黃國文,管天球,趙雨云,陳莫林,劉宏輝

(湖南科技學(xué)院生化系,湖南永州 425199)

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金桂果實多糖提取及其抑菌作用研究

黃國文,管天球,趙雨云,陳莫林,劉宏輝

(湖南科技學(xué)院生化系,湖南永州 425199)

該文以熱水浸提法研究金桂果實多糖的提取條件及其抑菌作用。以料液比、浸提溫度、浸提時間、浸提次數(shù)為影響因素,進行了單因素實驗和正交實驗,研究了金桂果實多糖的最佳提取條件,同時用濾紙圓片法和比濁法研究了果實多糖的抑菌作用。結(jié)果表明,金桂果實多糖提取的最佳條件是料液比為1∶30(g/mL)、浸提溫度為75 ℃、浸提時間為120 min、浸提次數(shù)為2次。在此條件下金桂果實多糖的得率為3.67%。5倍體積乙醇沉淀金桂果實多糖的得率為3.14%。金桂果實多糖對三種菌都有抑制作用,由強到弱的順序是金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌,在處理時間為10～20 h和pH6時的抑菌作用強;對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度為3.2%,對大腸桿菌的最小抑菌濃度為7.5%。

金桂果實,多糖,提取工藝,抑菌作用

桂花(Osmanthusfragranslour)為木犀科植物[1],是一種優(yōu)良的庭院綠化樹種和香花植物,在南嶺以北至秦嶺淮河流域以南的廣大地區(qū)均有栽培[2];根據(jù)開花季節(jié)和花色將桂花分為金桂、銀桂、丹桂和四季桂四類[3]。金桂樹形直立高大,葉大濃綠橢圓形有光澤,一般在9月下旬開花,花色金黃,香氣濃;果實在四月至五月間成熟呈紫藍色,入藥具有化痰止咳、暖胃、生津、平肝等功效[4]。植物多糖是一類重要的天然活性物質(zhì),其最大優(yōu)點是毒副作用小,其藥理活性有很多種,既能作為廣譜免疫促進劑調(diào)節(jié)機體免疫功能,還能在抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等方面發(fā)揮廣泛的藥理作用[5],并具有抗菌作用[6]。植物多糖的提取方法有溶劑浸提法、超濾法、微波輔助提取法等,其中溶劑提取法是國內(nèi)外提取多糖的最常用傳統(tǒng)方法之一,包括水提、酸提和堿提。與酸提和堿提相比,熱水浸提法具有多糖溶出率高,不會破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)和生物活性等優(yōu)點。目前研究表明,以90 ℃熱水為溶劑提取桂花葉多糖的得率為11.35%[7],用90～100 ℃的熱水提取的桂花多糖含有34%[8],用纖維素酶法提取桂花葉多糖的得率為13.21%[9]。桂花多糖具有抗氧化活性[10-11]和體外免疫活性[12],但是目前關(guān)于金桂果實多糖的提取工藝及其抗菌活性報道較少。本文采用熱水浸提法研究金桂果實多糖的最佳提取條件,并研究其對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用,為開發(fā)和利用金桂果實及多糖打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

材料采集于湖南省永州市零陵區(qū)湖南科技學(xué)院內(nèi)的將成熟的金桂果實,將果實在100 ℃殺青后烘干粉碎成粉末。以每10 g粉末加入80 mL無水乙醇于燒杯中,置于40 ℃水浴中保溫脫脂2 h,抽濾后,將濾雜置于70 ℃烘箱中烘干,冷卻,用于多糖提取。3,5-二硝基水楊酸為化學(xué)純,葡萄糖、牛肉浸膏、胰蛋白胨、氯化鈉、瓊脂等為分析純國藥集團;無水乙醇為分析純湖南虹匯試劑有限公司。

HH三用恒溫水箱江蘇國盛實驗儀器廠;DHG-9070AS型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱寧波江南儀器廠;TG16G型離心機上海趙迪生物科技有限公司;H722B可見分光光度計天津市拓普儀器有限公司;AUY120型電子分析天平日本島津。

1.2實驗方法

1.2.1金桂果實多糖提取條件的研究

1.2.1.1提取金桂果實多糖的單因素實驗以水為溶劑提取金桂果實多糖,浸提時間為30 min,浸提溫度為50 ℃,料液比為1∶40(g/mL)為提取一次的條件。當(dāng)變動一因素時,其他因素與上述提取一次的條件一致。變動的因素:料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL),浸提溫度為30、45、60、75、90 ℃,浸提時間為30、60、90、120、150 min,浸提次數(shù)為1、2、3、4、5次來提取和測定多糖含量,確定適合浸提因素。

