裴慶慧,王　玥,劉宇瑩,田平芳,李　映,葛喜珍,3,*

(1.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院,北京 100023;2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院,北京 100029；3.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室,北京 100023)

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五種中藥材乙醇提取物對植物病原真菌的抑制作用研究

裴慶慧1,王玥1,劉宇瑩1,田平芳2,李映1,葛喜珍1,3,*

(1.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院,北京 100023;2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院,北京 100029；3.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室,北京 100023)

本文研究了山豆根、白頭翁、紫花地丁、穿心蓮和青皮五種中藥材提取物對桃褐腐病、馬鈴薯干腐病、甘藍枯萎病、番茄灰霉病、小麥赤霉病、蘋果輪紋病及棉花枯萎病等七種病原菌的抑制作用。結(jié)果表明除甘藍枯萎病外,山豆根、青皮、穿心蓮提取物對其余六種植物病原菌的抑制效果明顯,且青皮抑菌譜較廣。穿心蓮提取物對桃褐腐病菌有較強的抑制作用,EC50為3.57 mg/mL,MIC為100 mg/mL,MBC為150 mg/mL,穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯抑制桃褐腐病菌的EC50為456.36 μg/mL。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯處理后的桃褐腐病菌,菌絲有褶皺,塌陷增多,推測是穿心蓮內(nèi)酯破壞了細胞壁或細胞膜,使細胞通透性改變,導致細胞質(zhì)外泄。

中藥材提取物,植物病原真菌,抑菌

植物病原真菌對各種果蔬植物危害嚴重,造成巨大經(jīng)濟損失[1]。目前化學農(nóng)藥仍是控制果蔬病害的有效手段,但植物病原菌對化學合成農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的報道逐年增加[2],尤其是在食品安全問題備受重視的今天,開發(fā)安全有效的植物病害控制新農(nóng)藥、保障食品安全勢在必行。植物源農(nóng)藥因其低毒環(huán)保的特點廣受關(guān)注,成為研究熱點[3]。

山豆根(Sophoratonkinensisgagnep)、白頭翁(Pulsatillachinensis)、紫花地丁(Herbaviolae)、穿心蓮(Andrographispaniculata)、青皮(Pericarpiumcitrireticulataeviride)五種藥材均有抗炎、抗腫瘤功效,且抗菌效果顯著[4-9]。目前,對于上述五種中藥材側(cè)重其對細菌抑制作用的研究[10],而針對植物病原菌的報道甚少。本文選擇桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumsambucinum)、甘藍枯萎病菌(Fusariumverticillioides)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Gibberellazeae)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriaberengeriana)和棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)等蔬菜和果樹生產(chǎn)中常見、發(fā)病率高的植物病原真菌,研究上述五種中藥材提取物對這七種植物病原真菌的抑制作用,以期為開發(fā)植物源農(nóng)藥奠定基礎。

表1　提取物加藥培養(yǎng)基濃度梯度一覽表Table 1　Gradient concentrations of plant extracts

1　材料與方法

1.1材料與儀器

番茄灰霉病菌(B.cinerea;ATCC 11542)、甘藍枯萎病菌(F.verticillioides;ATCC MYA-3629)、馬鈴薯干腐病菌(F.sambucinum;ATCC MYA-3629)、蘋果輪紋病菌(B.berengeriana;ATCC 12557),桃褐腐病菌(M.fructicola;ATCC 42248)、小麥赤霉病菌(G.zeae;CICC 40527)、棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum;ATCC 7808)由河北農(nóng)業(yè)大學植保學院楊文香教授提供。

山豆根(生產(chǎn)批號:1006159101;生產(chǎn)日期:20140908)、白頭翁(生產(chǎn)批號:10008559055;生產(chǎn)日期:20131208)、紫花地丁(生產(chǎn)批號:1007157171;生產(chǎn)日期:20140808)、穿心蓮(生產(chǎn)批號:1026159101;生產(chǎn)日期:20140123)、青皮(生產(chǎn)批號:10063997001;生產(chǎn)日期:20131231)購自安國市長安中藥材有限公司;穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide,含量98%,批號:HY20141021)購自陜西天之潤生物科技有限公司。

