王洋怡舟,李柏林,歐　杰,趙　勇,劉海泉

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306)

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紹興黃酒酒曲總DNA的提取及其真菌多樣性

王洋怡舟,李柏林,歐杰*,趙勇,劉海泉

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306)

目的:對于黃酒酒曲樣品,選擇一種合適的總DNA提取方法,并對其中真菌群落結(jié)構(gòu)進行多樣性分析。方法:因其質(zhì)地,結(jié)合以往DNA提取方法,比較分析不同方法所獲得的總DNA純度、得率及凝膠電泳圖,對實驗結(jié)果較好的DNA樣本進行真菌引物PCR擴增后純化定量,再經(jīng)Miseq高通量測序后進行生物信息分析。結(jié)果:實驗結(jié)果表明,使用試劑盒+物理化學(xué)酶法獲得了較高質(zhì)量的樣品總DNA,A260/A280比值也接近理想水平,PCR擴增后凝膠電泳圖能夠得到目的條帶,OTU分類、Shannon曲線和系統(tǒng)進化樹圖顯示了其真菌多樣性。結(jié)論:通過數(shù)據(jù)的比較和分析,確立了選擇的方法是一種較理想的酒曲總DNA的提取方法,對其真菌群落的測定及分析,也為后期開拓黃酒微生物資源提供了有力工具。

酒曲,DNA的提取,真菌,PCR,多樣性

黃酒是我國特有民族傳統(tǒng)特產(chǎn),是利用麥曲中微生物共同糖化發(fā)酵制成,在發(fā)酵過程中,酒曲具有復(fù)合糖化發(fā)酵粗酶制劑的功能,給黃酒的釀造提供多種需要的酶,積累的微生物代謝產(chǎn)物賦予了黃酒獨特的色、香、味[1]。

根據(jù)微生物細胞壁裂解方法的不同,常用提取方法可分為3類:物理方法,即通過外力作用破壞細胞結(jié)構(gòu)[2];化學(xué)法,例如SDS法或者CTAB法,其它試劑會與螯合劑(如EDTA)共同使用;酶法,使用溶菌酶、溶壁酶等[3]。

黃酒制曲過程是開放的,其微生物種類也是極其復(fù)雜的[4]。目前研究微生物多樣性的方法可分為兩類:一是利用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)分析菌群相關(guān)性和差異性。二是利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高研究的準確性[5],更加快速準確檢測微生物群落結(jié)構(gòu)和功能[6]。方華[7]采用3種培養(yǎng)基分離麥曲中微生物,得其真菌菌株。李旺軍[8]對酒曲真菌進行研究補充。曹鈺[9]等采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法和RISA技術(shù)對其多樣性進行研究。近年來,分子生物學(xué)在真菌分類學(xué)中發(fā)揮了越來越大的作用[10]。陳建堯[11]等對不同酒曲進行傳統(tǒng)培養(yǎng)和免培養(yǎng)分子鑒定研究所含真菌。陸健等[12]采用ITS測序方法對黃酒麥曲真菌組成和特性及過程中的變化進行了研究。

OTU(Operational Taxonomic Units)是微生物遺傳學(xué)的概念,為了便于進行分析,給某一個分類單元設(shè)置的同一標(biāo)志,在微生物多樣性中,OTU分類是根據(jù)基因測序結(jié)果對微生物進行分類。通過OTU分析,可以知道其微生物多樣性和不同微生物的豐度;往往會和已知菌一起做聚類,從而完成微生物的種屬歸屬鑒定?；贠TU的結(jié)果,計算在OTU相似水平(94%～99%)的Alpha多樣性指數(shù),包括稀釋曲線、Shannon-Wiener曲線等。根據(jù)已有微生物物種的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫,將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)系統(tǒng)關(guān)系樹中,從整個分類系統(tǒng)上全面了解樣品中所有微生物的進化關(guān)系和豐度差異[13-14]。

