詹　偉,曾令亭,方　正,施　思,張傳博,翁慶北

(貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001)

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香樟內(nèi)生細菌的分離與發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性評價

詹偉,曾令亭,方正,施思,張傳博,翁慶北*

(貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550001)

目的:分離香樟內(nèi)生細菌,評價內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性,為香樟開發(fā)及其內(nèi)生細菌作為天然抗氧化活性物奠定基礎。方法:采用組織塊分離和組織勻漿法分離香樟內(nèi)生細菌,通過測定發(fā)酵上清液的總還原力,以及其對DPPH自由基、超氧自由基和羥自由基等的清除能力,評價內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性,并通過16S rRNA基因序列分析對內(nèi)生細菌進行初步鑒定。結果:從香樟枝條、葉及果實等組織中共獲得64株內(nèi)生細菌,總還原力測定表明67.19%內(nèi)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物具抗氧化活性。香樟內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力強于對超氧自由基和羥自由基的清除能力。其中,對DPPH自由基具清除能力的內(nèi)生菌占62.50%,平均清除率為73.96%;對超氧自由基具清除能力的占12.50%,平均清除率為16.49%;對羥自由基具清除能力的僅占6.25%,平均清除率為6.07%。初步鑒定表明,具抗氧化活性的內(nèi)生細菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus)。結論:香樟內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物具較強的抗氧化活性,可作為篩選開發(fā)天然抗氧化劑的潛在資源。

香樟,內(nèi)生細菌,抗氧化活性,芽孢桿菌

機體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生許多活性氧,當體內(nèi)自由基含量過高時,其與生物大分子結合可造成機體損傷,引發(fā)癌癥、關節(jié)炎、心血管等疾病[1]。通過補充抗氧化物質(zhì)可以增強機體的抗氧化能力。因此,開發(fā)綠色、安全的天然抗氧化物對延緩人體衰老,預防某些疾病具有重要意義。

植物內(nèi)生細菌指全部或部分階段生活在植物組織或器官內(nèi),對宿主植物不會引起明顯病害的細菌[2-4]。內(nèi)生菌存在于絕大多數(shù)植物中,可產(chǎn)生與植物宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物,具有抗菌、抗氧化、抗癌和抗炎等多種生物活性[4-5]。目前,已從杜仲[6]、虎皮檀[7]、德國鳶尾[8]、交讓[9]等許多植物中分離到了具抗氧化活性的內(nèi)生菌,因此,植物內(nèi)生菌可作為尋找新的天然產(chǎn)物和開發(fā)新藥的重要資源。

香樟(Cinnamomumcamphora)是我國長江流域及以南地區(qū)的優(yōu)良木材、油料和藥材樹種,具驅(qū)蟲、防腐耐蛀的功能。香樟果實和葉等組織中含有槲皮素、山奈素和異鼠李素黃酮類化合物及多糖等活性成分[10-11],具有清除人體自由基、抗腫瘤、抗炎癥等多種生理活性功能[12-14],這為從香樟中分離具生理活性的內(nèi)生菌資源提供了理論基礎。已有研究報道了香樟內(nèi)生菌具有較好的抑菌活性[15-16],但鮮見香樟內(nèi)生菌抗氧化活性的研究。本研究從香樟葉、枝條及果實等組織中分離內(nèi)生細菌,并測定了內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物的總還原力和自由基清除能力,為進一步開發(fā)利用香樟及其內(nèi)生菌作為天然抗氧化活性物質(zhì)奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香樟枝條、葉及果實等組織于2012年5月采自貴州師范大學校園內(nèi)。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蛋白酶K等購自Sigma公司、pMD18-T/A克隆試劑盒、HhaI和HaeIII等購自Takara公司;溴代十六烷基三甲胺(CTAB)購自北京索萊寶科技有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV759CRT紫外可見分光光度計上海佑科儀器儀表有限公司;TS-200B恒溫搖床上海天星實驗儀器制造廠;SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋HIRAYAMA公司;TG16-W微量高速離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司;JR2003N電子天平上海精密科學儀器有限公司;DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋天津泰特儀器有限公司;BS97MyCycler PCR儀Bio-Rad公司;DYY-2C電泳儀電源、DYCP-31DN電泳儀北京六一生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸餾水1000 mL。固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15 g。

