郭　磊,劉　辰,李　娜,郭　娟,闞　歡,劉　云

(西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室,云南昆明 650224)

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響應面法優(yōu)化美味牛肝菌蛋白質的酶解工藝

郭磊,劉辰,李娜,郭娟,闞歡,劉云

(西南林業(yè)大學西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點實驗室,云南昆明 650224)

為提高美味牛肝菌的食用價值,在單因素實驗的基礎上,選取酶解時間、酶解溫度和料液比為影響因素,以美味牛肝菌蛋白質的水解度作為響應值,通過三因素三水平的Box-Behnken響應面分析法優(yōu)化美味牛肝菌酶解條件。結果表明,最佳工藝條件為酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶36,在此條件下,蛋白質水解度達到47.37%。水解液富含多種營養(yǎng)物質,可進一步加工為美味牛肝菌調味品。

美味牛肝菌,蛋白質,水解,響應面法

美味牛肝菌(BoletusedulisBull.)屬于擔子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、牛肝菌目(Boletales)、牛肝菌科(Boletaceae)、牛肝菌屬(Boletus)。美味牛肝菌是一個廣布種,分布于日本、歐洲、北美和澳大利亞,我國見于吉林、黑龍江、江蘇、河南、貴州、四川、云南、西藏、湖北、湖南等地區(qū)[1]。目前,認為牛肝菌是一類與櫟和松等樹種根系共生形成外生菌根的真菌類群,迄今為止,除個別種有人工報道在實驗室條件下栽培成功外[2],絕大多數(shù)種類不能通過人工栽培形成子實體[3]。牛肝菌種類以云南為最多,有219種,占總種數(shù)的55.2%[4],其菌肉厚而細軟,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,是人們最喜歡的野生食用菌之一[5]。

20世紀80年代迄今,國內外學者對美味牛肝菌的生物學特性、化學成分、藥理作用及應用進行了大量研究,其藥用價值受到廣泛重視[6]。美味牛肝菌含有蛋白質[7]、脂肪[8]、黃酮類化合物[9],三萜類化合物[10],多糖[11]等多種營養(yǎng)成分,長期食用能增強機體免疫力,具抗腫瘤、抗突變、降血脂、抗病毒等作用。

近年來,隨著人們生活水平的提高和消費觀念的改變,食用菌提取物具有很大的開發(fā)利用價值[12]。國內有研究者應用酶解技術對香菇、蘑菇、茶樹菇等食用菌進行了酶解工藝的研究[13-15],為食用菌的精深加工提供了一定的理論依據。施漢鈺等[16]通過對美味牛肝菌液體發(fā)酵技術的研究,研發(fā)出具有其子實體特點的配制酒的生產工藝。呂紅英[17]通過實驗確定美味牛肝菌菌絲體液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件,利用發(fā)酵液研究出美味牛肝菌液體菌醋。李艷利等[18]以美味牛肝菌和云南特色土雞肉為主要原料,燉制出滋味好、香氣濃、色澤佳的牛肝菌土雞湯。本文采用復合酶法水解美味牛肝菌工藝條件的研究,探索酶解工藝參數(shù)對美味牛肝菌蛋白質水解度的影響,確定最佳工藝條件,為復合酶解法酶解蛋白質工藝的產業(yè)化提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

美味牛肝菌云南易門縣康源菌業(yè)有限公司;風味蛋白酶(2×104U/g),纖維素酶(2×104U/g)南寧龐博生物工程有限公司;甘氨酸,茚三酮顯色劑,無水乙醇,以上均為分析純。

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司;BT224S電子天平,酸度計北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;電子萬用爐北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;UV-2600型紫外分光光度計島津儀器(蘇州)有限公司;高速冷凍離心機SIGMA公司。

