甄天元,楊　若,潘映鴻,于志州,趙海燕

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

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蛤蜊中重金屬含量影響因素及其來源初探

甄天元,楊若,潘映鴻,于志州,趙海燕*

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266109)

本研究于不同季節(jié)在不同地域采集不同品種的蛤蜊及養(yǎng)殖地淤泥和海水樣品,測定樣品中8種重金屬的含量,結(jié)合統(tǒng)計學(xué)方法,探討產(chǎn)地、季節(jié)、品種對蛤蜊中重金屬含量的影響,解析蛤蜊中重金屬含量與養(yǎng)殖地淤泥和海水中相關(guān)元素含量間的關(guān)系。結(jié)果顯示,蛤蜊中重金屬Cr、Sn、Sb、Cd的含量受產(chǎn)地的影響,Pb的含量受季節(jié)的影響,Cr、As、Cd、Sn、Tl、Pb的含量與品種有關(guān);蛤蜊中As的含量與養(yǎng)殖地淤泥和海水均顯著相關(guān),Cd和Sn的含量與養(yǎng)殖地淤泥中相關(guān)元素的含量密切相關(guān)。研究表明,蛤蜊中某些重金屬含量受產(chǎn)地、季節(jié)、品種的影響,其來源不僅包括淤泥、海水,可能還有其他途徑。

蛤蜊,重金屬,影響因素,來源

蛤蜊生活在海洋潮間帶,其肉鮮美無比,營養(yǎng)價值較高,富含蛋白質(zhì)、維生素、鈣、鐵等,少脂肪[1]。而且蛤蜊肉內(nèi)含有多種生物活性成分,具有抗腫瘤、抗凝血、抗菌和抗病毒等多種藥理活性[2-3]。深受人們的喜愛,是中國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類之一,花蛤和文蛤是我國灘涂養(yǎng)殖的主要品種。然而,隨著工業(yè)化進程地不斷加快,大量重金屬由于污水排放以及空氣污染等原因,進入海洋并沉積于海底沉積物中,致使海洋生物體內(nèi)重金屬的含量明顯升高[4]。雙殼貝類屬濾食性生物,其體內(nèi)重金屬的釋放比魚類、甲殼類動物慢得多,較易富集重金屬[5-6],食用了受重金屬污染的貝類會對人體健康構(gòu)成威脅[7-9]。

目前,國內(nèi)外學(xué)者主要集中于分析相關(guān)海域蛤蜊中重金屬含量,探討其作為海洋環(huán)境污染指示器的可行性[10-14]。不同養(yǎng)殖環(huán)境中重金屬背景值不同,致使不同產(chǎn)地的蛤蜊中重金屬含量不同[15-16]。不同季節(jié)氣候條件不同,蛤蜊生理活動存在差異,也可能導(dǎo)致蛤蜊中重金屬含量發(fā)生變化[17-19]。不同品種的蛤蜊由于其新陳代謝活動不同,對重金屬的富集強度不同,致使不同品種蛤蜊中重金屬含量可能存在差異[20]。目前,國內(nèi)外綜合分析產(chǎn)地、季節(jié)、品種對蛤蜊中重金屬含量的影響鮮有報道。另外,養(yǎng)殖地淤泥和海水對蛤蜊中重金屬含量的綜合影響也尚不清楚。

本研究初步探討地域、季節(jié)、品種對蛤蜊中重金屬含量的影響,綜合分析蛤蜊中重金屬含量與養(yǎng)殖地淤泥、海水之間的關(guān)系,以期為蛤蜊中重金屬方面的研究提供理論基礎(chǔ),為人們?nèi)粘ＯM蛤蜊提供借鑒。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

