林瑯，黎紅華，武強(qiáng)，吳樂

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·論著·

慢性低灌注對(duì)大鼠腦白質(zhì)血管生成與血腦屏障的影響

林瑯，黎紅華，武強(qiáng)，吳樂

目的：觀察慢性低灌注狀態(tài)下大鼠腦白質(zhì)區(qū)域血管生成及血腦屏障破壞狀況及其可能聯(lián)系。方法：96只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血1周組、缺血2周組、缺血4周組各24只，缺血組大鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建慢性低灌注模型，假手術(shù)組不結(jié)扎。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組大鼠腦白質(zhì)區(qū)域微血管密度、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）mRNA表達(dá)水平及伊文思藍(lán)（EB）靜脈注射后腦組織內(nèi)EB濃度。結(jié)果：各缺血組白質(zhì)區(qū)域血管網(wǎng)密度較假手術(shù)組高（P<0.01），血管密度在缺血2周組中達(dá)高峰。各缺血組VEGF mRNA表達(dá)水平均較假手術(shù)組增高（P<0.05），缺血2周及缺血4周組的VEGF mRNA表達(dá)水平較缺血1周組降低（P<0.05）。各缺血組EB濃度均較假手術(shù)組增高（P<0.01），缺血2周及缺血4周組EB濃度較缺血1周組增高（P<0.05）。結(jié)論：慢性低灌注狀態(tài)可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)、促進(jìn)血管生成，這種血管生成可能參與腦白質(zhì)區(qū)域血腦屏障破壞機(jī)制。

腦缺血；血腦屏障；血管生成；白質(zhì)損害

慢性低灌注狀態(tài)被認(rèn)為是引起腦白質(zhì)疏松、血管性癡呆的原因之一[1,2]。有研究表明，血腦屏障破壞可能參與缺血狀態(tài)下腦組織損傷機(jī)制[3,4]。但慢性低灌注狀態(tài)引起血腦屏障破壞的機(jī)制目前尚未完全闡明。研究表明，血管生成（angiogenesis）與血腦屏障破壞有密切聯(lián)系，血管生成過程中的許多重要因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、金屬基質(zhì)蛋白酶等均可顯著升高腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[5,6]。缺血缺氧是誘導(dǎo)血管生成的重要因素[7]，但慢性低灌注狀態(tài)下血管生成是否參與血腦屏障破壞尚無相關(guān)研究。本研究探討慢性低灌注狀態(tài)下血管生成是否啟動(dòng)，及其對(duì)血腦屏障的可能影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠96只，體質(zhì)量250～350 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.2主要試劑與儀器 葡聚糖（購于美國Sigma公司），伊文思藍(lán)（Evans blue，EB）購于北京化學(xué)試劑公司），RNAiso試劑盒、Prime-Script試劑盒、TaKaRa Taq試劑盒（購于大連寶生物公司），C1-SI激光掃描共聚焦顯微鏡（購于日本Nikon公司），VT1000S振動(dòng)切片機(jī)（購于德國Leica公司）

1.2方法

1.2.1大鼠分組及干預(yù)96只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血1周組、缺血2周組、缺血4周組，每組各24只，每組用于檢測(cè)血管密度、血腦屏障破壞及RT-PCR各8只。將大鼠用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口切開皮膚，剝離肌肉，暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，并分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。缺血組結(jié)扎頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，縫合皮膚。術(shù)后4組大鼠同條件飼養(yǎng)，假手術(shù)組于術(shù)后4周處死，缺血1周組、缺血2周組、缺血4周組分別于術(shù)后1、2、4周處死并進(jìn)行不同檢測(cè)。

1.2.2血管密度檢測(cè) 大鼠處死前予熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的葡聚糖50 mg靜脈注射，1 h后迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內(nèi)保存24 h后，取前囟前2～4 mm區(qū)域腦組織振動(dòng)切片機(jī)冠狀位切片，片厚100 μm。按Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》確定腦深部白質(zhì)區(qū)域，激光掃描共聚焦顯微鏡下對(duì)腦深部白質(zhì)取600×600 μm區(qū)域行逐層掃描，每層間隔1 μm，共掃描50層。將掃描圖像導(dǎo)入3D Doctor 3.5圖像分析軟件，利用該軟件進(jìn)行三維重建并計(jì)算三維空間內(nèi)血管容積，將血管容積除以三維空間總?cè)莘e得到血管密度。

1.2.3RT-PCR檢測(cè) 大鼠腦組織加入液氮研碎，轉(zhuǎn)移入勻漿器，按照RNAiso試劑盒說明書操作提取腦組織總RNA，按PrimeScript試劑盒說明書進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄操作，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μL作為模板，按TaKaRa Taq試劑盒說明書進(jìn)行PCR操作。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物加入2 μL溴酚藍(lán)，在1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠圖像分析儀上進(jìn)行吸光度掃描，測(cè)定條帶的光密度，并計(jì)算ROCK與β-actin的光密度比值。PCR引物采用Primer 5軟件根據(jù)目的序列自行設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成。PCR采用β-actin作為內(nèi)參照，引物序列：VEGF上游引物：5'-GAC CCT GGT GGA CAT CTT CCA GGA-3'，下游引物5'-GGT GAG AGG TCT AGT TCC CGA-3'；β-actin上游引物：5'-AAC CCT AAG GCC AAC CGT GAA A-3'，下游引物：5'-TCA TGA GGT AGT CTG TCA GGT C-3'。

