丁　勇,邵明亮,羅倉學(xué),羅曉鴻,劉　琳,陳　思

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

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利用玉米淀粉黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基優(yōu)化

丁勇,邵明亮,羅倉學(xué),羅曉鴻,劉琳,陳思

(陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021)

玉米淀粉黃漿水是生產(chǎn)淀粉過程中排放的高濃度有機廢水,以其作為AcetobacterxylinumDS398的基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵細(xì)菌纖維素。采用Plackett-Burman設(shè)計和Box-Behnken響應(yīng)面分析法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,并對產(chǎn)物進(jìn)行表征。以纖維素干重為響應(yīng)值,從7個相關(guān)影響因素篩選出3個顯著因子:蔗糖、磷酸二氫鉀和乙醇。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面分析法確定以上三因素的最佳濃度。最優(yōu)的玉米淀粉黃漿水培養(yǎng)基組分為:玉米黃漿水稀釋比1∶4,蔗糖3.32 g/100 mL,CaCl20.3 g/100 mL,KH2PO40.12 g/100 mL,MgSO40.05 g/100 mL,檸檬酸0.2 g/100 mL,乙醇1.50 mL/100 mL,細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到1.11 g/100 mL,為優(yōu)化前的1.63倍。結(jié)果表明經(jīng)優(yōu)化后黃漿水培養(yǎng)基能夠滿足Acetobacterxylinum生長代謝的需要,細(xì)菌纖維素產(chǎn)量得到顯著提高;同時傅立葉紅外光譜圖和場發(fā)射掃描電鏡圖顯示產(chǎn)物是純度較高的纖維素,微觀結(jié)構(gòu)與椰果相似。

玉米淀粉黃漿水,細(xì)菌纖維素,Acetobacterxylinum,Plackett-Burman設(shè)計法,Box-Behnken響應(yīng)面分析法

細(xì)菌纖維素(Bacteria Cellulose,簡稱BC)是一類由微生物發(fā)酵合成的纖維素的總稱,屬于一種新型生物材料[1],因具有高持水性、高結(jié)晶度、強吸水性、良好生物適應(yīng)性等特性[2],廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥、造紙、化妝品、膜濾器等領(lǐng)域,經(jīng)濟(jì)和社會效益突出[3]。但是,BC生產(chǎn)行業(yè)面臨的生產(chǎn)原料成本高、產(chǎn)量低的問題逐漸凸顯,這極大地限制BC在各行業(yè)中的應(yīng)用。近年來,一些國內(nèi)外學(xué)者嘗試?yán)靡徊糠謨r格低廉的農(nóng)產(chǎn)品廢棄物進(jìn)行發(fā)酵BC,某種程度上緩解BC生產(chǎn)行業(yè)的壓力,比如:加拿大楓蜜、甜菜糖漿、糖蜜、菊粉、釀酒廢水、玉米棒水解液、橄欖工廠廢渣、葡萄皮浸提液、干酪乳清、粗甘油等[4-10]農(nóng)產(chǎn)品或工業(yè)的廢棄物已被證實可以用作生產(chǎn)BC主要原料。

玉米淀粉黃漿水來自于玉米淀粉加工過程中,是食品工業(yè)中污染最嚴(yán)重的有機廢水之一,排放量大、CODCr和BOD5值高,其主要成分包括糖類、纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、有機酸、酶、維生素等有機物[11]。利用微生物資源化處理是這類廢水處理最綠色、最經(jīng)濟(jì)的途徑,一方面企業(yè)節(jié)省微生物的培養(yǎng)成本,并獲得有價值發(fā)酵產(chǎn)品,另一方面企業(yè)降低廢水中污染物濃度,減少廢水處理的投資。目前,國內(nèi)外研究人員根據(jù)玉米淀粉黃漿水的特點,發(fā)酵生產(chǎn)微生物絮凝劑、單細(xì)胞蛋白、普魯蘭多糖、葡萄糖淀粉酶、酵母等發(fā)酵產(chǎn)品[11-12]。以玉米淀粉廢水發(fā)酵BC報道不多,徐偉等[13]于2012年對BC發(fā)酵條件進(jìn)行正交優(yōu)化,而對影響玉米淀粉廢水發(fā)酵BC補充營養(yǎng)成分未做研究。本實驗以玉米淀粉黃漿水為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過前期的單因素實驗,選取影響B(tài)C產(chǎn)量的稀釋比、蔗糖、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、檸檬酸、乙醇7個因素進(jìn)行Placket-Burman實驗設(shè)計,篩選出三個主效因子進(jìn)行響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化,確定最優(yōu)的玉米淀粉黃漿水培養(yǎng)基的成分,并對產(chǎn)物BC進(jìn)行表征。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