1.2實驗方法

1.2.1美味牛肝菌的酶解參照楊文博[19]采用茚三酮法測定蛋白質的水解度,繪制甘氨酸標準曲線,并計算蛋白質的水解度。

水解度(%)=水解液中氨基氮含量/總氮量×100

1.2.2單因素實驗以水解度為指標,采用單因素實驗,探討酶解時間、酶解溫度、料液比、復合酶(纖維素酶和風味蛋白酶)比例、初始pH等因素對云南美味牛肝菌酶解效果的影響。復合酶解的因素設以下水平:固定酶解溫度55 ℃,料液比1∶30(g/mL,下同),復合酶(纖維素酶:風味蛋白酶)比例50∶50(體積比,下同),pH6,考查不同的酶解時間(3、4、5、6、7 h)對水解度的影響;固定酶解時間5 h,料液比1∶30,復合酶比例50∶50,pH6,考查不同的酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)對水解度的影響;固定酶解時間5 h,酶解溫度50 ℃,復合酶比例50∶50,pH6,考查不同的料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)對水解度的影響;固定酶解時間5 h,酶解溫度50 ℃,料液比1∶30,pH6,考查不同的復合酶比例(100∶0、80∶20、50∶50、20∶80、0∶100)對水解度的影響;固定酶解時間5 h,酶解溫度50 ℃,料液比1∶30,復合酶比例50∶50,考查不同的初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對水解度的影響。

1.2.3Box-Benhnken中心組合實驗設計在單因素實驗的基礎上,選擇對酶解效果影響較大的三個因素,每個因素選取三個水平,根據Box-Behnken實驗設計原理,采用3因素3水平的響應曲面分析方法,以水解度為響應值,實驗因素與水平設計見表1。共17個實驗點,其中12個為析因點,5個為中心點。

表1　因素水平表Table 1　Variables and levels in the three-variable/three-level central composite design

1.2.4數(shù)據處理采用F檢驗對實驗數(shù)據進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義,數(shù)據分析軟件采用Design Expert 6.0.5。

2　結果與分析

2.1甘氨酸標準曲線的繪制

在570 nm波長下測定吸光度,以吸光度(A)為縱坐標,甘氨酸標準溶液濃度(C)為橫坐標,得出標準曲線及回歸方程:C=0.0211A-0.0076,R2=0.9996,線性范圍在0～20 μg/mL。

圖1　甘氨酸標準曲線Fig.1　Standard curve of glycine

2.2單因素實驗

2.2.1時間對酶解效果的影響由圖2可知,隨著酶解時間的延長,蛋白質水解度隨酶解時間的增加呈先增大后降低的趨勢,酶解時間在5 h時,水解度達到46.04%。之后隨時間的延長,可酶解蛋白質的濃度差逐漸降低,同時可能還有一些細胞未被破壞,導致水解度降低且變化較小,因此最適酶解時間為5 h。

圖2　時間對蛋白質水解度的影響Fig.2　Effect of hydrolysis time on the DH

2.2.2溫度對酶解效果的影響由圖3可知,酶解溫度40～50 ℃,蛋白質水解度不斷升高,溫度為50 ℃時水解度達到47.28%,50 ℃之后水解度明顯下降。酶解溫度是影響酶促反應的一個重要因素,溫度的升高會加快酶促反應,但溫度超過了酶的最適反應溫度時會降低酶促反應的速率,另外蛋白質可能由于溫度的升高而變性,故最適的酶解溫度是50 ℃。

圖3　溫度對蛋白質水解度的影響Fig.3　Effect of hydrolysis temperature on the DH

2.2.3料液比對酶解效果的影響從圖4可知,蛋白質水解度隨著料液比的增加呈先增大后減小的趨勢,當料液比達到1∶30時,水解度達到最大值43.56%。但隨著料液比的增加,酶解的蛋白質濃度降低導致水解度降低,故最適的料液比為1∶30。

圖4　料液比對蛋白質水解度的影響Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the DH

2.2.4復合酶比例對酶解效果的影響從圖5可知,蛋白質水解度隨著復合酶中風味蛋白酶比例呈先緩慢增大后緩慢減小的趨勢,變化幅度較小,當復合酶比例達到50∶50時,水解度達到最大值47.28%。隨著風味蛋白酶比例的增加,纖維素酶比例的下降,蛋白質不能很好的被溶出導致水解度降低,故最適的復合酶比例為50∶50。

圖5　復合酶比例對蛋白質水解度的影響Fig.5　Effect of composite enzyme ratio on the DH

2.2.5初始pH對酶解效果的影響從圖6可知,蛋白質水解度隨著初始pH的增加呈先緩慢增大后緩慢減小的趨勢,變化幅度較小,當pH達到6時,水解度達到最大值46.04%。隨著初始pH的增加,pH影響了酶的最佳反應條件,導致蛋白質的水解度降低,故最適的初始pH為6。