1.2.1.2正交實驗根據(jù)單因素實驗確定的條件,設(shè)計正交因素水平表(表1),通過L9(34)正交實驗得出最佳浸提條件。

表1　提取金桂果實多糖的正交實驗設(shè)計表Table 1　Orthogonal experiment design of the extraction of polysaccharide of Osmanthus fragrans lour fruit

1.2.2乙醇沉淀多糖準(zhǔn)確稱取5份烘干后的金桂果實粉末各20 g,脫脂后按照最佳提取條件提取果實多糖。在提取液中加入2%的4 mol/L三氯乙酸溶液[13],混勻后靜置4 h,離心取上清。上清液中加入1、3、5、7、9倍體積的無水乙醇,混勻4 ℃放置過夜,4000 r/min離心15 min收集沉淀,沉淀物經(jīng)乙醚洗滌3～4次后放于65 ℃干燥箱中干燥,用稱重法稱量其多糖質(zhì)量,計算其含量。

1.2.3多糖含量測定方法根據(jù)3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定金桂果實中可溶性總糖和還原糖的含量[14],葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.972X+0.0125,R2=0.998,式中Y為吸光度,X為葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL),線性范圍是0.1～1.0 mg/mL。

多糖的含量=可溶性總糖含量-還原性糖含量[15]。

用于金桂果實可溶性總糖含量測定的材料與還原糖含量測定的材料作相同的條件處理后,再測定它們的含量。多糖得率為多糖含量與材料重量的比值百分率,其值表示生物學(xué)重復(fù)樣品三次測定的平均值±SD。

1.2.4菌懸液的制備方法在超凈工作臺中,預(yù)先對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌分別在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上活化(37 ℃培養(yǎng)24 h),用接種環(huán)挑取一個菌落接種到液體培養(yǎng)基中,在37 ℃震蕩培養(yǎng)(200 r/min)24 h。菌液用無菌水稀釋到吸光度為0.6～0.8時,用于抑菌作用實驗。

1.2.5不同濃度的金桂果實多糖對三種菌的抑制作用的測定方法采用濾紙圓片法。將正交實驗優(yōu)化條件下提取的和無水乙醇沉淀量最多條件下制備的金桂果實多糖用蒸餾水溶解,配制成濃度為0.8%、1.6%、3.2%、7.5%、15.0%的溶液。將高壓滅菌后已冷卻至50 ℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中,每皿40～50 mL。待冷卻凝固后,用移液管吸取0.2 mL菌懸液加到培養(yǎng)基上,用涂布棒涂勻菌液并干燥。用無菌鑷子夾取浸泡多糖溶液1 h的圓形濾紙片(直徑6 mm)貼在含菌培養(yǎng)基表面,每個培養(yǎng)皿上放置3個濾紙片,置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,取出測量抑菌圈直徑大小。

1.2.6不同作用時間金桂果實多糖對三種菌抑制作用的測定采用比濁法。在無菌狀態(tài)下,向10 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基里接種菌懸液200 μL,并加入一定濃度的金桂果實多糖。放置于37 ℃搖床里震蕩培養(yǎng)(200 r/min),以培養(yǎng)液作為對照,測定細菌懸液在600 nm下的吸光度(A)。每個菌設(shè)定3個生物學(xué)重復(fù),每培養(yǎng)10 h測定各個重復(fù)樣品3次,求平均值,計算抑菌率,計算公式如下:

抑菌率(%)=菌懸液的吸光度-含有多糖的菌懸液的吸光度/菌懸液的吸光度×100

1.2.7不同pH金桂果實多糖對三種菌抑制作用的測定采用濾紙圓片法。稱取一定量的金桂果實多糖5份,分別加入到用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH配制成pH為2、4、6、8、10的溶液中,混勻。用鑷子取滅菌后圓形濾紙片(直徑6 mm)加入到多糖溶液中浸泡1 h。取出瀝干后貼在含菌培養(yǎng)基表面,每個培養(yǎng)皿上放置3個濾紙片,置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,取出測量抑菌圈直徑大小。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各種實驗數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進行統(tǒng)計、計算和分析。對同一因素各種水平的數(shù)值作折線圖,并添加SD值,以便分析各種條件下數(shù)值變化趨勢。

2　結(jié)果與分析

2.1金桂果實多糖的提取條件

2.1.1料液比對金桂果實多糖得率的影響料液比是多糖浸出的一個重要的影響因素(圖1A),料液比為1∶40(g/mL)時多糖含量最多,1∶40后變化不明顯,可能原因是溶劑的量增加到一定時足以將多糖全部溶解,再增加溶劑的量也較難增加多糖的溶解量。因此選擇1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL)作為料液比優(yōu)化條件。