1.2.2內(nèi)生細菌的分離新鮮香樟組織沖洗、晾干后,內(nèi)生細菌通過常規(guī)植物組織塊分離法和組織勻漿分離。將枝條、葉及果實等各5 g,75%乙醇浸泡60 s,無菌水沖洗3次,濾紙吸干,0.1%升汞浸泡30 s,無菌水沖洗5次。將表面消毒處理后的各組織剪切成0.5～1 cm的小塊置平板上,或置于研缽中,并加入少量的無菌水和石英砂研磨,研磨勻漿梯度稀釋后再涂布于牛肉膏蛋白胨平板,37 ℃培養(yǎng)2～3 d,挑取單菌落純化后轉(zhuǎn)接于試管斜面4 ℃保存。最后一次清洗組織的無菌水涂布平板,對表面消毒進行驗證。

1.2.3內(nèi)生細菌發(fā)酵上清液的制備挑取少量菌苔接種至5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h(OD600=1.50～1.70),取0.5 mL活化后的菌液加至5 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,37 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后,3000 r/min離心10 min,上清液用于抗氧化活性測定。

1.2.4抗氧化活性的測定

1.2.4.1總還原力的測定參照文獻[17],略作改動。在0.5 mL待測上清液中加入0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.6)和0.5 mL 1%鐵氰化鉀,50 ℃水浴20 min后,急速冷卻。再加入0.5 mL 10%三氯乙酸,3000 r/min離心5 min,取上清液1.0 mL,加入1.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.1%三氯化鐵,混合均勻,10 min后,測定700 nm處的吸光度值(As)。以培養(yǎng)基代替待測液作為空白對照。不同濃度的VC為對照,繪制標準曲線。同一樣品3次平行。

1.2.4.21,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力的測定參照文獻[18],略作改動。取0.5 mL待測上清液與2 mL 65 μmol/L DPPH乙醇溶液混合,靜置25 min后,測定517 nm處的吸光度值(As)。用0.5 mL樣品液與2.5 mL乙醇混合液調(diào)零,以培養(yǎng)基代替待測液作為空白對照(A0),不同濃度的VC為對照,繪制標準曲線。同一樣品3次平行。

清除率(%)=(A0-As)/A0×100

1.2.4.3羥自由基清除能力的測定參照文獻[19],略作改動,將0.2 mL待測上清液與1.0 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵銨溶液、1.0 mL 7.5 mmol/L水楊酸溶液和1.0 mL 7.5 mmol/L過氧化氫溶液混合,靜置1 h后,測定510 nm處的吸光度值(As)。以培養(yǎng)基代替待測液作為空白對照(A0),不同濃度的VC為對照,繪制標準曲線。同一樣品3次平行。

清除率(%)=(A0-As)/A0×100

1.2.4.4超氧自由基清除能力的測定參照文獻[20],略作改動。取4.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)于試管中,加入1.0 mL 1.0 mmol/L乙二胺四乙酸、1.0 mL待測上清液和2.4 mL蒸餾水,25 ℃保溫10 min后,加入2.0 mL 9.0 mmol/L鄰苯三酚,反應60 min后,加入100 μL 12.0 mol/L HCl終止反應。測定325 nm處的吸光度(As)。以培養(yǎng)基代替待測液作為空白對照(A0),不同濃度的VC為對照,繪制標準曲線。同一樣品3次平行。

清除率(%)=(A0-As)/A0×100

1.2.5內(nèi)生細菌分子鑒定參照文獻[21],將菌株過夜培養(yǎng)后,3000 r/min離心10 min收集菌體沉淀,CTAB法提取菌株DNA。采用細菌通用引物對27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′),PCR擴增內(nèi)生細菌16S rRNA基因片段。擴增產(chǎn)物分別用HhaⅠ和HaeⅢ進行酶切,2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)酶切圖譜的帶型劃分為不同的分類單元。挑取代表菌株,將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接后,轉(zhuǎn)化DH5α,利用引物對M13-F(5′-TGTAAAACG ACGGCCAGT-3′)和M13-R(5′-CAGGAAACAGC TATGACC-3′),菌液PCR鑒定重組子,陽性克隆送北京博邁德公司測序。測序后的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。

2　結果與分析

2.1香樟內(nèi)生細菌的分離

從香樟組織中共分離出64株內(nèi)生細菌,其中從枝條中分離出22株,葉中分離出22株,果實中分離出20株。植物組織表面消毒最后一次清洗液涂布平板,37 ℃培養(yǎng)2～3 d后未見菌落生長,表明表面消毒徹底。

表1　香樟內(nèi)生菌總還原力的測定Table 1　Total reducing power of endophytic bacteria from Cinnamomum camphor