MS105電子天平北京北方首衡電子科技有限公司;HH-S26恒溫水浴鍋常州中捷實驗儀器制造有限公司;PS-40A超聲波清洗機深圳市超藝達科技有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器;HC014-11-018-01(X)立式滅菌鍋上海東亞壓力容器制造有限公司;ZHJH-C1106C超凈臺上海智城分析儀器制造有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;LWD300-38LT顯微鏡北京測圍光電;JSM-6701F掃描電鏡電鏡日本電子。

1.2實驗方法

1.2.1提取物制備分別將山豆根、白頭翁、紫花地丁、穿心蓮、青皮洗凈,40 ℃烘干,粉碎,過20目篩。每種藥材稱取250 g分別加入1500 mL 75%乙醇,40 ℃超聲30 min,80 ℃加熱回流1 h,重復兩次。抽濾,減壓蒸餾,定容至250 mL,紫外照射24 h,制成1 g生藥每毫升儲備液,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2提取物對病原菌敏感性測定采用菌絲生長速率法測定五種中藥提取物分別對七種病原菌的抑制效果。取5 mL 儲備液,加至95 mL PDA培養(yǎng)基,搖勻,制成加藥培養(yǎng)基。另取5 mL蒸餾水加至95 mL PDA培養(yǎng)基中作空白對照。用直徑0.8 cm打孔器取菌餅,接種至PDA固體培養(yǎng)基。每個處理重復5次,28 ℃培養(yǎng)。番茄灰霉病菌、甘藍枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌培養(yǎng)12 h后每12 h用十字交叉法測量菌落直徑,馬鈴薯干腐病菌、桃褐腐病菌、棉花枯萎病菌36 h后每12 h測菌落直徑。計算抑制率式(1)[11],同時比較空白組和加藥處理組菌落直徑,篩選出五種提取物中對上述病原菌最佳抑制效果的藥材提取物。

抑制率(%)=100×(空白組菌落直徑-加藥處理組菌落直徑)/空白組菌落直徑

式(1)

1.2.3提取物對植物病原菌毒力測定針對1.2.2實驗結(jié)果,選取抑制效果好且抑制率達50%的山豆根、青皮、穿心蓮提取物按表1配制加藥培養(yǎng)基濃度,進行毒力測定。計算抑制率式(1)[12]。根據(jù)機率值換算表,將抑制百分率換算成抑制機率值。以實驗中設定的濃度對數(shù)為橫坐標,抑制機率值為縱坐標,計算毒力回歸方程和半數(shù)最大效應濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)。梯度濃度的提取物加藥培養(yǎng)基配制方法如下所述,以每個濃度梯度配置50 mL 山豆根加藥培養(yǎng)基為例:將煮好的土豆過濾得濾液,并按比例加入葡萄糖(2 g葡萄糖/100 mL),得培養(yǎng)基備用液A;取25.6 mL(1 g/mL)儲備液,旋蒸至浸膏狀(盡量蒸干溶劑),后用100 mL A液將其分多次小心洗出至250 mL錐形瓶,混勻,即得100 mL濃度256 mg/mL ①液;取50 mL ①液+50 mL A液混勻即得100 mL 25 mg/mL ②液;取50 mL②液+50 mL A液混勻,即得100 mL 12.5 mg/mL ③液,依次類推,二倍稀釋;最后分別在①②③等不同濃度培養(yǎng)液中按比例(1.5 g瓊脂/100 mL)加入瓊脂,得到不同加藥濃度的PDA培養(yǎng)基。

1.2.4提取物最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC),最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)測定針對1.2.2篩選的中藥材測定其MIC值和MBC值。設置不同濃度的加藥培養(yǎng)基,山豆根抑制番茄灰霉病菌(50、75、100、125、150 mg/mL),青皮抑制馬鈴薯干腐病菌(50、75、100、125、150、175 mg/mL),青皮抑制棉花枯萎病菌(100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350 mg/mL),青皮抑制蘋果輪紋病菌(100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350 mg/mL),穿心蓮抑制桃褐腐病菌(75、100、125、150、175 mg/mL),青皮抑制小麥赤霉病菌(50、75、100、125、150、175 mg/mL)將菌餅接種至培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng),12 h后觀察培養(yǎng)基上番茄灰霉病菌、甘藍枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌的菌絲生長情況,無菌絲生長,則該濃度即為其MIC值,72 h后未見菌絲生長的濃度即為其MBC值。48 h后觀察馬鈴薯干腐病菌、桃褐腐病菌、棉花枯萎病菌的菌絲生長情況,無菌絲生長的濃度即為其MIC值,120 h后無菌絲生長的為其MBC值[13-14]。

