檀茜倩,韓　燁,肖華志,周志江

(天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072)

?

自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)體系表達(dá)片球菌素融合蛋白

檀茜倩,韓燁,肖華志,周志江*

(天津大學(xué)化工學(xué)院食品科學(xué)與工程系,食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,天津 300072)

分別采用IPTG誘導(dǎo)和自動(dòng)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達(dá)片球菌素融合蛋白;采用稀釋方法對(duì)變性后的片球菌素融合蛋白包涵體進(jìn)行復(fù)性,復(fù)性后融合蛋白經(jīng)Ni-IDA柱分離純化后經(jīng)腸激酶酶切得目的片球菌素蛋白;以單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌為指示菌,采用牛津杯法測(cè)定所得到的片球菌素活性,并對(duì)其熱穩(wěn)定性,耐酸堿性和耐蛋白酶活性進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過誘導(dǎo)后,IPTG誘導(dǎo)菌液最終OD600值為3.5000,而自動(dòng)誘導(dǎo)為7.6998,IPTG誘導(dǎo)融合蛋白包涵體采用尿素溶解后的蛋白濃度為0.1001 mg/mL,而自動(dòng)誘導(dǎo)為0.2359 mg/mL;自動(dòng)誘導(dǎo)體系所獲得的片球菌素融合蛋白產(chǎn)量?jī)?yōu)于IPTG誘導(dǎo)體系。所獲得的片球菌素對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有抑制作用,熱穩(wěn)定性好,耐酸性強(qiáng)而耐堿性弱,對(duì)胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K敏感,可以被降解。自動(dòng)誘導(dǎo)體系可以應(yīng)用于片球菌素融合蛋白的E.coliBL21(DE3)基因工程菌高效表達(dá)片球菌素。

自動(dòng)誘導(dǎo),IPTG,包涵體,分離純化,抑菌活性

乳酸片球菌素是由乳酸菌產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的物質(zhì)[1],對(duì)許多革蘭氏陽性菌有抑制作用[2],主要抑制單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌[3],有很大的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。目前多采用天然發(fā)酵方法獲得乳酸片球菌素[4],通過硫酸銨分級(jí)沉淀,吸附,離心,解吸附,凝膠過濾色譜,離子交換色譜和高效液相色譜的方法,逐級(jí)對(duì)片球菌素進(jìn)行分離和提取,但是天然乳酸菌株片球菌素的產(chǎn)量小,而且在逐步純化的過程中片球菌素的活性和產(chǎn)量都會(huì)有所損失[5-6]。為了解決野生菌株產(chǎn)量低的問題,采用基因工程技術(shù),將片球菌素蛋白基因克隆到大腸桿菌宿主內(nèi)部構(gòu)建基因工程菌以獲得片球菌素的高效表達(dá)[7]。目前對(duì)大腸桿菌體外表達(dá)的誘導(dǎo)多采用IPTG誘導(dǎo)方法,Studier等人采用ZYM-5052培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌表達(dá)體系的自動(dòng)誘導(dǎo)表[8],目前有部分關(guān)于采用自動(dòng)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的報(bào)道,分別對(duì)治療蛋白,半胱氨酸蛋白酶和增殖誘導(dǎo)配體蛋白成功的進(jìn)行了表達(dá)[9-11],這種誘導(dǎo)方法避免了使用IPTG 的毒性問題并且使目的蛋白產(chǎn)量有了很大提升,有較大的工業(yè)利用價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外少有關(guān)于自動(dòng)誘導(dǎo)應(yīng)用于含有片球菌素基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)片球菌素的文獻(xiàn)報(bào)道,值得進(jìn)一步研究。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá),被表達(dá)的融合蛋白常會(huì)形成不溶于水且不具有生物活性的包涵體蛋白,其復(fù)性是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在下游純化中的瓶頸因素[12-13],針對(duì)這一問題,本文對(duì)如何恢復(fù)自動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的乳酸片球菌素融合蛋白包涵體的活性方法進(jìn)行了初探。

本論文主要分為三個(gè)部分:比較含有片球菌素基因的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的IPTG誘導(dǎo)和自動(dòng)誘導(dǎo);片球菌素融合蛋白包涵體的變性復(fù)性以及目的基因工程片球菌素的分離純化;基因工程片球菌素理化性質(zhì)的初探。為研究片球菌素在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)和純化,以及如何獲得具有生物活性的乳酸片球菌素提供了參考。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