本文選擇建立了一種免培養(yǎng)式黃酒酒曲總DNA提取方法,對不同方法得出的DNA得率、純度以及凝膠電泳圖進行比較分析后選擇較好數(shù)據(jù)結(jié)果的總DNA樣本,對其進行真菌區(qū)PCR擴增和二次純化,應(yīng)用Miseq高通量測序后,通過OTU分類和Alpha評估得到其真菌多樣性,了解其主要微生物構(gòu)成,對以往的黃酒酒曲真菌群落結(jié)構(gòu)研究結(jié)果補充,為進一步探討真菌群落與產(chǎn)酶的功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

紹興某黃酒廠酒曲樣品,裝入無菌袋中,常溫保存。

D2000 MD114、GMO Food DNA Extraction Kit 深加工食品DNA提取試劑盒(非離心柱型)DP326 N3020、50 mg/mL Lysozyme、10 U/μL Lyticase、蛋白酶K天根TIANGEN公司;Premix Taq(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)、10×Loading Buffer CA1701ATaKaRa寶生物工程有限公司;λ-Hind Ⅲ DNA Marker寶生物工程(大連)有限公司;50×TAE;Acetic Acid;EDTA生工生物工程(上海)股份有限公司;異丙醇、十二烷基硫酸鈉國藥集團化學(xué)試劑有限公司;Agarose MBBI Life Sciences;Extraction Buffer:0.1 mol/L磷酸鹽,0.1 mol/L EDTA(pH8.0),0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.0),1.5 mol/L NaCl,1% CTAB。

AG離心機EPPENDORF艾本德公司;SLFPDAD多功能酶標(biāo)儀GENE Company Limited基因有限公司;AG 22331 Hamburg PCR儀EPPENDORF艾本德公司;BIO-RAD Powerpac Basic美國伯樂公司;Molecular Image GelDocTMXR+with Image LabTMSoftware電泳凝膠成像系統(tǒng)GelDoc XR 美國伯樂公司。

1.2樣品總DNA提取方法

1.2.1樣品預(yù)處理將酒曲用研缽粉碎均勻,取約0.10 g置于2 mL離心管中,加入1 mL無菌水,振蕩1 min,12000 r/min離心5 min,去掉液體,重復(fù)步驟1至2次。

1.2.2酒曲DNA提取方法1試劑盒法。參照GMO Food DNA Extraction Kit 深加工食品DNA提取試劑盒(非離心柱型)DP326 N3020的操作步驟。

1.2.3酒曲DNA提取方法2物理化學(xué)法。參照文獻[15]中1.2.2的“液氮研磨法+化學(xué)法”的方法。

1.2.4酒曲DNA提取優(yōu)化方法3取酒曲樣品置于研缽中，加入液氮覆蓋樣品,在其解凍前用力研磨,重復(fù)3次,倒液氮時注意粉末濺出。取研磨好的樣品0.150 g,加入2 mL離心管中。加入1 mL無菌水,于振蕩器振蕩1 min,隨后12500 r/min離心5 min,去掉液體,重復(fù)1至2次。加入500 μL試劑盒中緩沖液GMO1、20 μL 50 mg/mL Lysozyme、20 μL 10 U/μL Lyticase,旋渦振蕩1 min后放入預(yù)熱37 ℃水浴鍋,水浴30 min。加入20 μL的Proteinase K(20mg/mL),旋渦振蕩1 min后,放入預(yù)熱56 ℃水浴鍋水浴45 min,每隔15 min振蕩一次。液氮凍融三次。56 ℃水浴15 min。加入200 μL緩沖液GMO2,充分混勻,渦旋振蕩1min。37 ℃水浴鍋水浴10 min。12500 r/min離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入0.7倍體積的異丙醇,充分混勻。12500 r/min離心3 min,棄上清,保留沉淀。加入700 μL 70%乙醇,渦旋振蕩5 s,12500 r/min離心2 min,棄上清。重復(fù)操作加入700 μL 70%乙醇,渦旋振蕩5 s,12500 r/min離心2 min,棄上清。小心倒掉液體,65 ℃烘干30 min,至烘干為止,防止殘余的乙醇影響后續(xù)的酶反應(yīng)。加入20～50 μL洗脫緩沖液TE,旋渦振蕩1 min,最終得到DNA溶液,放入-20 ℃冰箱保存。