表2　中藥材提取物對植物病原菌在不同生長階段的抑制率Table 2　Inhibitory rates of extracts against pathogen fungi during different periods

注:“—”表示未測定。

1.2.5藥物處理后對菌絲形態(tài)的影響針對1.2.4篩選的中藥材,配制空白PDA培養(yǎng)基和EC50濃度的加藥培養(yǎng)基,番茄灰霉病菌、甘藍枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌培養(yǎng)48 h后,制片,棉蘭染色,光學顯微鏡下觀察;馬鈴薯干腐病菌、桃褐腐病菌、棉花枯萎病菌培養(yǎng)96 h后觀察。每個處理設5個重復。

1.2.6穿心蓮內(nèi)酯(98%)對桃褐腐病菌毒力測定方法同1.2.3,穿心蓮內(nèi)酯(98%)的濃度梯度為1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。

1.2.7穿心蓮內(nèi)酯處理桃褐腐病菌電鏡觀察采用1.2.4的方法,設置穿心蓮內(nèi)酯空白對照和EC50對照組,采集菌絲涂于蓋玻片,用1%戊二醛溶液固定8 h,后用0.15%戊二醛淋洗;用濃度分別為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇梯度洗脫5 min;100%乙醇洗10 min,重復兩次;真空冷凍干燥;將樣品固定到樣品臺上,噴金;掃描電鏡觀察[15]。

1.2.8數(shù)據(jù)處理用SPSS23.0進行數(shù)據(jù)處理,所給出的數(shù)據(jù)均為平均值±標準差;Origin8.5繪圖。

2　結(jié)果與討論

2.1五種藥材提取物對七種植物病原菌的抑制作用

5種中藥材對7種不同供試植物病原菌均有一定抑制作用。通過加藥組與空白組對比,5種藥材提取物均能抑制病原菌的生長(圖1)。在相同濃度(5 mg/mL)時,在菌落生長的各個階段,山豆根對番茄灰霉病菌抑制效果最好,抑制率在50%以上;青皮對甘藍枯萎病菌抑制效果最好,抑制率在50%以上;青皮對馬鈴薯干腐病菌的抑制效果最好,抑制率達50%以上;青皮對甘藍枯萎病菌抑制效果最好，抑制率在50%左右；青皮對棉花枯萎的抑制效果最好,抑制率達54%以上;青皮對蘋果綸紋抑制效果最好,抑制率達54%以上;穿心蓮對桃褐腐病菌的抑制效果最好,抑制率達75%以上;青皮對小麥赤霉病菌的抑制效果最好,抑制率為52%以上。在上述篩選結(jié)果中,對抑制率達50%以上的藥材提取物進行毒力測定(表2)。

圖1　5種中藥提取物分別對7種病原菌的抑制效果Fig.1　Inhibition of 5 plant extracts against 7 plant pathogen fungi注：A番茄灰霉病菌;B甘藍枯萎病菌;C馬鈴薯干腐病菌;D棉花枯萎病菌;E蘋果輪紋病菌;F桃褐腐病菌;G小麥赤霉病菌。

2.2毒力測定結(jié)果

通過測定不同濃度梯度藥材提取物對植物病原菌的抑制率,得毒力回歸方程(表3)。山豆根抑制番茄灰霉病菌EC50為39.44 mg/mL。青皮抑制馬鈴薯干腐病菌EC50為24.2 mg/mL,青皮抑制棉花枯萎病菌EC50為19.03 mg/mL,青皮抑制蘋果輪紋病菌EC50為26.89 mg/mL,青皮抑制小麥赤霉病菌EC50為10.42 mg/mL。青皮對不同病原菌的EC50為19～27 mg/mL左右,對于不同病原菌其EC50對相差并不大,其對不同病原菌的抑菌活性穩(wěn)定。穿心蓮抑制桃褐腐病菌EC50僅為3.57 mg/mL,抑菌效果顯著。本實驗中穿心蓮抑制桃褐腐菌的EC50值最小,抑菌效果最好。