分別于2014年的5月、9月在青島市紅島街道、大連市莊河市、南通市如東縣海岸每個地區(qū)選擇6個面積較大的花蛤(Ruditapesphilippinarum)養(yǎng)殖場作為采樣點,每個養(yǎng)殖場采集1.5 kg的花蛤樣品、0～20 cm的淤泥樣品、500 mL海水樣品。同時,在南通市如東縣海岸選擇5個面積較大的文蛤(Meretrixmeretrix)養(yǎng)殖場,在每個養(yǎng)殖場采集1.5 kg的文蛤樣品。將樣品放入保溫箱,運回實驗室預(yù)處理。

超純水(18.2 MΩ·cm)由超純水機制得;MOS級的HNO3(70%)、H2O2(30%)、HClO4(70%)和HF(40%)北京化學(xué)試劑研究所;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08571和GBW07314)、內(nèi)標(biāo)72Ge、115In、209Bi和外標(biāo)中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采購中心。

Synergy超純水機美國密理博公司;SIM FD5-3B真空冷凍干燥機美國西盟國際集團;DV4000精確控溫電熱消解器北京安南科技有限公司;CEM Mars 密閉微波消解系統(tǒng)美國CEM公司;安捷倫7700電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS)美國安捷倫公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品預(yù)處理

1.2.1.1蛤蜊樣品預(yù)處理將蛤蜊樣品放在去離子水中暫養(yǎng)24 h吐沙和排除腸道中的內(nèi)容物,打開蛤蜊的外殼取出蛤蜊肉,將取出的蛤蜊肉放在去離子水中沖洗干凈。將清洗干凈的蛤蜊肉用陶瓷刀切丁,將肉丁平鋪于玻璃培養(yǎng)皿中,用保鮮膜封口,用牙簽在保鮮膜表層扎孔,然后放入冰柜中預(yù)冷凍12 h。將預(yù)凍好的樣品放入-80 ℃的真空冷凍干燥機中,冷凍72 h至恒重。將干樣用研缽研成粉狀,過100目篩備用。然后對樣品進行消解,步驟如下:準(zhǔn)確稱取約0.2500 g的蛤蜊樣品,放入聚四氟乙烯消解管中,加6 mL HNO3靜置1 h;加2 mL H2O2,靜置30 min。然后放入微波消解儀中,按照消解程序設(shè)定的步驟進行升溫消解。微波消解儀的工作條件:功率為1600 W,消解溫度為180 ℃。樣品消解完冷卻后,從密閉微波消解儀中取出微波消解管,在通風(fēng)廚內(nèi)將微波消解管的外塞旋開,將消解完畢的樣品(微波消解管)置于精確控溫電熱消解器上,180 ℃進行趕酸。根據(jù)定容體積,將微波消解管中的酸趕至0.5～1 mL,用超純水定容至100 g后待測。

1.2.1.2淤泥樣品預(yù)處理淤泥樣品自然風(fēng)干,然后用研缽碾碎,過100 目篩備用。

對淤泥粉末樣品進行消解,步驟如下:準(zhǔn)確稱取約0.0500 g的淤泥樣品,放入聚四氟乙烯消解管中,加入8 mL HNO3、2 mL HF。然后放入微波消解儀中,按照消解程序設(shè)定的步驟進行升溫消解。微波消解儀的工作條件:功率為1600 W,消解溫度為185 ℃。樣品消解完冷卻后,從密閉微波消解儀中取出微波消解管,在通風(fēng)廚內(nèi)將微波消解管的外塞旋開,加入1 mL HClO4,置于精確控溫電熱消解器上,180 ℃進行趕酸,將微波消解管中的酸趕至1滴,用超純水定容至100 g后待測。

1.2.1.3海水樣品預(yù)處理海水樣品用0.45 μm的密理博濾膜過濾,稱取100 g,添加6 mL 5% HNO3后待測。

1.2.2重金屬元素含量檢測利用ICP-MS測定樣品中元素Cr、Ni、As、Cd、Sn、Sb、Tl和Pb的含量。ICP-MS工作條件及參數(shù):射頻功率1280 W,霧化室溫度2 ℃,輔助氣體流量0.98 L/min,補償氣體流量1.0 L/min,載氣流量1.0 L/min,采樣深度8 mm。以元素72Ge、115In和209Bi作為內(nèi)標(biāo),每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重復(fù)三次,當(dāng)內(nèi)標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值大于5%,對樣品重新測定。