E.coliBL21(DE3)基因工程菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌CVCC1595中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;E.coliBL21(DE3)基因工程菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(amp+),單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基?；蚬こ叹L(zhǎng)培養(yǎng)基為MDG培養(yǎng)基(amp+),自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為ZYM-5052(amp+)培養(yǎng)基。

SDS-PAGE電泳、Tricine-SDS-PAGE電泳所用試劑Sigma;氨芐青霉素genview分裝;IPTG、尿素、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、咪唑北京普博欣公司;Ni-IDA柱北京韋氏博慧色譜科技;重組腸激酶(rEK-B)廣州中大南海生物技術(shù)有限公司;其他試劑天津大學(xué)科威公司均為分析純。

DYCZ-24D雙垂直電泳槽北京市六一儀器廠;GIS-2009紫外凝膠成像儀Tanon公司;JY88-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀寧波新芝;UV-1102紫外可見分光光度計(jì)上海天美;D2004W電動(dòng)攪拌器上海梅穎浦儀器制造有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)條件優(yōu)化挑取甘油凍存E.coliBL21(DE3)基因工程菌接5 mL含amp+的LB培養(yǎng)基中,37 ℃,170 r/min震蕩過夜培養(yǎng)。次日將菌液以1∶100比例接種于新鮮含amp+LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃,170 r/min震蕩培養(yǎng)1～2 h,直至菌液OD600值為0.5～0.8。在37 ℃和30 ℃兩個(gè)溫度下,以IPTG終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。間隔1 h測(cè)量菌體的OD600值及培養(yǎng)基pH的變化,收集誘導(dǎo)結(jié)束后的菌液,適當(dāng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.2菌體的破碎以及包涵體的洗滌和溶解參考Chow等方法[14]。收集菌體沉淀,重懸于PBS緩沖液(pH7.4)中,采用溶菌酶處理,溶菌酶終濃度為2 mg/mL,在20、40、0、80、100、120 min分別取樣500 μL稀釋10倍后使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量其OD280,OD260和OD600值以測(cè)定內(nèi)容物的溶出情況。將經(jīng)溶菌酶處理的菌體溶液在超聲破碎儀上,于 200 W,超聲開3 s,關(guān)3 s的條件下破碎20 min。在4 ℃,8000 r/min離心20 min。棄去上清液,保留沉淀。沉淀用PBS緩沖液(pH7.4)洗滌兩次,用2 mol/L的尿素溶液洗滌一次,用0.05% Triton100 溶液洗滌一次。每次洗滌后保留樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析以評(píng)價(jià)洗滌的效果。采用0.1 mol/L Tris·HCl,8 mol/L尿素溶液溶解洗滌后的包涵體蛋白,將包涵體蛋白沉淀重新懸于溶解液中,在4 ℃下,采用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌12 h后,將溶解液離心,取上清液并測(cè)定其蛋白濃度。

1.2.3目的蛋白的自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)挑取甘油凍存E.coliBL21(DE3)基因工程菌于含有amp+的LB平板上劃線,過夜培養(yǎng)。次日挑取平板上茁壯單菌落接入5 mL含amp+的MDG培養(yǎng)基中,37 ℃,170 r/min,過夜培養(yǎng)。參考Studier等[8],次日將菌液按1∶500比例接入含適量amp+的ZYM-5052培養(yǎng)基中在37 ℃,將搖菌速度提高到190 r/min過夜培養(yǎng),待菌體變渾濁轉(zhuǎn)移入20 ℃搖床在同樣轉(zhuǎn)速下繼續(xù)培養(yǎng),每間隔1 h取樣測(cè)定菌液的OD600值,當(dāng)OD600值在1～2 h不發(fā)生變化時(shí)收集菌液,將菌液離心,保留上清液,經(jīng)適當(dāng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳;將菌體沉淀重懸于PBS緩沖液(pH7.4)中,按1.2.2方法超聲破碎處理,保留上清液和沉淀,經(jīng)適當(dāng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳;獲得的包涵體沉淀按1.2.2方法處理。

1.2.4包涵體的復(fù)性采用直接稀釋復(fù)性,復(fù)性液組成為,100 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,0.4 mmol/L/4 mmol/L GSSG/GSH,1 mmol/L EDTA。將溶解后的包涵體蛋白稀釋一定倍數(shù),使終蛋白濃度分別0.0472、0.0944、0.1415、0.1887 mg/mL的包涵體溶解后的變性溶液5 mL分別逐滴加入25 mL的復(fù)性液中,并不斷攪拌,在4 ℃的條件下復(fù)性12 h。