1.3DNA提取質(zhì)量檢測

在PCR擴增過程中,模板DNA的提取質(zhì)量是決定能否擴增出目標(biāo)條帶的限制因素[16]。DNA的提取效率,尤其是DNA的純度嚴重影響實驗結(jié)果[17]。

采用GENE Company Limited 基因有限公司的多功能酶標(biāo)儀SLFPDAD測定三種方法提取樣品的DNA含量、260、280以及A260/A280的比值，使用Gen5 1.11 Software讀取酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)。

1.4瓊脂糖凝膠電泳檢測

電壓120 V,電泳30 min,使用EB染色,用電泳凝膠成像系統(tǒng)拍照得到電泳圖。

1.5真菌18S rDNA PCR擴增

PCR現(xiàn)已成為功能基因組學(xué)研究廣泛應(yīng)用的技術(shù)[18]。PCR分子技術(shù)分析真菌群落的流程與分析細菌群落[19]是相似的,其關(guān)鍵在于真菌特異性DNA 擴增引物的選擇或設(shè)計。

PCR擴增引物見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1　引物一覽表Table 1　List of PCR primers

注:*為帶“GC”夾。PCR反應(yīng)體系:Premix Taq 12.5 μL,正反引物各1 μL,模板(酒曲DNA)2 μL,加dd H2O(8.5 μL)至總體積25 μL;同樣,以dd H2O代替酒曲DNA模板配置陰性對照。

PCR反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min,94 ℃變性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共30個循環(huán)。隨后在72 ℃延伸10 min,于4 ℃結(jié)束。PCR產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆?PCR結(jié)果用瓊脂糖電泳檢測。

1.6純化PCR產(chǎn)物及Miseq高通量測序

對于目的條帶進行割膠回收,作為第二次PCR擴增DNA模板。選取第二對PCR引物FR1-GC/FF390進行擴增,將PCR產(chǎn)物純化后交由上海翰宇生物科技有限公司人類基因組研究中心基因組測序部應(yīng)用MiSeq Reagent Kit v3在Illumina MiSeqTM測序平臺進行雙向測序。使用mothur v.1.32.1[22]對原始數(shù)據(jù)進行處理,進行過濾處理后,對得到的優(yōu)質(zhì)序列進行OTU聚類分析。基于OTU聚類分析結(jié)果,可以進行Alpha多樣性分析以及進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。使用MEGAN5 v5.7.1[23]來繪制分類學(xué)系統(tǒng)組成樹。

2　結(jié)果與分析

2.1酒曲中總DNA得率

評判不同方法提取的樣品DNA結(jié)果質(zhì)量有兩個硬性的指標(biāo),即得率和純度。將酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)進行整合后(見表2),可以看出使用方法1的平均DNA得率最低,每μL樣品提取出的濃度均在200 ng以下;而方法2中的DNA得率相對于方法1來說,平均DNA濃度值增加了83%,平均值在328 ng/μL,證明了使用方法2提取酒曲中總DNA效果比方法1效果好;而方法3提取的DNA得率相較于方法1和方法2大幅度提升,可得800 ng/μL 以上DNA含量,得率平均達到方法1得率的4.7倍,方法2得率的2.56倍。

表2　三種方法提取酒曲樣品的DNA得率Table 2　DNA quantity analyses isolated from sample using three methods