1.2.3數(shù)據(jù)分析利用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件分別對樣品中重金屬含量數(shù)據(jù)進行方差分析(p<0.05和p<0.01)、Duncan多重比較分析(p<0.05)和Pearson相關(guān)分析。利用方差分析檢驗不同產(chǎn)地、不同季節(jié)或不同品種蛤蜊樣品中各種重金屬含量間是否存在顯著差異;利用Pearson相關(guān)分析研究蛤蜊中的各種重金屬與養(yǎng)殖地淤泥、海水中的相關(guān)元素含量是否存在顯著線性相關(guān)關(guān)系。

2　結(jié)果與討論

2.1不同產(chǎn)地、季節(jié)、品種蛤蜊樣品間重金屬含量分析

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測結(jié)果顯示,其回收率均在90%～110%之間,且標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%,說明檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同品種蛤蜊中8種重金屬元素的含量如表1所示。Wang等測定了青島市膠州灣花蛤(R.philippinarum)中Cd、Pb、Cr、Ni的含量,范圍分別為:0.75～3.31、0.89～15.20、9.64～28.60、3.15～52.75 μg/g[21];Zhao等測定了遼寧省鹿兒島花蛤(R.philippinarum)中Pb、Cd、Cr 和As的含量,平均濃度分別為:0.61、0.58、3.98、1.98 μg/g[22];Li等測定了遼寧省鹿兒島花蛤(R.philippinarum)中重金屬Pb和Cd的濃度,范圍分別為0.31～1.01、0.51～0.67 μg/g[23]。與本研究的檢測結(jié)果均相似。

表1　不同產(chǎn)地、不同季節(jié)及不同品種蛤蜊中重金屬含量(μg·kg-1)Table 1　Heavy metal contents(μg·kg-1)in clams from different origins,seasons and varieties

注:表格中的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;不同的字母表示不同養(yǎng)殖地蛤蜊中此重金屬含量存在顯著差異(p<0.05)。

對不同產(chǎn)地花蛤樣品中的8種重金屬含量進行方差分析,結(jié)果顯示,元素Cr、Sn、Sb 的含量在不同產(chǎn)地間差異極顯著(p<0.01);Cd含量在不同產(chǎn)地間差異顯著(p<0.05);Ni、As、Tl、Pb的含量在不同產(chǎn)地間差異不顯著。Duncan多重比較分析結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地花蛤中的重金屬元素含量有其各自的特征(表1)。青島市花蛤中元素Sn含量最高,Cd含量最低;大連市花蛤中元素Sb含量最低。

對不同季節(jié)采集的花蛤樣品中8種重金屬含量進行方差分析,結(jié)果顯示,僅Pb含量在不同季節(jié)間差異極顯著(p<0.01),其他元素含量在不同季節(jié)間差異均不顯著。

對在南通市采集的花蛤和文蛤樣品中的8種重金屬含量進行方差分析,結(jié)果顯示,文蛤中Cd、Sn、Tl的含量極顯著高于花蛤,As的含量極顯著低于花蛤(p<0.01);文蛤中Cr和Pb的含量顯著高于花蛤(p<0.05);Ni和Sb的含量在品種間差異不顯著。表明文蛤較花蛤更容易富集重金屬元素Cd、Sn、Tl、Cr和Pb。