1.2.5復(fù)性后重組蛋白的純化復(fù)性后重組蛋白在緩沖液中做透析處理。采用Ni-IDA柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。按Ni-IDA柱操作手冊(cè),純水洗柱,并用緩沖液平衡10個(gè)柱體積,蛋白溶液樣品經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后上樣,保持流速為1 mL/min,用緩沖液平衡10個(gè)柱體積,使用含50 mmol/L咪唑的平衡溶液進(jìn)行第一次洗脫,保持流速為1 mL/min,使用含有500 mmol/L咪唑的平衡液進(jìn)行第二次洗脫,保持流速為1 mL/min。此時(shí)收集目的蛋白。將目的蛋白透析后采用冷凍干燥法縮小樣品體積。將樣品重新溶于腸激酶緩沖液中(20 mmol/L Tris·HCl,100 mmol/L NaCl,pH7.6),測(cè)定樣品的蛋白濃度,加入適量的腸激酶酶切。按上述步驟再次進(jìn)行純化,以10mL每管采集,采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定蛋白濃度。產(chǎn)物采用Tricine-SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6基因工程片球菌素的理化性質(zhì)分析基因工程片球菌素的活性測(cè)定采用牛津杯法[15],指示菌為單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌;將適量基因工程片球菌素在40、70、100、121 ℃處理30 min后測(cè)定其活性以判斷高溫對(duì)其活性的影響,室溫條件下保存的片球菌素作為對(duì)照;將適量基因工程片球菌素分別置于4 ℃和-20 ℃的條件下處理保存一個(gè)月后測(cè)定其活性以判斷低溫對(duì)其活性的影響;將適量基因工程片球菌素溶液采用4 mol/L的鹽酸和4 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH為1～14的范圍內(nèi)的條件下處理2 h后測(cè)定其活性,評(píng)價(jià)基因工程片球菌素對(duì)酸堿的耐受性;適量基因工程片球菌素溶液分別用胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,蛋白酶K處理后測(cè)定其活性變化,測(cè)定基因工程片球菌素對(duì)上述酶的敏感性。

表1　在37 ℃不同時(shí)間不同IPTG濃度誘導(dǎo)的條件下培養(yǎng)基的pHTable 1　The pH of the media under different time and different concentration of IPTG in 37 ℃

表2　在30 ℃不同時(shí)間不同IPTG濃度誘導(dǎo)的條件下培養(yǎng)基的pHTable 1　The pH of the media under different time and different concentration of IPTG in 30 ℃

1.2.7數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)中每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,采用origin軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果和分析

2.1IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)優(yōu)化條件分析

在37 ℃和30 ℃兩個(gè)不同溫度下,以IPTG的終濃度分別為1,0.5,0.25 mmol/L,0.125 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo),菌液OD600值隨時(shí)間延長(zhǎng)變大,具體變化過程見圖1,圖2。

圖1　37 ℃不同濃度IPTG誘導(dǎo)菌體OD600值隨時(shí)間的變化Fig.1　The change of OD600under different concentration of IPTG in 37 ℃

圖2　30 ℃不同濃度IPTG誘導(dǎo)菌體OD600值隨時(shí)間的變化Fig.2　The change of OD600under different concentration of IPTG in 30 ℃

在37 ℃下1 mmol/L和0.125 mmol/L的IPTG均可以在一個(gè)較短的時(shí)間內(nèi)提高菌體的OD600值,優(yōu)于0.5、0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后的菌體OD600值達(dá)到2.5時(shí)不再增長(zhǎng),而使用0.125 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的菌體的OD600值卻可以達(dá)到2.8。從菌體的生長(zhǎng)情況和IPTG的使用量?jī)蓚€(gè)角度考慮,在37 ℃下使用0.125mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)蛋白為優(yōu)。