AcetobacterxylinusDS398,由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院發(fā)酵食品實訓(xùn)中心保藏;玉米黃漿水由陜西省興平市永泰生物科技有限責(zé)任公司提供,置于冰柜冷凍備用。

電子天平Sartorious BSA323賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺AIRTECH蘇凈集團(tuán)安泰公司;LRH-500F生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DFD-700電熱恒溫水浴箱天津市泰斯特儀器有限公司;VECTOR-22傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)德國布魯克Bruker公司;S4800場發(fā)射掃描電鏡日本理學(xué)。

1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

種子液培養(yǎng)基(g/L):成分同HS培養(yǎng)基[14]葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,檸檬酸1.15,Na2HPO46.8,初始pH6.0;

種子液制備:從斜面培養(yǎng)基上挑取菌種兩環(huán),接入裝液量100 mL經(jīng)滅菌的種子培養(yǎng)基中,29 ℃,120 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h,在無菌環(huán)境中利用單層脫脂紗布(已滅菌)過濾,收集濾液即為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)條件:裝液量100 mL,初始pH5.0,接種量1%,29 ℃下靜止培養(yǎng)7 d。

1.3BC膜的制備和處理方法

靜置恒溫發(fā)酵7 d后取出BC膜,去離子水沖洗表面,浸泡于濃度為1% NaOH中,煮沸2 h,去除雜質(zhì)(菌體和殘液),直至膜呈乳白色半透明狀,去離子水浸泡30 min,重復(fù)4～5次,直至菌膜pH為中性。BC純化后被置于(105±3) ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重(前后兩次偏差小于0.005 g),分析天平稱重3次,取平均值即為BC干重[15]。

1.4Plackett-Burman設(shè)計實驗

根據(jù)之前單因素實驗,確定稀釋比、蔗糖、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、檸檬酸、乙醇為主要影響因素,以BC干重為評價指標(biāo),因素水平及編碼見表1,數(shù)據(jù)分析及模型建立由Design Expert軟件完成。

表1　Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計 因素水平及編碼表(n=12)Table 1　Level and code of variables chosen for Plackett Burman design(n=12)

1.5響應(yīng)曲面(RSM)實驗設(shè)計

由Plackett-Burman實驗篩選補充營養(yǎng)中影響B(tài)C產(chǎn)量的顯著因素,采用Box-Behnken設(shè)計,對顯著影響因素作進(jìn)一步研究,以期得到玉米黃漿水發(fā)酵BC產(chǎn)量與補充營養(yǎng)成分最優(yōu)工藝。因此將篩選出蔗糖、KH2PO4和乙醇三個因素作為Box-Behnken設(shè)計考察的變量,因素水平見表2,實驗方案見表3。

表2　Box-Behnken實驗因素水平表Table 2　Level of variables chosen for Box-Behnken design

1.6FTIR分析

將熱風(fēng)干燥的樣品剪碎研磨,與KBr混合壓片,質(zhì)量比1∶100,采用FTIR測試樣品在450～4000 cm-1范圍內(nèi)的紅外吸收光譜,掃描次數(shù)32次,分辨率4 cm-1。

1.7SEM觀察

樣品經(jīng)熱風(fēng)干燥,對其干膜噴金后,使用場發(fā)射掃描電鏡S4800對其表面微觀形貌進(jìn)行觀察。

1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用DESIGN EXPERT實驗數(shù)據(jù)處理軟件分析數(shù)據(jù),采用兩水平的Plackett-Burman設(shè)計法對影響產(chǎn)量的7個因素進(jìn)行篩選,p<0.05為顯著因素。選出的顯著因素根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理設(shè)計17組實驗,對實驗值進(jìn)行二次多項式擬合分析得顯著因素和因素間交互作用,優(yōu)化發(fā)酵條件參數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1影響B(tài)C發(fā)酵培養(yǎng)基主要因素的篩選

以稀釋比、蔗糖、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、檸檬酸、乙醇為考察因素,按照Plackett-Burman設(shè)計進(jìn)行12組實驗。Plackett-Burman 實驗主效應(yīng)分析如表3所示(實驗結(jié)果為3次實驗的平均值),利用玉米淀粉黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)BC,影響產(chǎn)量的顯著因素為X2-蔗糖(p=0.0026),X4-磷酸二氫鉀(p=0.0043),X7-乙醇(p=0.0150)。因此選擇這3個因素作為影響菌株玉米淀粉黃漿水代謝生產(chǎn)BC的關(guān)鍵因素,進(jìn)一步研究它們對菌株發(fā)酵代謝的影響,其它4個因素影響未達(dá)到顯著水平,將在下一步的研究中不予考慮。