2.1.2浸提溫度對金桂果實多糖得率的影響浸提溫度對多糖浸出有較大影響(圖1B),90 ℃時多糖得率最高,說明在一定溫度范圍內(nèi),較高的溫度容易使細胞壁疏松或者破碎而使活性多糖溶出,但過高的溫度引起溶劑蒸發(fā)和破壞多糖結(jié)構(gòu),導(dǎo)致多糖增長緩慢,并且高溫增加耗能。因此選擇60、75和90 ℃作為優(yōu)化條件。

2.1.3浸提時間對金桂果實多糖得率的影響材料浸泡時間的長短會影響多糖的浸出效率。浸提時間在150 min時果實多糖得率最大(圖1C),浸泡材料在120 min之前得率增幅較大。說明材料中多糖溶解是一個較慢的過程,達到一定時間溶解的多糖處于飽和狀態(tài),就不能增加多糖的溶解量了,因此選擇90、120、150 min作為考察因素。

2.1.4浸提次數(shù)對金桂果實多糖得率的影響提取次數(shù)對多糖浸出有較大影響(圖1D)。在浸提2次時多糖浸出率較多,此后,隨著浸提次數(shù)的增多,多糖得率的增加不明顯,說明在金桂果實粉末中提取2次時水溶性多糖幾乎全部溶出,考慮到節(jié)約成本方面,因此可以選擇提取次數(shù)為1、2和3作為優(yōu)化影響因素。

圖1　提取條件對對金桂果實多糖得率的影響Fig.1　Effects of extracting conditions on the polysaccharides extracting rate of polysaccharides of Osmanthus fragrans lour fruit注:A、B、C、D分別為料液比、浸提溫度、 浸提時間、浸提次數(shù)對金桂果實多糖得率的影響。

2.1.5正交實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇料液比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)四因素,以正交表為(L9(34))安排實驗,結(jié)果見表2。

表2　金桂果實多糖提取的正交實驗結(jié)果和分析Table 2　L9(34)experimental results and analysis of extracting polysaccharides fruit

由表2對金桂果實多糖的提取條件進行分析,極差R值依次為浸提溫度>浸提時間>浸提次數(shù)>料液比,說明浸提溫度是影響金桂果實多糖提取的主要因素。金桂果實多糖提取的最佳條件是料液比為1∶30 (g/mL)、浸提溫度為75 ℃、浸提時間為120 min、浸提次數(shù)為2次。

2.2驗證結(jié)果

稱取金桂果實粉末20.0 g三份,按照多糖的最佳提取條件提取多糖,分別測定多糖含量,計算多糖得率的平均值為3.67%,說明該最優(yōu)提取條件適用于金桂果實多糖的提取。

2.3乙醇濃度對沉淀金桂果實多糖的影響

以提取多糖的最佳工藝條件提取脫脂后的金桂果實粉末中的多糖,提取液經(jīng)過三氯乙酸脫蛋白后離心,上清液中加入不同體積倍數(shù)的乙醇濃度沉淀多糖,測定乙醇沉淀金桂果實多糖的效率,結(jié)果如圖2所示。在加入5倍上清液體積的乙醇溶液中沉淀的多糖含量較大,5倍上清液以上體積的乙醇濃度沉淀的多糖含量增多不明顯。為節(jié)約實驗成本,選用5倍上清液體積的無水乙醇溶液來沉淀金桂果實多糖,其含量達到果實重量的3.14%。

圖2　乙醇濃度對金桂果實多糖得率的影響Fig.2　Effects of ethanol concentration on extracting rate of polysaccharides of Osmanthus fragrans lour fruit

2.4金桂果實多糖的抑菌作用

2.4.1不同濃度金桂果實多糖對三種菌生長的影響以5倍體積乙醇溶液沉淀多糖提取液得到的粗多糖,用無菌水溶解,配制成濃度為0.8%、1.6%、3.2%、7.5%、15.0%的溶液,檢測其抑菌作用(圖3)。結(jié)果表明,隨著金桂果實多糖濃度的增加,對這三種細菌的抑制作用也逐漸增強。金桂果實多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強,最小抑菌濃度約為3.2%;對枯草芽孢桿菌的抑制作用較強,最小抑菌濃度約為3.2%;對大腸桿菌的抑制作用較弱,最小抑菌濃度約為7.5%。因此,革藍氏陽性的金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌對金桂果實多糖的抑菌作用較敏感,革藍氏陰性的大腸桿菌細菌對金桂果實多糖的抑菌作用有較強的抵抗力。

圖3　不同濃度多糖對三種菌抑制作用Fig.3　Inhibition of different concentrations of polysaccharides of Osmanthus fragrans lour on the three bacteria fruit