注:XZJ、XZY和XZG分別表示從香樟枝條、葉和果實中分離的內(nèi)生菌,表2、表3同。

2.2內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性

2.2.1總還原力的測定將分離的64株香樟內(nèi)生細菌發(fā)酵培養(yǎng)后,上清液用于抗氧化活性的測定?？傔€原力測定結果表明,共43株香樟內(nèi)生細菌(占67.19%)具有抗氧化能力,其中13株分離自枝條,16株分離自葉,14株分離自果實,分別占各組織分離總菌數(shù)的59.09%、72.73%和70.00%(表1)。不同部位分離的內(nèi)生菌和不同菌株抗氧化活性不同,果實(72.82 μmol/L VC)和葉(71.77 μmol/L VC)內(nèi)生菌的平均總還原力高于枝條內(nèi)生菌的(55.91 μmol/L VC),其中還原力最強的為XZG-4、XZG-8、XZG-9、XZG-10及XZY-6,總還原力高于90.00 μmol/L VC,從枝條中分離的XZJ-18最低。

2.2.2清除DPPH自由基的能力通過DPPH分光測定法表明,共有40株內(nèi)生細菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有較明顯的清除DPPH自由基能力,占總分離菌株的62.50%,其中從枝條、葉、果實等不同組織中分離的菌株數(shù)為13株、15株和12株,分別占各組織分離總菌數(shù)的59.09%、68.18%和60.00%(表2)。不同部位分離的內(nèi)生菌和不同菌株對DPPH自由基清除能力略有差異。對DPPH自由基清除能力平均值最高的為果實(76.30%),其次為葉(72.94%)和枝條(72.63%)，平均為73.96%。大部分菌株的DPPH自由基清除能力高于70.00%,枝條中分離的XZJ-14、XZJ-19、XZJ-22、XZJ-24以及葉中分離的XZY-27清除率低于70.00%,分別為68.44%、65.55%、66.16%、69.00%和66.21%;分離自葉中的XZY-20、果實中的XZG-6和XZG-8的清除率則高于80.00%,分別為82.19%、80.56%和81.13%。

2.2.3清除羥自由基的能力測定香樟內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物對羥自由基的清除能力。如表2所示,具有羥自由基清除能力的香樟內(nèi)生細菌較少且清除率較低,僅4株內(nèi)生細菌具有清除羥自由基的能力,包括1株從葉中分離的和3株從果實中分離的內(nèi)生菌,占分離菌株總數(shù)的6.25%,清除率在5.11%～6.78%之間，平均清除率為6.07%，這可能與菌株需在氧化應激條件下誘導分泌表達對羥自由基有清除活性物質(zhì)有關,當環(huán)境中缺乏刺激條件時,其表達量較低或不表達[22]。

2.2.4清除超氧自由基能力香樟內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物對超氧自由基的清除率如表2所示。共有8株內(nèi)生細菌具有清除超氧自由基的能力,占分離菌株總數(shù)的12.50%,平均清除率為16.49%,其中5株分離自果實,另3株分別分離自枝條和葉。其中,除了從果實中分離的XZG-3和XZG-9的清除率分別為32.92%、4.39%,差異較顯著外,其余6株內(nèi)生菌的清除率在12.13%～17.54%之間。

表2　香樟內(nèi)生細菌對DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基的清除作用Table 2　DPPH,hydroxyl and superoxide free radical scavenging activity of endophytic bacteria from Cinnamomum camphor

表3　抗氧化活性內(nèi)生菌16S rRNA基因序列比對結果Table 3　BLAST results of the antioxidant endophytic bacteria based on 16S rRNA gene sequence

2.3抗氧化活性內(nèi)生菌的初步鑒定

將具抗氧化活性內(nèi)生菌培養(yǎng),提取總DNA,16S rRNA基因擴增產(chǎn)物酶切分析后,將這些菌株分為4個分類單元(表3)。測序和BLAST比對結果表明,這些菌株均屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。其中,XZJ-5等15株菌株初步鑒定為B.cereus,XZY-7等15株菌株初步鑒定為B.subtilis,XZJ-19等7株菌株初步鑒定為B.stratosphericus,XZJ-4等6株菌株初步鑒定為B.thuringiensis。芽孢桿菌屬細菌是植物內(nèi)生細菌的優(yōu)勢菌群[23],其還可作為腸道益生菌添加到飼料中,降低體內(nèi)氧自由基含量,提高機體免疫能力,改善生產(chǎn)性能[24-25]。

3　結論與討論

植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生宿主植物本身具有或類似的結構更為新穎的生物活性物質(zhì),是發(fā)掘結構新穎和活性特殊化合物的寶貴資源[4-5]。本實驗從香樟組織中初步分離了64株內(nèi)生細菌,對內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性檢測和篩選表明,67.19%分離菌株顯示出不同能力的抗氧化作用。經(jīng)16S rRNA基因擴增,分子鑒定初步表明具抗氧化活性的香樟內(nèi)生細菌均為芽孢桿菌屬。結果表明,香樟內(nèi)生細菌抗氧化活性較為普遍,可作為篩選開發(fā)天然抗氧化劑的潛在生物資源。

