醇浸提法提取馬尾松花粉總黃酮,并通過正交實驗優(yōu)化提取工藝,在乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、提取時間2.5 h、料液比1∶25、溫度70 ℃的最佳工藝條件下,總黃酮得率為13.52 mg/g。與之相比,本研究所得總黃酮得率1.37%,即13.7 mg/g,得率略高,且提取時間短,更加適用于馬尾松花粉總黃酮的提取。本研究結(jié)果將為馬尾松花粉資源的進一步開發(fā)利用提供參考。

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Optimization of extraction process of flavone from thePinusmassonianapollen by using central composite design-response surface methodology

ZHANG Min1,SUN Hua-peng2,TANG Xiao-rong1,HUANG Fan1,XIA He-xin1,XU Zhong-kun1

(1.Hunan Academy of Forestry,Changsha 410004,China;2.Hunan Agriculture University,Changsha 410128,China)

The ultrasound-assisted extraction of flavone from thePinusmassonianapollen was carried out. The effects of ethanol concentration,extraction time,material-liquid ratio and extraction numbers on the extraction rate of flavone were studied by single factor experiment,and the extraction process of flavone was optimized by the central composite design-response surface methodology. The results showed that,the optimal extraction conditions of flavone from thePinusmassonianapollen were 62.5% of ethanol concentration,28.8 minutes of extraction time,1∶24 of material-liquid ratio and 3 times of extraction number. Under this optimal condition,the actual extraction rate of flavone reached 1.37%,which was close to the theoretic value. It was feasible to optimize the extraction process of flavone from thePinusmassonianapollen by using central composite design-response surface methodology.

Pinusmassonianapollen;flavone;central composite design-response surface methodology

2016-01-12

張珉(1981-),女，博士，助理研究員，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail:zhm9981@126.com。

中央財政林業(yè)科技推廣項目([2003]TK55)；湖南省林業(yè)科學(xué)院青年科研創(chuàng)新基金項目(2013LQJ10)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)15-0230-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.036