2.2酒曲中總DNA純度

在酒曲長期貯藏的過程中很容易受到自身因素和環(huán)境因素的影響,比如溫度、蛋白質(zhì)、糖分以及酚類物質(zhì)等污染而影響酒曲中自身DNA純度,從而會進一步影響后期實驗結(jié)果。因此,在樣本DNA提取過程中,純度的保證也格外重要。一般情況下,檢測DNA樣品純度指標(biāo)有A260/A230和A260/A280比值,其中,A260/A280的比值主要用來檢測蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的污染情況,理想值在1.8～2.0之間[24]。由于酒曲樣品DNA純度的影響因素主要取決于蛋白質(zhì)污染以及一些酚類物質(zhì),因此本文選取A260/A280比值來考量不同方法結(jié)果的純度。表3綜合了三種提取方法的數(shù)據(jù)結(jié)果,從方法1和方法3的結(jié)果數(shù)值來看,A260/A280比值都在1.8～2.0之間,方法1的比值平均值為1.8005,方法3的比值平均值為1.8100,表示該兩種方法提取的DNA純度在理想范圍內(nèi)。使用方法2得到的A260/A280比值低于1.8,表明該方法在提取DNA純度上效果不佳,缺少采取去除蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的步驟,使得提取的總DNA中存在這些因素的影響。

表3　三種方法提取樣品DNA純度數(shù)據(jù)Table 3　DNA quality data extracted from sample using three methods

2.3凝膠電泳圖驗證提取結(jié)果

通過對比三種提取方法的樣品總DNA凝膠電泳圖,發(fā)現(xiàn)使用方法3“酶法+試劑盒法+物理化學(xué)法”對于酒曲樣品中DNA的提取相對比較成功。

試劑盒法(方法1)中未采用任何破壁的步驟(物理方法和酶解破壁都未使用),得到的結(jié)果如圖1,在7～9.4 kb之間出現(xiàn)條帶,表明使用方法1提取的DNA片段較小,從圖中可以看出點樣孔較亮。一般情況下,點樣孔滯留的是蛋白質(zhì),說明方法1的實驗步驟中未較好的去除一些蛋白質(zhì)和多糖雜質(zhì)的污染。

圖1　三種方法所獲得的酒曲樣品總DNA的凝膠電泳圖Fig.1　Electrophoresis of total DNA extracted from sample注:0為陰性對照,1、2、3相對應(yīng)方法123, M為λ-HindⅢ DNA marker。

物理化學(xué)法(方法2)在整個提取DNA的步驟中使用了液氮破壁的物理方法,未使用酶解法來進行破壁處理,提取的總DNA得率(見表2)相對方法1較好,方法2的電泳條帶(見圖1,2泳道)有明顯的拖帶現(xiàn)象,看不清目的條帶,和DNA提取過程中未去除雜質(zhì)以及細胞壁破壁不夠徹底有關(guān)。

試劑盒+物理化學(xué)+酶法(方法3)的結(jié)果數(shù)據(jù)(見表2、表3)與前兩個方法的數(shù)據(jù)相比結(jié)果較好,表2證明了結(jié)合了酶解和物理破壁法處理樣品,得到了較高的DNA濃度,得到的電泳圖(見圖1)在23 kb上方顯示出條帶,提取出的DNA片段相對較完整。無論從DNA得率、純度還是凝膠電泳圖的實驗結(jié)果來看,方法3提取的酒曲樣品DNA與方法1、2相比結(jié)果較好,可以直接用于后續(xù)的分子生物學(xué)實驗。

2.4PCR擴增結(jié)果

為了進一步驗證方法3對于酒曲樣品的DNA提取效果,本文選取引物NS3-GC/YM951r對方法3獲得的DNA模板進行四組平行PCR擴增,從PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果圖分析其提取效果,結(jié)果如圖2,證明提取后的DNA經(jīng)真菌引物PCR擴增結(jié)果較成功,在正確的位置出現(xiàn)了目標(biāo)片段。分子量大約在250～500 bp。

圖2　PCR擴增后凝膠電泳圖Fig.2　Gel electrophoresis after fungi zone PCR amplification注:1、2、3、4為四組平行實驗。