圖6　初始pH對蛋白質水解度的影響Fig.6　Effect of pH on the DH

從圖2～圖6中可知,復合酶比例及初始pH對蛋白質水解度影響很小,故本研究以影響蛋白質水解度較大的三個因素酶解時間、酶解溫度、料液比為自變量進行響應面分析來優(yōu)化蛋白質的酶解工藝。

2.3酶解的響應面實驗結果及數(shù)據分析

2.3.1響應面實驗方案及結果在單因素實驗結果的基礎上,由Design-Expert 6.0.5統(tǒng)計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,以蛋白質水解度為響應值,以影響蛋白質水解度較大的三個因素酶解時間(A)、酶解溫度(B)、料液比(C)為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設計共包括17個實驗方案,其中12個析因實驗點,5個中心實驗點,用以計算實驗誤差。

表2　Box-Behnken實驗設計及其實驗結果Table 2　Arrangement and results of the three-variable/three-level central composite design

2.3.2回歸方程擬合及方差分析采用Design-Expert 6.0.5統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據進行回歸分析,回歸分析結果見表3,對各因素回歸擬合后,得到回歸方程:

表3　回歸模型及方差分析Table 3　Analysis of variance of regression equation

注:**p<0.01極顯著;*p<0.05為顯著。

Y=45.79+0.57A-0.41B+10.59C+0.063AB-0.25AC-0.43BC-11.14A2-9.39B2-17.68C2

2.3.3響應面圖分析通過上述二次多項回歸方程所做的相應曲面圖見圖7。通過該組動態(tài)圖即可對任何兩因素交互影響酶解效應進行分析與評價,并從中確定最佳因素范圍。

圖7　兩因素的交互作用對多糖得率的響應面圖Fig.7　Response surface plots of variable parameters on the yield of polysaccharides

圖7三個圖分別顯示了料液比,酶解溫度,酶解時間為零水平時,酶解時間和溫度、酶解時間和料液比、酶解溫度與料液比對美味牛肝菌蛋白質水解度的交互影響效應。由圖7可知,水解度隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢,達到某一定值時,曲面稍下降或趨于平緩。

2.3.4驗證實驗對回歸方程求解,即蛋白質水解度達到最大值時的酶解條件為酶解時間5.04 h、酶解溫度49.7 ℃、料液比1∶36 (g/mL),最大水解度達到47.39%,為方便實際操作將實驗條件定為酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶36 (g/mL)。取三等份云南美味牛肝菌干燥粉末進行平行驗證實驗,驗證實驗所得平均水解度為47.37%。結果表明,經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明用響應面法可以有效的優(yōu)化云南美味牛肝菌的酶解工藝。

3　結論

本研究在單因素的基礎上,以蛋白質的水解度為指標,通過三因素三水平的響應面分析法對美味牛肝菌的酶解工藝進行了優(yōu)化,建立了蛋白質水解度的回歸模型,由該模型優(yōu)化的蛋白質酶解條件為酶解時間5 h、酶解溫度50 ℃、料液比1∶36 (g/mL)。在此酶解條件下,蛋白質水解度為47.37%,與模型預測結果接近,進一步驗證了該模型的可靠性。實驗證明,響應面分析法可以有效的優(yōu)化美味牛肝菌的酶解工藝條件,對工業(yè)化生產具有一定的指導意義。

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Optimization of enzymatic hydrolysis conditions ofBoletusedulisproteins by response surface methodology

GUO Lei,LIU Chen,LI Na,GUO Juan,KAN Huan,LIU Yun

(Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

In order to improve the edible value ofBoletusedulis,hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio were studied on the basis of single factor experiment,a central composite design(CCD)involving 17 experiments of three variables(i.e.,hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio)at three levels combined with response surface methodology was employed to attain the highest degree of hydrolysis(DH). When the optimal hydrolysis-time,hydrolysis-temperature and solid-liquid ratio were 5 h,50 ℃,1∶36,respectively. Under these conditions,the degree of hydrolysis was 47.37%. The hydrolysate was rich in many nutrients,and it could be used for condiment.

Boletusedulis;protein;hydrolysis;response surface methodology

2016-02-01

郭磊(1981-)，男，碩士，講師，研究方向：食品資源開發(fā)及利用，E-mail：guoleigift.student@sina.com。

云南省教育廳科學研究基金理工類重點項目(2015Z142)；云南省“卓越工程師教育培養(yǎng)計劃”建設項目(514006110)。

TS255.5

B

1002-0306(2016)15-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.033