2.3MIC和MBC測定結(jié)果

MIC和MBC值測定結(jié)果如表4,山豆根抑制番茄灰霉病菌MIC為250 mg/mL,MBC為325 mg/mL,山豆根抑制番茄灰霉病菌的MIC和MBC值偏大,可以與其他藥材復配使用。青皮抑制馬鈴薯干腐病菌MIC為75 mg/mL,MBC為150 mg/mL,青皮抑制棉花枯萎病菌MIC為275 mg/mL,MBC為325 mg/mL,青皮抑制蘋果輪紋病菌 MIC為300 mg/mL,MBC為大于325 mg/mL,青皮抑制小麥赤霉病菌MIC為125 mg/mL,MBC為250 mg/mL,青皮對不同植物病原菌的MIC值范圍為75～300 mg/mL,MBC值為125～325 mg/mL,跨度范圍較大,說明針對不同病原菌青皮的殺菌活性有一定差別。穿心蓮抑制桃褐腐病菌MIC為100 mg/mL,MBC為150 mg/mL,抑菌效果顯著。

表3　中藥材提取物對不同病原菌的相對毒力Table 3　Toxicity of extracts against plant pathogen fungi

2.4藥材提取物對菌絲形態(tài)的影響

番茄灰霉病菌、馬鈴薯干腐病菌、棉花枯萎病菌、蘋果輪紋病菌、桃褐腐病菌、小麥赤霉病菌正常形態(tài)的菌絲圖和藥物處理后的菌絲圖(圖2)。不同植物病原菌的正常菌絲雖形態(tài)不同,但粗細均勻、飽滿,菌絲表面光滑,桃褐腐病菌有孢子產(chǎn)生、孢子飽滿。處理組與對照組相比,番茄灰霉病菌菌絲扭曲,分支增多;馬鈴薯干腐病菌菌絲橫隔增多,有明顯的菌絲斷裂消融現(xiàn)象;棉花枯萎病菌菌絲彎曲、斷裂;蘋果輪紋病菌菌絲分支增多,有明顯斷裂;桃褐腐病菌菌絲嚴重扭曲,幾乎未見孢子產(chǎn)生;小麥赤霉病菌菌絲扭曲,分支、隔膜增多。

表4　中藥材提取物對不同病原菌MIC和MBCTable 4　The MIC and MBC of different extracts against plant pathogen fungi

圖2　藥材提取物對植物病原菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2　Inhibitory effects of extracts on mycelium morphology of plant pathogen fungi注：1:對照組,2:處理組,放大倍數(shù)4×10;A:山豆根抑制番茄灰霉病菌;B:青皮抑制馬鈴薯干病;C:青皮抑制棉花枯萎病;D:青皮抑制蘋果輪紋病菌;E:穿心蓮抑制桃褐腐病菌;F:青皮抑制小麥赤霉病菌。

2.5穿心蓮內(nèi)酯對桃褐腐病菌抑制效果毒力測定

篩選結(jié)果表明,穿心蓮對桃褐腐病菌EC50最小,且在各個生長階段,穿心蓮對桃褐腐病菌的抑制率均在80%左右(表2),MIC和MBC較小。故檢測了穿心蓮主要成分穿心蓮內(nèi)酯對桃褐腐病菌的抑制效果。如表3所示,穿心蓮內(nèi)酯對桃褐腐病菌EC50為456.36 μg/mL。

2.6穿心蓮內(nèi)酯對桃褐腐病菌菌絲形態(tài)的影響

由圖3可知,對照組菌絲表面光滑飽滿,穿心蓮內(nèi)酯處理后的菌絲粗細不一,褶皺,塌陷增多。推測穿心蓮內(nèi)酯可能破壞了菌絲結(jié)構(gòu)或影響菌絲生長,使細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞,改變了細胞通透性,導致細胞質(zhì)外泄。

圖3　穿心蓮內(nèi)酯處理前后桃褐腐病菌菌絲形態(tài)Fig.3　Mycelium morphology of M. fructicola before and after treatment by andrographolide注：A:對照,B:EC50濃度穿心蓮內(nèi)酯處理;放大倍數(shù)×2000。

3　結(jié)論

本文研究了具抗菌潛力的山豆根、白頭翁、紫花地丁、穿心蓮、青皮五種中藥材粗提物對桃褐腐病菌、馬鈴薯干腐病菌、甘藍枯萎病菌、番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌和棉花枯萎病菌七種植物病原菌的抑菌效果。結(jié)果表明,每種提取物對供試植物病原菌的生長均有一定抑制效果,且對不同植物病原菌的抑制效果不同。