2.2蛤蜊中重金屬含量與養(yǎng)殖地淤泥和海水中元素含量關(guān)系分析

不同地域蛤蜊養(yǎng)殖地淤泥和海水中的重金屬元素含量如表2和表3所示。Wang等測定了青島市膠州灣花蛤(R.philippinarum)養(yǎng)殖地淤泥中重金屬Cd、Pb、Cr、Ni的含量,范圍分別為:0.76～2.37、4.34～35.01、15.88～54.01、23.77～48.94 μg/g[21];Zhao 等[22]測定了遼寧省鹿兒島花蛤(R.philippinarum)養(yǎng)殖地淤泥中重金屬Pb、Cd、Cr、As的含量,平均濃度分別為:13.80、1.10、36.40、4.78 μg/g;Li等[23]也測定了鹿兒島花蛤養(yǎng)殖地淤泥中重金屬Pb、Cd和Cr的濃度,范圍分別為24.57～49.59、0.099～0.324、41.6～88.1 μg/g。這些與本研究的測定結(jié)果相似。

表2　不同養(yǎng)殖地淤泥中重金屬含量(μg·kg-1)Table 2　Heavy metal contents(μg·kg-1) in surface sediment samples from different origins

注:表格中的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;不同的字母表示不同養(yǎng)殖地淤泥中此重金屬含量存在顯著差異(p<0.05)。

表3　不同養(yǎng)殖地海水中重金屬含量(μg·kg-1)Table 3　Heavy metal contents(μg·kg-1) in seawater samples from different origins

注:表格中的數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;不同的字母表示不同養(yǎng)殖地海水中此重金屬含量存在顯著差異(p<0.05)。

對不同地域蛤蜊養(yǎng)殖地淤泥和海水中的重金屬元素含量分別進行方差分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),除了Pb,其他重金屬的含量在不同產(chǎn)地淤泥樣品中均存在極顯著差異(p<0.01)。Duncan 多重比較分析結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地淤泥中的重金屬元素含量有其各自的特征(表2)。青島市淤泥樣品中元素Cr、Ni、As、Sn、Sb 含量最低;南通市淤泥樣品中Ni 和As 含量最高;大連市淤泥樣品中Cd、Sn 和Tl 含量最高。重金屬Cr、As、Sb 和Tl 的含量在不同產(chǎn)地海水樣品中呈現(xiàn)極顯著差異(p<0.01),其他元素的含量均差異不顯著。青島市海水中Cr 含量最高;南通市海水中As 和Tl 含量最高,Cr 含量最低;大連市海水樣品中Sb 和Tl 含量最低(表3)。

為了進一步了解蛤蜊中各重金屬含量與養(yǎng)殖地淤泥或海水中相關(guān)元素含量之間的關(guān)系,對蛤蜊和淤泥或海水中的各元素含量分別進行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果如表4所示。蛤蜊與淤泥中的元素As和Cd含量顯著正相關(guān),Sn含量極顯著負相關(guān),其他元素含量相關(guān)性不顯著。說明蛤蜊中的元素As和Cd含量隨著淤泥中As和Cd含量的增加而增加,而蛤蜊中Sn的含量隨著淤泥中Sn含量的增加而降低。蛤蜊與海水中的元素As含量顯著正相關(guān),其他元素含量相關(guān)性不顯著。Wang等分析了青島市花蛤(R.philippinarum)與其養(yǎng)殖地淤泥中Cd含量間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)蛤蜊中的Cd與淤泥中的Cd含量顯著相關(guān)[21];Zhao等分析了大連市花蛤(R.philippinarum)中重金屬Cd、Cr和As含量與其養(yǎng)殖地淤泥間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)蛤蜊中的Cd與淤泥中的Cd含量顯著相關(guān),而Cr和As在二者間相關(guān)性不顯著[24];Zhao等分析了大連市花蛤(R.philippinarum)中Pb、Cr和As含量與其養(yǎng)殖地淤泥間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)相關(guān)性均不顯著[22]。這些發(fā)現(xiàn)與本研究的結(jié)果一致。蛤蜊中Cr、Ni、Sb、Tl和Pb的濃度與養(yǎng)殖地淤泥和海水中的相關(guān)元素含量相關(guān)性均不顯著,表明蛤蜊中的重金屬來源除了淤泥和海水,可能還有其他途徑,如懸浮物,還需要進一步研究。