在30 ℃下0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)可以使菌體OD600值在短時(shí)間內(nèi)升高,但在經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)后,其菌體的OD600值在3處趨于穩(wěn)定,而使用0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)后,盡管在短時(shí)間內(nèi)的菌體的OD600值增加的速度緩慢但經(jīng)過同樣的6 h誘導(dǎo)后其可以使菌體的最終的OD600值達(dá)到3.500。使用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)和使用0.125 mmol/L的IPTG經(jīng)同樣的時(shí)間誘導(dǎo)后,菌體的最終的OD600值為2.5。從菌體的生長(zhǎng)情況考慮,在30 ℃下使用0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌體表達(dá)蛋白為優(yōu)。

在不同條件下菌液的pH隨時(shí)間的變化如表1和表2所示。菌液的初始的pH大約在6附近,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),不同條件下菌液的pH都有所增加,原因可能是由于培養(yǎng)條件不穩(wěn)定,菌體的生長(zhǎng)消耗了培養(yǎng)基,導(dǎo)致培養(yǎng)基的成分發(fā)生微變,菌體被誘導(dǎo)后所表達(dá)的蛋白和其他分泌物,均可造成培養(yǎng)基pH的升高。

不同條件下的菌體沉淀的全菌體蛋白電泳圖譜如圖3所示,定量分析了包涵體蛋白的表達(dá)量,目的包涵體的蛋白條帶大約在20 ku附近。通過條帶判斷4,5,6,7條件下蛋白產(chǎn)量較大,7最大;而1,2,3,8條件下蛋白產(chǎn)量較小,8最少。

圖3　IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)蛋白全菌體蛋白電泳圖Fig.3　SDS-PAGE of the expression proteins by E. coli BL21(Trx-Ped A)注:M 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量;1,2,3,4分別代表37 ℃ IPTG 終濃度為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L;5,6,7,8分別代表 30 ℃ IPTG終濃度為1、0.5、0.25、0.125 mmol/L。

綜合考慮IPTG的終濃度,誘導(dǎo)溫度,菌液pH的變化和全菌體蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜四個(gè)因素確定30 ℃,IPTG的終濃度為0.25 mmol/L為IPTG誘導(dǎo)E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達(dá)片球菌素融合蛋白的最優(yōu)條件。

2.2菌體細(xì)胞的破碎、包涵體的洗滌和溶解結(jié)果分析

菌體細(xì)胞的破碎效果的好壞與細(xì)胞內(nèi)容物釋放的多少有直接關(guān)系。大腸桿菌在600 nm處有最大的吸光度值,而在280 nm和260 nm下,蛋白質(zhì)的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸以及核酸中的大量堿基在紫外條件下有最大量的吸收[16]。圖4為在室溫下溶菌酶處理后菌體細(xì)胞的酶解情況。

圖4　室溫下的酶解過程Fig.4　The process of enzymolysis in room temperature

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)溶菌酶處理后的細(xì)胞胞壁逐漸溶解,細(xì)胞內(nèi)容物大量釋放。對(duì)此菌液進(jìn)行超聲破碎處理后,菌液的OD600值下降到0.0188,表明此時(shí)菌液中的菌體細(xì)胞已經(jīng)被大量降解,包涵體蛋白被很好釋放。使用溶菌酶加超聲破碎處理細(xì)胞,可以縮短細(xì)胞的破碎時(shí)間,改善細(xì)胞的破碎效果,缺點(diǎn)是引入了溶菌酶這種雜蛋白。對(duì)破碎后的包涵體的洗滌不僅可以除去菌體細(xì)胞中除目的包涵體蛋白以外的蛋白,同時(shí)還可以較大程度的除去溶菌酶蛋白,為后續(xù)的純化步驟提供方便。圖5為包涵體蛋白經(jīng)多次洗滌后電泳圖譜。泳道1,2與全菌體蛋白的電泳相比,除去了較多菌體雜蛋白,但溶菌酶蛋白仍然存在。泳道3溶菌酶蛋白條帶基本消失,溶液中的其他的蛋白成分的條帶也基本消失。泳道4基本呈現(xiàn)單一包涵體條帶,說明包涵體蛋白經(jīng)1% Triton的洗滌比較徹底,純度較高。包涵體蛋白在本實(shí)驗(yàn)所采用的溶解液中完全溶解,經(jīng)離心后只有較少的沉淀產(chǎn)生。

圖5　包涵體蛋白洗滌后電泳圖Fig.5　SDS-PAGE of inclusion body after washing注:M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量;泳道1,2為經(jīng)PBS洗滌以后的 蛋白電泳;泳道3為經(jīng)2 mol/L尿素洗滌后的包涵體蛋白; 泳道4為經(jīng)1% Triton洗滌后的蛋白電泳圖; 溶菌酶條帶在12 ku附近。