表3　Plackett-Burman實驗主效應(yīng)分析表Table 3　Analysis of the main effects for the Plackett-Burman design

注:*p<0.05,**p<0.01。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1培養(yǎng)基成分Box-Behnken實驗優(yōu)化按照Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理對影響菌株代謝生產(chǎn)BC的三個關(guān)鍵因素設(shè)計17組實驗,其結(jié)果見表4。利用 Design-Expert 軟件對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式擬合,獲得BC產(chǎn)量(Y)對自變量蔗糖(x1)、磷酸二氫鉀(x2)和乙醇(x3)的多元回歸方程:Y=-1.77+0.91 x1+14.33x2+0.60x3-0.089x1x2-0.11x1x3-0.22x2x3-0.11x12-55.91x22-0.05x32。

表4　Box-Behnken設(shè)計及BC產(chǎn)量的實測值與預(yù)測值Table 4　Box-Behnken design and experimental and predicted value of BC

表5　多元二次方程方差分析表Table 5　ANOVA for the regression model

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗顯示(見表6)模型參數(shù)中x3、x22對BC產(chǎn)量的影響極顯著,x2、x12對BC產(chǎn)量影響顯著,x1與x3之間的交互作用對BC產(chǎn)量的影響顯著,x1和x2、x2和x3之間的交互作用對BC產(chǎn)量的影響不顯著。

分別對回歸方程各變量(x1、x2、x3)求極值,得x1=3.32、x2=0.12、x3=1.50,即蔗糖3.32 g/100 mL、磷酸二氫鉀為0.12 g/100 mL、乙醇1.50 mL/100 mL,預(yù)測BC最大產(chǎn)量為1.08 g/100 mL。為驗證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性和有效性,在最優(yōu)條件下進(jìn)行實驗,實測BC產(chǎn)量為1.11 g/100 mL,與預(yù)測結(jié)果沒有顯著差異,為優(yōu)化前的1.63倍(0.68 g/100 mL)。

2.2.2BC發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面交互作用分析根據(jù)模型方程制作響應(yīng)曲面圖(如圖1所示)。圖1顯示磷酸二氫鉀位于中心水平時,蔗糖和乙醇的交互作用對BC產(chǎn)量的影響。從其等高線圖可以直觀地看出此兩因素的交互作用顯著(p=0.0267)。分析響應(yīng)面三維圖發(fā)現(xiàn),控制乙醇濃度不變時,隨著蔗糖濃度的提高,BC的產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,且蔗糖濃度增加到3.32 g/100 mL時,BC產(chǎn)量最高。當(dāng)蔗糖濃度不變時,隨著乙醇添加量的增加,BC的產(chǎn)量不斷提高,當(dāng)乙醇添加量為1.50 mL/100 mL時,BC產(chǎn)量達(dá)到最大,當(dāng)且蔗糖濃度較高時,乙醇對BC產(chǎn)量影響較大,反之較小?？梢娬崽?.32 g/100 mL和乙醇1.50 mL/100 mL時,BC的產(chǎn)量可以達(dá)到本次實驗的最大值。

表6　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗Table 6　Regression coefficients significances

圖1　蔗糖及乙醇交互影響B(tài)C產(chǎn)量的響應(yīng)曲面圖Fig.1　Response surface polt for the interaction effects of Sucrose and Ethanol on the yield of BC

注:*p<0.05;**p<0.01。

2.3BC的表征

2.3.1FT-IR分析利用玉米淀粉黃漿水和椰汁分別發(fā)酵生產(chǎn)的BC進(jìn)行紅外測試,如圖2所示,玉米淀粉黃漿水所獲得樣品A在3600～3250 cm-1處有比較大的吸收區(qū)域,O-H的伸縮振動吸收峰在3347.16 cm-1,半峰寬達(dá)560 cm-1,表明分子中含有大量氫鍵締合,且可能樣品內(nèi)含少量結(jié)晶水,1428.38 cm-1處的吸收峰代表著O-H彎曲振動峰;2899.07 cm-1處的吸收峰則是由C-H伸縮振動產(chǎn)生,1366.97 cm-1處的吸收譜帶為C-H鍵的彎曲振動產(chǎn)生;1648.35 cm-1處的吸收峰是由纖維素4′端的半縮醛基引起;1161.88 cm-1為C-O-C特征峰;在1018.16～1102.20 cm-1處為纖維素C-O鍵的伸縮振動吸收峰,1062.54 cm-1由組成纖維素單元葡萄糖C6伯醇伸縮振動引起,1102.20 cm-1與1018.16 cm-1可能是由仲醇伸縮振動引起,仲醇峰向右偏離的原因可能是C1和C3之間氫鍵作用;900 cm-1吸收峰處為糖苷鍵的特征峰。以上纖維素特征官能團(tuán)基本與椰汁發(fā)酵生產(chǎn)樣品B大體吻合,表明樣品A是純度較高的纖維素。稍有不同的是在3600～3250 cm-1處有比較大的吸收區(qū)域中,樣品A在3439.42 cm-1和3342.16 cm-1有強峰,而樣品B在3416.32 cm-1有吸收峰,分析其原因可能是樣品A內(nèi)有部分的游離羥基使締合羥基峰位偏移所致。