表4　蛤蜊和淤泥或海水中重金屬含量Pearson相關(guān)系數(shù)Table 4　Pearson correlation coefficients of the contents of heavy metals between clams and sediments or seawater

注:表格中的“*”和“**”分別表示蛤蜊中某元素含量與淤泥或海水中相關(guān)元素含量呈顯著性相關(guān)(p<0.05)和極顯著相關(guān)(p<0.01)。

3　結(jié)論

蛤蜊中重金屬Cr、Sn、Sb、Cd的含量受產(chǎn)地的影響,Pb的含量受季節(jié)的影響,Cr、As、Cd、Sn、Tl、Pb的含量與品種有關(guān);蛤蜊中As的含量與養(yǎng)殖地淤泥和海水均顯著相關(guān),Cd和Sn的含量與養(yǎng)殖地淤泥中相關(guān)元素的含量密切相關(guān)。所以,蛤蜊中的某些重金屬含量受產(chǎn)地、季節(jié)、品種的影響,其來源不僅包括淤泥、海水,可能還有其他途徑。

[1]史倩. 中國蛤蜊水提物生物活性的研究[D]. 煙臺:魯東大學(xué),2013.

[2]欒合密,吳浩,方東,等. 蛤蜊化學(xué)成分及其生物活性研究進展[J]. 中國海洋藥物雜質(zhì),2008,27(6):58-61.

[3]Chaharlang B H,Bakhtiari A R,Yavari V. Assessment of cadmium,copper,lead and zinc contamination using oysters(Saccostreacucullata)as biomonitors on the coast of the Persian Gulf,Iran[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2012,88:956-961.

[4]Kamaruzzaman B Y,Zahir M S,John B A,et al. Determination of some heavy metal concentrations in Razor clam(Solenbrevis)from Tanjung Lumpur coastal waters,Pahang,Malaysia[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences,2010,13(24):1208-1213.

[5]Alyahya H,El-Gendy A H,Farraj S A,et al. Evaluation of heavy metal pollution in the Arabian Gulf using the clamMeretrixmeretrixLinnaeus,1758[J]. Water Air and Soil Pollution,2011,214:499-507.

[6]Philips G R,Russo R C. Metal bioaccumulation in fishes and aquatic invertebrates:a literature review[M]. EPA-600/3-78-103. Washington DC:US Environmental Protection Agency(EPA),1978.

[7]Zhang L X,Ulgiati S,Yang Z F,et al. Emergy evaluation and economic analysis of three wetland fish farming systems in Nansi Lake area,China[J]. Journal of Environmental Management,2011,92:683-694.

[8]Yabanli M,Alparslan Y. Potential health hazard assessment in terms of some heavy metals determined in demersal fishes caught in eastern Aegean Sea[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2015,95:494-498.

[9]Martins V V,Zanetti M O B,Pitondo-Silva A,et al. Aquatic environments polluted with antibiotics and heavy metals:a human health hazard[J]. Environmental Science and Pollution Research,2014,21:5873-5878.

[10]Meng F,Wang Z,Cheng F,et al. The assessment of environmental pollution along the coast of Beibu Gulf,northern South China Sea:An integrated biomarker approach in the clamMeretrixmeretrix[J]. Marine Environmental Research,2013,85:64-75.

[11]Liu X,Zhang L,You L,et al. Assessment of clamRuditapesphilippinarumas heavy metal bioindicators using NMR-based metabolomics[J]. Clean-Soil,Air,Water,2011,39(8),759-766.

[12]Tarique Q,Burger J,Reinfelder J R. Metal concentrations in organs of the clamAmiantisumbonellaand their use in monitoring metal contamination of coastal sediments[J]. Water Air and Soil Pollution,2012,223:2125-2136.

[13]Ji C,Cao L,Li F. Toxicological evaluation of two pedigrees of clamRuditapesphilippinarumas bioindicators of heavy metal contaminants using metabolomics[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2015,39:545-554.