2.3自動(dòng)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)分析

經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養(yǎng)基中生長(zhǎng),菌體的OD600值隨時(shí)間的增加而增加,在22 h達(dá)到最大值為7.6998。E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養(yǎng)基中生長(zhǎng),消耗掉培養(yǎng)基中的速效碳源葡萄糖后,開始利用遲效碳源乳糖,乳糖則可以作為啟動(dòng)子誘導(dǎo)E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達(dá)融合蛋白。圖6為E.coliBL21(DE3)基因工程菌在ZYM-5052培養(yǎng)基中被自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白所得的全菌體蛋白電泳圖,可以看在電泳圖譜除了雜蛋白條帶以外,在20 ku附近處出現(xiàn)非常明顯的目的條帶,與預(yù)期的融合蛋白的分子量相符。判斷為乳酸片球菌素融合蛋白。

圖6　ZYM-5052培養(yǎng)基自動(dòng)誘導(dǎo)蛋白 表達(dá)全菌體蛋白電泳圖Fig.6　SDS-PAGE of the expression proteins by E. coli BL21(DE3)(Trx-Ped A)growing in ZYM-5052 media注:M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,另一泳道為全菌體蛋白條帶。

圖7所示泳道1,泳道2,泳道3在20 ku附近均發(fā)現(xiàn)融合蛋白的目的條帶。泳道1融合蛋白的含量明顯大于泳道2和泳道3,因?yàn)樵诰w細(xì)胞的內(nèi)部外部均發(fā)現(xiàn)有可溶性目的融合蛋白存在,說明自動(dòng)誘導(dǎo)在一定程度上提高了融合蛋白的可溶性,但是濃度較低,大部分的目的融合蛋白還是在胞內(nèi)以不具生物活性的包涵體的形式存在。

圖7　E.coli TransB(DE3)基因工程菌表達(dá)蛋白的電泳圖Fig7 SDS-PAGE of the expression of E.coli TransB(DE3)(Trx-Ped A)注:M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。泳道1為細(xì)胞破碎離心后的沉淀的蛋白電泳;泳道2為細(xì)胞破碎后離心所得到的上清液的蛋白電泳;泳道3為培養(yǎng)后經(jīng)一次離心獲得的上清液的電泳。

2.4包涵體復(fù)性和片球菌素的純化結(jié)果分析

將相同條件下發(fā)酵的菌體,經(jīng)過破碎洗滌后得到的片球菌素融合蛋白包涵體溶于溶解液,自動(dòng)誘導(dǎo)的產(chǎn)生的融合蛋白的溶解液濃度為0.2359 mg/mL,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)產(chǎn)生融合蛋白的溶解液濃度為0.1001 mg/mL。自動(dòng)誘導(dǎo)產(chǎn)量為IPTG誘導(dǎo)的兩倍多。對(duì)經(jīng)過稀釋復(fù)性并經(jīng)過腸激酶處理的目的片球菌素進(jìn)行Ni柱純化,蛋白洗脫量與時(shí)間的關(guān)系如圖8所示。用500 mmol/L咪唑洗脫15 min左右,目的片球菌素被洗脫下來,35 min時(shí)洗脫量達(dá)到最大,隨后逐漸降低,整個(gè)洗脫時(shí)間為1 h。經(jīng)過Ni柱純化,基因工程片球菌素的純度有所提高,最大濃度為0.014 mg/mL。采用Tricine-SDS-PAGE電泳分析經(jīng)腸激酶處理的蛋白樣品,目的片球菌素條帶大約在4.4 ku左右,顏色較淡,含量較少。說明目的片球菌素在包涵體溶解、復(fù)性、Ni柱純化以及腸激酶的處理等多步過程中產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)的破壞和降解。

圖8　基因工程片球菌素在Ni-IDA柱的洗脫曲線Fig.8　The elution curve of gene engineerin pediocin via Ni-IDA column