2.5OTU劃分與Alpha評估

2.5.1OTU分類使用 PyNAST和數(shù)據(jù)庫比對后用 UCHIME[25]方法檢測并去除Chimeric序列。非嵌合體序列使用 Silva/GreenGene等核糖體數(shù)據(jù)庫中的aligned(16S/18S,SSU)核糖體序列數(shù)據(jù)比對,去除非目的物種序列污染。統(tǒng)計樣本的優(yōu)質(zhì)序列及長度分布(結(jié)果如表4和圖3),從結(jié)果中可以看出使用方法3提取的樣品DNA,經(jīng)PCR擴增后獲得的平均片段長度在真菌(ITS/18S,28S～5.8S)核苷酸片段長度區(qū)間,在300～320 bp之間的序列數(shù)達到140000左右,樣本2平行實驗提取DNA數(shù)量較小,后續(xù)多樣性分析將該數(shù)據(jù)剔除。

表4　序列統(tǒng)計情況Table 4　Sequence statistics

圖3　序列長度分布圖Fig.3　Sequence diagram

2.5.2多樣性評估(community diversity)本文Alpha多樣性評估采用Shannon-Wiener曲線,經(jīng)PCR擴增后割膠純化后定量進行評估。Shannon-Wiener是反映樣品中微生物多樣性的指數(shù),利用測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線,以此反映各樣本在不同測序數(shù)量時的微生物多樣性。當(dāng)曲線趨向平坦時,說明測序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息[26]。圖4為cutoff=0.03水平下的Shannon曲線。剔除數(shù)據(jù)2,134三組平行實驗得到的曲線結(jié)果都可以趨向平坦,可以較好的獲取樣品中微生物情況。

圖4　Shannon多樣性曲線 Fig.4　Shannon diversity curve注:cutoff=0.03，圖5同。

2.6系統(tǒng)進化樹分析

對所有樣本做系統(tǒng)進化分析,根據(jù)OTU來區(qū)分樣品內(nèi)及多個樣本間不同物種并構(gòu)建進化樹,通過分析 OTU 組分豐度來計算不用物種在樣品內(nèi)的豐度。根據(jù)分化時間來判斷物種間的相似度及進化關(guān)系,處在同一分支上的物種說明進化關(guān)系較近。默認使用數(shù)據(jù)為代表性序列,分析水平為目。結(jié)果如圖5。在以往對黃酒酒曲真菌多樣性的研究表明,其生長最多的真菌有Absidiacorymbifera(傘枝犁頭霉)、Rhi-zomucorPusillus(微小毛霉)、Aspergillusorgyze(米曲霉)、Aspergillusfumigatus(煙曲霉)和Rhizopusoryzae(米根霉)。Aspergillusfumigatus(煙曲霉)是麥曲中的主要絲狀真菌。圖5進化樹顯示本研究提取的酒曲DNA中真菌有如下幾個菌屬:Saccharomyceta(酵母屬)、Basidiomycota(擔(dān)子菌類)和一些早期其他分支的真菌屬目,如Harpellales(鉤孢毛菌目)和Mucorales(毛霉菌目)。酒曲樣品中優(yōu)勢菌為Eurotiales(散囊菌目),其次是Saccharomycetales(酵母菌目)、Mucorales(毛霉菌目)、Harpellales(鉤孢毛菌目)和Capnodiales(煤炱目)。