青皮對馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、棉花枯萎病菌多種植物病原菌的抑制效果均最佳,推測青皮抑菌譜相對較廣。本研究所用青皮為蕓香科植物橘(P.citrireticulataeviride)及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實果皮,主要含有黃酮、檸檬烯和β-月桂烯等[16],疏肝破氣消積化滯。翟梅枝[17]等研究發(fā)現(xiàn)核桃青皮乙醇提取物對34種植物病原真菌和5種細菌均有一定抑制活性,抑菌譜廣。喬永剛[18]和任天偉[19]的研究表明,用不同的溶劑進一步萃取核桃青皮的醇提物,得到的精制成分抑菌活性更顯著。核桃青皮又稱青龍衣,為核桃楸(JuglandmandshuricaMaxim)和核桃(Juglansregial)的未成熟外果皮,主要成分是黃酮類、醌類和酚類等[20]。青皮(GreenTangerinePeel)與核桃青皮(walnut green)統(tǒng)稱青皮,但來源、成分不均同,研究表明二者均有顯著抑菌效果。后續(xù)可對青皮提取物中的黃酮、檸檬烯和β-月桂烯等成分進行具體的分離分析,探究其抑菌作用的主要成分和萃取方法,降低其EC50值。

本研究首次發(fā)現(xiàn)穿心蓮粗提物對桃褐腐病菌有明顯抑制效果,粗提物EC50為3.57 mg/mL,且在菌落生長的各個時期,其抑制率均能達到80%左右。穿心蓮的主要活性成分為穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯[21],王艷輝對于不同產(chǎn)地穿心蓮藥材進行研究,結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯含量較高的樣品,抑菌活性也較好[22]。本研究測得穿心蓮內(nèi)酯抑制桃褐腐病菌EC50為456.36 μg/mL(約0.46 mg/mL)。通過電鏡觀察,推測穿心蓮內(nèi)酯的抑菌機制可能是損壞了植物的細胞壁、細胞膜或是阻礙了細胞壁或細胞膜的形成。

目前,關(guān)于植物源農(nóng)藥的抑菌機制報道較少[23],后期將在明確主要抑菌成分和抑菌機制的基礎上通過合適的復配制備高效廣譜的植物源殺菌劑。

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Inhibition of five Chinese medicinal Herb extracts against plant pathogen fungi

PEI Qing-hui1,WANG Yue1,LIU Yu-ying1,TIAN Ping-fang2,LI Ying1,GE Xi-zhen1,3,*

(1.College of Biochemical Engineering,Beijing Union University,Beijing 100023,China;2.College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China;3.Beijing Key Laboratory of Biomass Waste Resource Utilization,Beijing 100023,China)

The antifungal activities of Chinese herbs ofSophoratonkinensisgagnep,Pulsatillachinensis,Herbaviolae,AndrographispaniculataandPericarpiumcitrireticulataevirideagainst seven different plant pathogenic fungi includingBotrytiscinerea,Fusariumverticillioides,Fusariumsambucinum,Botryosphqeriadothidea,Moniliniafructicola,Fusahumgraminearum,andFusariumoxysporumf. sp.vasinfectumwere investigated. The results showed thatRadixetrhizomesophorae,AndrographispanniculataandPericarpiumcitrireticulataevirideobviously inhibited these pathogen fungi with the exception ofF.verticillioides，andPericarpiumcitrireticulataeviridehad a broad antifungal spectrum. Specially,the EC50,MIC,and MBC ofAndrographispanniculataagainstM.fructicolawere 3.57 mg/mL,100 mg/mL and 150 mg/mL,respectively. Moreover,andrographolide,the main ingredient ofAndrographispanniculata,showed strong inhibition againstM.fructicola,and the EC50was 456.36 μg/mL. Scanning electron microscope analysis revealed that the mycelia manifested abnormity including corrugation and collapse. So it could be hypothesized that andrographolide damaged the cell wall and cytomembrane,which leaded to leakage of cytoplasm.

Chinese medicinal herb extracts;pathogenic fungi;antifungal activity

2016-01-27

裴慶慧(1989-),女,碩士研究生,從事微生物代謝研究,E-mail:1014461652@qq.com。

葛喜珍(1968-),女,博士,教授,從事植物源農(nóng)藥和微生物代謝研究,E-mail:gexizhen@163.com。

北京市教育委員會創(chuàng)新能力提升計劃項目(2015,PXM2015_014209_000010)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0090-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.009