抑菌實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)性并經(jīng)腸激酶處理的基因工程片球菌素對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌有抑制作用,產(chǎn)生直徑為14.23 mm的抑菌圈。復(fù)性后未經(jīng)酶切的融合蛋白無抑菌活性。根據(jù)復(fù)性率計(jì)算公式:復(fù)性率%=溶液中復(fù)性后有活性的蛋白濃度/溶液的總蛋白濃度,采用稀釋復(fù)性方法的復(fù)性率為33%～35%。包涵體的復(fù)性是讓變性包涵體蛋白重新折疊成為正確形式的過程,這個(gè)過程包含有復(fù)雜動(dòng)力學(xué)反應(yīng),本文采用稀釋復(fù)性方法對(duì)片球菌素融合蛋白包涵體進(jìn)行復(fù)性,經(jīng)過酶切后獲得了具有抑菌活性的基因工程片球菌素,但稀釋復(fù)性的復(fù)性液體積過大,復(fù)性時(shí)間長(zhǎng),目的蛋白在此過程中會(huì)產(chǎn)生一定損失,復(fù)性率較低,這些問題有待于后續(xù)研究,比如采用分子伴侶輔助復(fù)性[17]等。

2.5片球菌素的理化性質(zhì)分析

基因工程片球菌素對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用。產(chǎn)生的抑菌圈的平均直徑18.64 mm。經(jīng)過不同溫度處理的基因工程片球菌素的活性保留情況見表3。與室溫保存的片球菌素相比,隨溫度的上升基因工程片球菌素的活性盡管存在一定程度的損失,但是總體保持穩(wěn)定,100 ℃和121 ℃處理后仍具活性,分別產(chǎn)生12.22 mm和11.88 mm的抑菌圈。

表3　熱處理基因工程片球菌素活性的影響Table 3　The effect of heating on the activity of gene engineering pediocin

實(shí)驗(yàn)證明4 ℃低溫貯藏和-20 ℃冷凍保藏對(duì)基因工程乳酸片球菌素的影響不大,但其自身會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而產(chǎn)生降解和變性,導(dǎo)致活性喪失。

pH對(duì)基因工程片球菌素的影響如圖9所示。當(dāng)pH較低時(shí),基因工程片球菌素的抑菌活性隨pH的升高保持平穩(wěn),沒有明顯變化。當(dāng)pH超過7時(shí),基因工程片球菌素的抑菌活性有所下降。此結(jié)果說明基因工程片球菌素的耐酸性較強(qiáng)而耐堿性較差。

圖9　基因工程片球菌對(duì)酸堿的耐受性Fig.9　The tolerance of gene engineering pedioin under different pH

基因工程片球菌素經(jīng)胰蛋白酶(在pH8),胃蛋白酶(pH1.5～pH2.5),木瓜蛋白酶(pH6.0～pH7.0)和蛋白酶K處理處理后對(duì)單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌不產(chǎn)生抑菌作用,說明基因工程片球菌素可以被上述酶降解,此性質(zhì)也與天然乳酸片球菌素的性質(zhì)相同[18],兩者在消化道內(nèi)均可以被分解,對(duì)人體不產(chǎn)生毒副作用。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了自動(dòng)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)E.coliBL21(DE3)基因工程菌表達(dá)基因工程片球菌素,這種方法適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)基因工程片球菌素,其產(chǎn)量?jī)?yōu)于IPTG誘導(dǎo)方法。對(duì)片球菌素融合蛋白經(jīng)過稀釋復(fù)性,腸激酶酶切,Ni柱純化,成功得到了具有抑制單核細(xì)胞增多癥李氏桿菌抑菌活性的基因工程片球菌素,其熱穩(wěn)定性好,經(jīng)121 ℃高壓處理后仍顯示出部分抑菌活性,在pH1～pH7范圍內(nèi)活性穩(wěn)定,pH7～pH14范圍內(nèi)活性逐漸下降,可以被胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K降解。

[1]Fimland G,Johnsen L,Dalhus B,et al. Pediocin-like antimicrobial peptides(class IIa bacteriocins)and their immunity proteins:biosynthesis,structure,and mode of action[J]. Journal of Peptide Science,2005,11(11):688-696.

[2]Díez L,Rojo-Bezares B,Zarazaga M,et al. Antimicrobial activity of pediocin PA-1 against Oenococcus oeni and other wine bacteria[J]. Food microbiology,2012,31(2):167-172.

[3]Nieto-Lozano J C,Reguera-Useros J I,Peláez-Martínez M C,et al. The effect of the pediocin PA-1 produced by Pediococcus acidilactici againstListeriamonocytogenesand Clostridium perfringens in Spanish dry-fermented sausages and frankfurters[J]. Food Control,2010,21(5):679-685.