圖5　系統(tǒng)進化樹圖 Fig.5　Phylogenetic tree graph

3　結(jié)論與討論

微生物DNA的提取大多根據(jù)微生物其自身不同特點或者具體的實驗要求去選擇合適的提取方法。張寧等[27]對DNA提取方法進行研究總結(jié),綜合了各類各樣DNA的提取方法,在設(shè)計實驗方案之前可相互借鑒,總結(jié)出一個適合自己樣品的優(yōu)勢方法,進行多次嘗試和數(shù)據(jù)整理后們可以找到較適合的DNA提取方法。與方法1、2相比,方法3的實驗結(jié)果表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢,總體來說,方法3(酶法+試劑盒法+物理化學(xué)法)在以下幾個關(guān)鍵步驟進行了優(yōu)化處理:增加了樣品預(yù)處理步驟。因為酒曲樣品曲塊硬,水分含量少,吸水性較強,如不進行前處理步驟,直接加入緩沖液、溶菌酶、溶壁酶以及蛋白酶K等,樣品會將這些物質(zhì)全部吸收,從而使得加入的試劑物質(zhì)起不到酶解和去除蛋白質(zhì)的作用;對于真菌DNA的提取關(guān)鍵在于破碎其細胞壁,本文在方法1中未使用任何破壁的步驟;方法2使用液氮研磨物理破壁法;方法3在酒曲樣品前處理之前,先使用液氮研磨處理樣品,隨后在加入的緩沖液中結(jié)合了酶裂解的破壁法(溶菌酶、溶壁酶),在加入蛋白酶K后,再使用了液氮凍融的物理破壁法,保證了樣品中DNA的高質(zhì)量提取。從總DNA凝膠電泳圖和酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)得出方法3較為適合黃酒酒曲樣品。后續(xù)分子實驗采用該方法提取出的DNA樣本,PCR擴增電泳條帶以及純化后PCR產(chǎn)物高通量分析數(shù)據(jù)也較好的證實了使用該DNA提取方法可較好獲取黃酒酒曲中微生物多樣性情況。本研究通過分子生物手段,得到黃酒酒曲真菌多樣性,測出其真菌序列長度、構(gòu)建出Shannon多樣性曲線,得出真菌優(yōu)勢菌種,鑒定的結(jié)果認為Saccharomyceta(酵母屬)、Basidiomycota(擔(dān)子菌類)是黃酒酒曲中的主要真菌目。酒曲樣品中優(yōu)勢菌為Eurotiales(散囊菌目),其次是Saccharomycetales(酵母菌目)、Harpellales(鉤孢毛菌)、Mucorales(毛霉目)和Capnodiales(煤炱目)。

與以往傳統(tǒng)方式不同,本文減少了傳統(tǒng)培養(yǎng)菌種以及篩選過程,大大減少時間和成本從而得出黃酒酒曲的真菌多樣性,得出的優(yōu)勢菌種等數(shù)據(jù)結(jié)果對以往的研究結(jié)果進行了補充,這也反映出對于一個微生物群落組成的體系,使用單一的方法都不能完整的揭示其復(fù)雜構(gòu)成。深入認識其微生物組成結(jié)構(gòu),也為后續(xù)研究黃酒整個發(fā)酵過程中微生物多樣性提供必要的實驗依據(jù)。

[1]陸健,曹鈺,方華，等.紹興黃酒麥曲中真菌的初步研究[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27(2):78-83.

[2]李旺軍,方華,曹鈺,等.不同破壁方法提取紹興黃酒麥曲中的微生物總DNA[J].中國釀造,2007(4):17-20.

[3]Robe P,Nalin R,Capellano C,et al. Extraction of DNA from soil[J]. European Journal of Soil Biology,2003,39:183-190.

[4]壽虹志,凌志勇,楊旭,等.淺析黃酒麥曲中的微生物與黃酒風(fēng)味的關(guān)系[J].中國釀造,2007(8):55-57.

[5]譚映月,胡萍,謝和.我國白酒釀造微生物多樣性的研究現(xiàn)狀及展望[J].釀酒科技,2011,(11):100-105.

[6]許愛清,李宗軍,王遠亮,等.應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)檢測發(fā)酵食品和飼料中真菌菌群[J].食品科學(xué),2010,31(7):317-322.

[7]方華.紹興黃酒麥曲中微生物的初步研究[D]. 無錫：江南大學(xué),2006.

[8]李旺軍.紹興黃酒麥曲中真菌資源的初步研究[D].無錫：江南大學(xué),2007.

[9]曹鈺,陸健,方華，等.紹興黃酒麥曲中真菌多樣性的研究[J].食品科學(xué),2008,29(3):277-282.

[10]燕平梅,馬雁飛,倪玲.發(fā)酵食品中微生物多樣性研究方法進展[J].中國釀造,2011,(2):12-14.