人體衰老和部分疾病的發(fā)生與體內(nèi)自由基密切相關。通過對DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基等的清除能力評價了香樟內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性,結果表明,不同內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對不同自由基的清除能力不同?？傮w上,香樟內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力最好,62.50%的分離菌株具有清除能力,平均清除率為73.96%;12.50%的分離菌株對超氧自由基具有清除能力,平均清除率為16.49%;對羥自由基的清除能力最弱,只有6.25%的內(nèi)生菌具有清除能力,平均清除率為6.07%。香樟不同部位提取物也表現(xiàn)出對不同自由基的清除能力,例如,香樟葉水溶性粗多糖則對過氧化氫具有較好的清除能力,而對羥自由基、DPPH自由基的還原能力較弱[10];香樟果黃酮類花色苷化合物清除DPPH自由基能力較強,對羥自由基、超氧自由基清除能力相對較弱[14]。本實驗從香樟分離的43株內(nèi)生細菌發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到了抗氧化活性,表明這些內(nèi)生芽孢桿菌可將抗氧化酶或還原性物質(zhì)分泌到胞外,并與不同自由基發(fā)生反應,從而發(fā)揮抗氧化作用。但不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物對不同自由基的清除能力存在差異,除XZY-4、XZG-18、XZG-20等3株菌外,共40株內(nèi)生菌具有清除DPPH自由基能力,其中,XZJ-11、XZY-15、XZG-3、XZG-6、XZG-9和XZG-19等6株菌還對羥自由基或超氧自由基具有清除作用;XZY-20、XZG-8和XZG-11則表現(xiàn)出對3種自由基都具有較好的清除能力。結果暗示了這些內(nèi)生菌的抗氧化機制不同。目前報道從杜仲[6]、虎皮檀[7]、德國鳶尾[8]等植物內(nèi)生菌中分離的抗氧化活性物質(zhì)多為黃酮類化合物,Teles HL等[26]從Ocoteacorymbosa植物類彎孢屬內(nèi)生真菌中分離到的苯并吡喃以及從九里香正青霉屬內(nèi)生真菌分離的生物堿類物質(zhì)Spiroquinazoline alkaloid等也具有抗氧化作用。香樟內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物中的抗氧化活性物質(zhì)是否含為黃酮類或其類似物,以及內(nèi)生菌的抗氧化物機理是否與其宿主香樟相一致,對它們的體內(nèi)體外抗氧化活性進一步比較,也將為今后天然抗氧化劑應用和機制研究提供基礎。

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Isolation of the endophytic bacteria fromCinnamomumcamphoraand evaluation of antioxidant activity of the fermentation product

ZHAN Wei,ZENG Ling-ting,FANG Zheng,SHI Si,ZHANG Chuan-bo,WENG Qing-bei*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang 550001,China)

Objective:To isolate the endophytic bacteria from camphor and evaluate the antioxidant activity of the fermentation product of endophytes in order to lay a basis on developing camphor and its endophytes for natural antioxidants. Methods:Tissue separation and tissue homogenate methods were used to isolate the endopytes from camphor. Through determining of the total reducing power of the fermentation broth and their scavenge activity on DPPH,hydorxyl and superoxide radical,the antioxidant activity of endophytes were evaluated. Based on 16S rRNA gene sequence analysis,the endophytic bacteria were primarily identified. Results:Total of 64 strains of endophytic bacteria were isolated from the stem,leave and fruit of camphor. The total reducing power measurement of the fermentation product showed that 67.19% of the endophytes had antioxidant activity. Moreover,the fermentation product of the camphor endophytes exhibited a higher scavenge activity on DPPH radical compared with the activity on hydroxyl and superoxide radical. Among of them,totally 62.50% of endophytes exhibited scavenging ability on DPPH radical and the average clearance rate was 73.96%,12.50% of endophytes exhibited scavenging ablity on superoxide free radical and the average clearance rate was 16.49%,only 6.25% of endophytes exhibited scavenging ablity on hydroxyl radical and the average clearance rate was 6.07%. The endophytic bacteria with antioxidant activity were primarily identified and all belonged toBacilllus. Conclusion:The endophytic bacteria isolated from camphor have strong antioxidant activity and may be the potential resource for screening natural antioxidants.

Cinnamomumcamphora;endophytic bacteria;antioxidant activity;Bacillus

2016-01-29

詹偉(1987-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物次生代謝，E-mail：260138560@qq.com。

翁慶北(1975-)，女，博士，教授，研究方向：資源微生物學，E-mail：wengqb@126.com。

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項資金([2011]47)；國家自然科學基金(31000881)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0071-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.005