[14]Vodopivez C,Curtosi A,Villaamil E,et al. Heavy metals in sediments and soft tissues of the Antarctic clamLaternulaelliptica:More evidence as a possible biomonitor of coastal marine pollution at high latitudes?[J]. Science of the Total Environment,2015,502:375-384.

[15]Costas-Rodríguez M,Lavilla I,Bendicho C. Classification of cultivated mussels from Galicia(Northwest Spain)with European Protected Designation of Origin using trace element fingerprint and chemometric analysis[J]. Analytica Chimica Acta,2010,664:121-128.

[16]Liu X,Xue C,Wang Y,et al. The classification of sea cucumber(Apostichopusjaponicus)according to region of origin using multi-element analysis and pattern recognition techniques[J]. Food Control,2012,23:522-527.

[17]García-Rico L,Tejeda-Valenzuela L,Burgos-Hernández A. Seasonal variations in the concentrations of metals inCrassostreacorteziensisfrom Sonora,México[J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,2010,85(2):209-213.

[18]Saeki K,Kumagai H. Seasonal variations of nutritive components and several nutritive elements in short-neck clam,Tapesjaponica[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries,1980,46(3):341-344.

[19]王李寶,凌云,黎慧,等. 不同季節(jié)四角蛤蜊軟體中主要營養(yǎng)成分分析[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖,2013,34(1):4-6.

[20]胡笑叢. 牡蠣、文蛤、縊蟶中十種無機元素的質(zhì)量比分析[J]. 集美大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2005,10(4):311-313.

[21]Wang X,Zhou Y,Yang H,et al. Investigation of heavy metals in sediments and Manila clamsRuditapesphilippinarumfrom Jiaozhou Bay,China[J]. Environmental Monitoring and Assessment,2010,170:631-643.

[22]Zhao L,Yang F,Wang Y,et al. Seasonal variation of metals in seawater,sediment,and Manila Clam Ruditapes philippinarum from China[J]. Biological Trace Element Research,2013,152:358-366.

[23]Li Y,Yu Z,Song X,et al. Trace metal concentrations in suspended particles,sediments and clams(Ruditapesphilippinarum)from Jiaozhou Bay of China[J]. Environmental Monitoring and Assessment,2006,121:491-501.

[24]Zhao L,Yang F,Yan X,et al. Heavy metal concentrations in surface sediments and Manila clams(Ruditapesphilippinarum)from the Dalian coast,China after the Dalian port oil spill[J]. Biological Trace Element Research,2012,149(2):241-247.

Identification of influence factors and sources of heavy metals in clams

ZHEN Tian-yuan,YANG Ruo,PAN Ying-hong,YU Zhi-zhou,ZHAO Hai-yan*

(Food Science and Engineering College,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The clam samples of different varieties,surface sediments,and seawater were collected in different regions and seasons. The concentrations of eight heavy metals were determined in all the samples. Combined with statistical methods,the effects of geographical origin,season,and variety on the contents of heavy metals in clams were investigated,and the relationships of the contents of heavy metals between clams and sediments or seawater were analyzed. The results showed that the contents of Cr,Sn,Sb,and Cd in clams were affected by geographical origin;the content of Pb in clams was influenced by season;and the contents of Cr,As,Cd,Sn,Tl,and Pb in clams were affected by variety. In addition,the content of As in clams was significantly associated with that in sediments or seawater,and the contents of Cd and Sn in clams were significantly related to those in sediments. This study indicated the contents of some heavy metals in clams were affected by origin,season,and variety,and their sources included not only sediments and seawater but others.

clam;heavy metal;influence factor;source

2016-01-14

甄天元(1975-)，男，碩士，工程師，研究方向：食品安全，E-mail：tianyuan82877@163.com。

趙海燕(1984-)，女，博士，講師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail:xinyuyuanyin@163.com。

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31401574)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金項目(1113349)；國家級大學(xué)生科技創(chuàng)新項目(201510435040)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)15-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.001