[11]曹鈺,陳建堯,謝廣發(fā),等.黃酒麥曲天然發(fā)酵中真菌群落的成因初探[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008,27(5):95-101.

[12]陳建堯,曹鈺,謝廣發(fā),等.黃酒機械成型麥曲制曲過程中真菌動態(tài)變化的研究[J].微生物學(xué)報,2008,34(8):42-50.

[13]Edgar R C,Haas B J,Clemente J C,et al. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection[J]. Bioinformatics,2011,27(16)：2194-2200.

[14]DeSantis T Z,Hugenholtz P,Larsen N,et al. Greengenes,a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology,2006,72(7):5069-5072.

[15]閆亮珍,李曉然，全哲學(xué)，等.汾酒大曲和酒醅樣品DNA提取方法的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(3):32-36.

[16]Manuel Porcar,Silvia Ramos A,Mparo Latorre.A simple DNA extraction method suitable for PCR detection of genetically modified maize[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2007,87:2728-2731.

[17]楊艷秋,王麗,賀丹,等.真菌DNA提取方法的建立和比較[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(50):10093-10096.

[18]Ray Chaudhuri S,Pattanayak AK,ThakurAR.Microbial DNA extraction from samples of varied origin[J].Current Science,2006,91(12):1697-1700.

[19]ERCOLINI D. PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food[J]. Journal of Microbiological Methods,2004,56(3):297-314.

[20]HARUTA S,SHINTARO U,EGAWA I,et al. Succession of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR-mediated denaturing gradient gel electrophoresis[J]. International Journal of Food Microbiology,2006,109(1/2):79-87.

[21]Vainio E J,Hantula J. Direct analysis of wood-inhabiting fungi using denaturing gradient gel electrophoresis of amplified ribosomal DNA[J]. Mycological Research,2000,104:927-936.

[22]Schloss P D,Westcott S L,Ryabin T,et al. Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and environmental microbiology,2009,75(23)：7537-7541.

[23]El Hadidi M,Ruscheweyh H J,Huson D. Improved metagenome analysis using MEGAN5. In Joint 21st Annual International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB)and 12th European Conference on Computational Biology(ECCB)2013,8.

[24]趙裕棟,周俊,何璟.土壤微生物總DNA提取方法的優(yōu)化[J].微生物學(xué)報,2012,52(9):1143-1149.

[25]Robert C. Edgar. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection Bioinformatics,2011,27(16):2194-2200.

[26]王瑞風(fēng),雷海燕,臧璞,等.大黃酸對糖尿病小鼠腸道菌群影響的初步研究[J].中國微生態(tài)學(xué)雜,2016,28(1):21-24.

[27]張寧,王鳳山.DNA提取方法進展[J].中國海洋藥物,2004,(2):40-46.

Extracting total DNA in Shaoxing rice wine wheat starter and its fungal diversity

WANG Yang-yi-zhou,LI Bai-lin,OU Jie*,ZHAO Yong,LIU Hai-quan

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To choose appropriate extraction method of total DNA of yellow rice wine and analyze its fugal diversity. Methods:Because of its character,different methods detection were compared and analyzed in this study,including total DNA purity,yield and gel electrophoresis combining with previous DNA extraction method. Objective bands were purified and quantified after PCR amplification of fungi primer,and conducted biological information analysis after Miseq high throughput sequencing. Results:Experimental result showed that kit+Physical+enzyme method could get better quality and concentration fungal DNA,A260/A280ratio was close to the ideal level,and could get obvious target band figure after PCR amplification gel electrophoresis. OTU classification,Shannon diversity curve and phylogenetic tree graph showed fungal diversity. Conclusion:Through the comparison and analysis of data,established method in this paper was an ideal method to extract total DNA in the rice wine wheat starter,determination of the fungal community also provided a powerful tool for later developing rice wine microbial resources.

wheat starter;DNA extraction;fungal;PCR;diversity

2016-02-26

王洋怡舟(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)，E-mail：422621249@qq.com。

歐杰(1964-)，男，碩士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：jou@shou.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0176-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.026