[4]Elegado F B,Kim W J,Kwon D Y. Rapid purification,partial characterization,and antimicrobial spectrum of the bacteriocin,

Pediocin AcM,from Pediococcus acidilactici M[J]. International Journal of Food Microbiology,1997,37(1):1-11.

[5]Anastasiadou S,Papagianni M,Filiousis G,et al. Pediocin SA-1,an antimicrobial peptide from Pediococcus acidilactici NRRL B5627:Production conditions,purification and characterization[J]. Bioresource Technology,2008,99(13):5384-5390.

[6]Guerra N P,Agrasar A T,Macías C L. Modelling the fed-batch production of pediocin using mussel processing wastes[J]. Process Biochemistry,2005,40(3-4):1071-1083.

[7]Renye J A Jr,Somkuti G A,Garabal J I,et al. Heterologous production of pediocin for the control ofListeriamonocytogenesin dairy foods[J]. Food Control,2011,22(12):1887-1892.

[8]Studier F W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures[J]. Protein Expression and Purification,2005,41(1):207-234.

[9]Xu JL,Banerjee A,Pan SH. Galactose can be an inducer for production of therapeutic proteins by auto-induction usingE.coliBL21 strains[J]. Protein Expression and Purification,2012,83(1):30-36.

[10]Sarduy E S,Muoz A C,Trejo S A,et al. High-level expression of Falcipain-2 inEscherichiacoliby codon optimization and auto-induction[J]. Protein Expression and Purification,2012,83(1):59-69.

[11]Yu SJ,Wang YX,Liu YS,et al. Expression and purification of APRIL by auto-induction[J]. Protein Expression and Purification,2009,68(1):49-53.

[12]Singh S M,Panda A K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2005,99(4):303-310.

[13]王增,馬會(huì)勤,張文,等. 包涵體蛋白的分離和色譜法體外復(fù)性純化研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生物工程雜志,2009,29(7):102-107.

[14]Chow M K M,Amin A A,Fulton K F,et al. REFOLD:An analytical database of protein refolding methods[J]. Protein Expression and Purification,2006,46(1):166-171.

[15]李亞玲,周志江,韓燁,等. 乳酸片球菌細(xì)菌素的分離純化及理化性質(zhì)[J]. 食品工業(yè)科技,2007,28(8):94-97.

[16]Cabrita L D,Bottomley S P. Protein expression and refolding-a practical guide to getting the most out of inclusion bodies[J]. Biotechnology annual review,2004,10:31-50.

[17]Kudou M,Yumioka R,Ejima D,et al. A novel protein refolding system using lauroyl-l-glutamate as a solubilizing detergent and arginine as a folding assisting agent[J]. Protein Expression and Purification,2011,75(1):46-54.

[18]韓雪,周志江. 乳酸片球菌細(xì)菌素的活性及特性的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2006,27(4):19-21.

Expression of Pediocin fusion protein in auto-induced system

TAN Xi-qian,HAN Ye,XIAO Hua-zhi,ZHOU Zhi-jiang*

(Department of Food Science and Engineering,School of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,China)

IPTG induction and auto-induction methods were used to express Pediocin fusion protein in gene engineeringE.coliBL21(DE3). Direct dilution method was used to refold the inclusion body of Pediocin fusion protein,Ni-IDA agarose resin column was used to separate Pediocin fusion protein,and rEK-B was used to cut the fusion protein in order to obtain target Pediocin,oxford cup method was used to test the antimicrobial activity of target Pediocin usingListeriamonocytogenesas an indicator. The results indicated that after cultivation,the ultimate OD600and the protein concentration of IPTG induction and auto-induction were 3.5000,0.1001 mg/mL and 7.6998,0.2359 mg/mL respectively. The yield of fusion protein was higher in the auto-induction system. The target Pediocin displayed antiseptic activity towardListeriamonocytogenes,and had high acid resistance ability as well as low alkali resistance ability,and can be digested by trypsin,pepsin,papain and proteinase K. Auto-induction could be applied in gene engineeringE.coliBL21(DE3)to achieve pediocin.

auto-induction;IPTG;inclusion body;purification;antimicrobial activity

2015-12-14

檀茜倩(1985-),女,博士研究生,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:xiqiantan@tju.edu.cn。

周志江(1960-),男,博士,教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:zzj@tju.edu.cn。

天津科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(13ZCDNC01900)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0170-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.025