2.4.2不同作用時間金桂果實多糖對三種菌生長的影響以15.0%金桂果實多糖加入液體培養(yǎng)基中研究對三種菌的抑制作用。表明,隨著培養(yǎng)時間的增長,金桂果實多糖對三種菌的抑制作用表現(xiàn)出先增強后減弱的趨勢(圖4)。在10 h和 20 h達到了最大的抑菌作用為100%,隨著培養(yǎng)時間的增加,抑制作用逐漸減少。說明,在這三種菌的生長前期金桂果實多糖起抑菌作用,隨著培養(yǎng)時間的增長,多糖對這三種菌的抑制作用被解除[16],所以,抑菌率逐漸減少。

圖4　多糖不同處理時間對三種菌的抑制作用Fig.4　Inhibiton of polysaccharide of incubation times on the three bacteria

2.4.3不同pH金桂果實多糖對三種菌抑制作用的影響分別配制不同pH的15%金桂果實多糖溶液來浸泡濾紙片,測定對三種菌的抑制作用(圖5)。表明,在pH4～8時金桂果實多糖對這三種菌都有抑制作用,并且在pH6時的抑菌作用最強,在pH2和pH10時沒有抑菌作用。

圖5　不同pH多糖對三種菌的抑制作用Fig.5　Inhibition of polysaccharide of different pH on the three bacteria

3　結(jié)論

本文用熱水浸提法研究了金桂果實多糖的提取條件,確定了最佳的提取工藝條件為料液比1∶30(g/mL)、提取溫度75 ℃、提取時間120 min,提取2次;這種工藝條件下金桂果實多糖的得率為3.67%。最佳提取工藝條件下的金桂果實多糖提取液經(jīng)過三氯乙酸脫蛋白以后,用5倍體積的乙醇能夠沉淀3.14%的多糖。這種經(jīng)過乙醚的洗滌和烘箱中干燥過的粗多糖對金黃色葡糖球菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑菌作用,最小抑菌濃度大約為3.2%左右;對大腸桿菌的抑菌作用相對較弱,最小抑菌濃度大約為7.5%左右。金桂果實多糖對這三種菌的抑制作用隨著處理時間的延長先增強后降低,在處理時間為10～20 h時之間抑菌作用強,抑菌率可以達到100%。金桂果實多糖在pH4～8時對這三種菌都有

抑制作用,且在pH6時抑制作用最強,過酸或者過堿時沒有抑制作用。多糖是植物光合作用的產(chǎn)物,可以作為人類的能源物質(zhì)起作用。由于金桂果實多糖具抑菌作用,所以,金桂果實多糖用于食品的防腐保鮮有待于研究。這種研究為進一步開發(fā)和利用金桂果實多糖提供了積極的指導(dǎo)作用。

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Research of extraction process and antimicrobial effect of polysaccharide fromOsmanthusfragranslourfruit

HUANG Guo-wen,GUAN Tian-qiu,ZHAO Yu-yun,CHEN Mo-lin,LIU Hong-hui

(Department of Biological Sciences and Chemical Engineerings,Hunan College of Science and Technology,Yongzhou 425199,China)

Using fruit ofOsmanthusfragranslouras raw materials,water soluble polysaccharides fromOsmanthusfragranslourwere extracted,and its antibacterial effect were studied in this paper. To obtain the extraction process of polysaccharides fromOsmanthusfragranslourfruit ,single factor experiments and orthogonal experiments were done about solid-liquid ratio,extraction temperature,extraction time,extraction times,and meanwhile the purification efficiency of polysaccharides were studied by ethanol precipitation,and the antimicrobial activity of polysaccharide was studied by filter paper discs method and turbidimetric method. The results showed that the optimum extraction conditions of polysaccharides fromOsmanthusfragranslourfruit were as follow:Solid-liquid ratio 1∶30(g/mL),Extraction temperature 75 ℃,Extraction time 120 min,Extraction times 2. in which the extraction rate of polysaccharide fromOsmanthusfragranslourfruit was 3.67%. 5 times the volume of the ethanol of the extract could precipitate polysaccharides ofOsmanthusfragranslourfruit about 3.14%. Polysaccharides ofOsmanthusfragranslourfruit could inhibit the growth ofStaphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Escherichiacoli,and the order of inhibition isStaphylococcusaureus,Bacillussubtilis,Escherichiacoli. Under the incubation time of 10～20 h and pH6 polysaccharides ofOsmanthusfragranslourfruit had a strong inhibition activity on the three bacteria,and the minimum inhibitory concentration of polysaccharides ofOsmanthusfragranslourfruit on the three bacteria were about 3.2%,3.2%,7.5%,respectively.

Osmanthusfragranslourfruit;polysaccharide;extraction process;antimicrobial effect

2016-02-01

黃國文(1965-)，男，博士，講師，從事植物生物學(xué)的教學(xué)和研究工作，E-mail：huanggwdax@163.com。

湖南省科技計劃項目(2014NK2021)；湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室資助項目(XNZW15C19)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)15-0209-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.032