圖3　BC掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3　SEM images of surface morphology of dried BC

2.3.2SEM分析圖3是玉米淀粉黃漿水發(fā)酵BC及椰汁發(fā)酵BC的微觀形貌,可以看出前者與后者纖維絲粗細(xì)相當(dāng),且顯示微纖維互相雜亂纏繞,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密。這從一方面可以證明利用淀粉黃漿水發(fā)酵生產(chǎn)的BC與椰汁發(fā)酵BC(椰果)具有相似納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

3　結(jié)論

本文以玉米淀粉黃漿水為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用Placket-Burman實驗設(shè)計法對影響AcetobacterxylinumDS398代謝生產(chǎn)BC的7個補充營養(yǎng)因子進(jìn)行評價,獲得三個關(guān)鍵因子(蔗糖、磷酸二氫鉀和乙醇),并利用響應(yīng)面法(RSM)對以上關(guān)鍵因子建立多元回歸模型,模型顯示高度顯著,可用于實際預(yù)測。該模型反映出最優(yōu)的玉米淀粉黃漿水培養(yǎng)基成分為:玉米黃漿水稀釋比1∶4,蔗糖3.32 g/100 mL,CaCl20.3 g/100 mL,KH2PO40.12 g/100 mL,MgSO40.05 g/100 mL,乙醇1.50 mL/100 mL,與原玉米淀粉黃漿水相比,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基使BC產(chǎn)量提高1.63倍,產(chǎn)量可達(dá)1.11 g/100 mL,是梨汁[16]發(fā)酵生產(chǎn)BC產(chǎn)量的1.63倍。

進(jìn)一步對玉米淀粉黃漿水發(fā)酵所得BC進(jìn)行表征,發(fā)酵產(chǎn)物BC純度很高,且三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與市場化多年的椰果相近。由此可見,玉米淀粉黃漿水是一種潛在的BC發(fā)酵原料,其用于發(fā)酵生產(chǎn)BC不僅可以實現(xiàn)玉米淀粉黃漿水資源的再利用,且能夠緩解BC工業(yè)原料不足的行業(yè)問題,因此,黃漿水很有可能成為BC工業(yè)重要廉價的原料之一。

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Optimization of culture media for bacterial cellulose production by fermentation of corn starch wastewater

DING Yong,SHAO Ming-liang,LUO Cang-xue,LUO Xiao-hong,LIU Lin,CHEN Si

(School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi’an,710021,China)

Corn starch wastewater is a kind of high concentration organic wastewater discharged from starch processing. The study focused on producing bacterial cellulose utilized those wastewater,and optimizing medium component via adopting the Plackett-Burman design method and the Box-Behnken response surface analysis. Further,the structure of bacterial cellulose(BC)obtained from fermentation of corn starch wastewater was described by Fourier transform infrared spectrometer(FTIR)and scanning electron microscopy(SEM). Cellulose dry weight was defined as response value,three significant factors,which were sucrose,monopotassium phosphate and ethanol,were selected through the Plackett-Burman experiment,then the respective optimum concentration of those factors was determined by response surface method(RSM). The improved medium composition was as follows:dilution ratio of corn starch wastewater was 1∶4,extra sucrose,CaCl2,KH2PO4,MgSO4,citric acid and ethanol were 3.32 g/100 mL,0.3 g/100 mL,0.12 g/100 mL,0.05 g/100 mL,0.2 g/100 mL,1.50 mL/L,respectively. Eventually,the yield of BC was 1.63 times than that before optimization,and reached 1.11 g/100 mL. The results suggested that the postoptimality medium of wastewater could meet the growth and metabolism ofAcetobacterxylinumDS398,hence the bacterial cellulose production were improved significantly. The micrographs of FTIR and SEM further illustrated that BC produced in medium of corn starch wastewater possesses high purity,and the product’s microstructure may be similar to coconut.

corn starch wastewater;bacterial cellulose;Acetobacterxylinum;plackett-burman design;response surface methodology

2016-01-27

丁勇(1974-)，男，碩士，講師，研究方向：食品發(fā)酵工程，E-mail：dingyong@sust.edu.cn。

榆林輕工綠色產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)及示范基地(2012cxy1-9)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)15-0193-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.029