1.2.4血腦屏障破壞檢測(cè) 大鼠處死前予2%EB （4 mL/kg）靜脈注射，6 h后經(jīng)左心室予0.9%氯化鈉注射液500 mL快速灌注，斷頭取腦，取前囟后2～4 mm處腦組織，稱重后置入1 mL 50%三氯乙酸溶液內(nèi)，經(jīng)勻漿、離心后，上清液予3 mL無水乙醇稀釋，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)620 nm，釋放波長(zhǎng)680 nm），根據(jù)預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定EB濃度，并計(jì)算腦組織內(nèi)EB濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1血管密度測(cè)定

各缺血組血管密度均較假手術(shù)組增高（P<0.01），血管密度在缺血2周組中達(dá)高峰，但各缺血組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1、表1。

2.2VEGF mRNA表達(dá)測(cè)定

各缺血組VEGF mRNA表達(dá)水平均較假手術(shù)組增高（P<0.05），缺血2周及缺血4周組的VEGF mRNA表達(dá)水平較缺血1周組降低（P<0.05），見圖2、表1。

2.3血腦屏障破壞檢測(cè)

各缺血組EB濃度均假手術(shù)組增高（P<0.01），缺血2周及缺血4周組的EB濃度較缺血1周組增高（P< 0.05），缺血2周及缺血4周組的EB濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

圖1　各組大鼠血管密度（異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記）

表1　4組大鼠相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)比較（）

表1　4組大鼠相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組相比，①P<0.01；與對(duì)照組相比，②P<0.05；與缺血1周組相比，③P<0.05

組別 只數(shù) 血管密度/%　VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平EB濃度/ (μg/mL)假手術(shù)組　8　6.05±0.71　0.18±0.03　1.99±0.37缺血1周組　8　14.27±1.31①　0.88±0.35①　7.67±2.64①缺血2周組　8　17.39±2.13①　0.57±0.23②③　10.95±2.05①③缺血4周組　8　16.79±2.40①　0.52±0.27②③　10.58±3.59①③

圖2　各組大鼠VEGF mRNA表達(dá)

3　討論

慢性低灌注是引起腦組織損害的常見病理狀態(tài)，常被認(rèn)為是白質(zhì)疏松等病理損害的基礎(chǔ)[8]。目前對(duì)缺血性白質(zhì)損害的機(jī)制尚未取得一致認(rèn)識(shí)，但血腦屏障破壞可能是缺血性白質(zhì)損害的重要原因[9]。腦部的缺血性損害將導(dǎo)致血腦屏障開放，從而使炎性物質(zhì)、淀粉樣前體蛋白等毒性物質(zhì)在白質(zhì)積聚，引起腦部的白質(zhì)改變。

血管生成在缺血性血腦屏障破壞的發(fā)生機(jī)制中有重要地位。作為血管生成的關(guān)鍵因子之一，VEGF和血腦屏障開放密切相關(guān)[10]。在急性缺血性疾病中，腦內(nèi)VEGF表達(dá)上調(diào)和血腦屏障通透性的破壞有密切聯(lián)系，抑制VEGF的信號(hào)通道可減輕血腦屏障通透性的破壞[11]。VEGF不僅和缺血狀態(tài)下的血腦屏障破壞有關(guān)，還和腫瘤、顱內(nèi)感染等病理狀態(tài)下的血腦屏障破壞相關(guān)[6]，這提示血腦屏障的破壞可能有共同的發(fā)病環(huán)節(jié)。此外，血管生成過程的另一類重要因子，金屬基質(zhì)蛋白酶也與急性腦缺血時(shí)血腦屏障的破壞有密切聯(lián)系[12]。

缺血缺氧是引起血管生成的主要始動(dòng)因素，因此慢性低灌注狀態(tài)下血管生成水平很可能被上調(diào)，從而成為慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障破壞的機(jī)制之一。然而，目前對(duì)于慢性低灌注狀態(tài)下血管生成研究甚少，有關(guān)慢性低灌注狀態(tài)下血管生成與血腦屏障破壞間聯(lián)系的研究更付闕如。大鼠雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎模型自被發(fā)明以來，被驗(yàn)證為一種成熟可靠的腦慢性低灌注模型并得到廣泛應(yīng)用。多項(xiàng)研究證實(shí)在雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎所致的慢性低灌注情況下，大鼠腦白質(zhì)會(huì)明顯脫髓鞘[13,14]，并可引起認(rèn)知功能損害[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性低灌注狀態(tài)下，大鼠腦內(nèi)VEGF表達(dá)水平升高，微血管密度增多，表明慢性低灌注狀態(tài)可上調(diào)血管生成水平。大鼠腦組織內(nèi)EB濃度水平上升，則表明慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障破壞，這種破壞與血管生成具有時(shí)間上的一致性，可能存在密切聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：王晶）

·論著·

Effect of Chronic Cerebral Hypoperfusion on Angiogenesis and Blood-brain Barrier in WhiteMatter

LIN Lang,LI Hong-hua,WU Qiang,WU Le.Department of Neurology,Wuhan General Hospital ofGuangzhou Army,Wuhan 430070,China

AbstractObjective:To explore angiogenesis and blood-brain barrier(BBB)disruption under chronic cerebral hypoperfusion status in white matter areas.Methods:Ninty-six male Wistar rats were divided into groups of sham-operated,ischemia 1 week,ischemia 2 weeks and ischemia 4 weeks(n=24 in each group).Permanent,bilateral common carotid artery occlusion was used to induce hypoperfusion in forebrain of the rats,and the shamoperated group was not ligated.Capillary density was used to assess the angiogenic level.Quantitative measurement of Evans Blue was used to assess the BBB function.Reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to evaluate the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA.Results:The vessel density in the white matter of the ischemia groups were increased than that of the sham-operated group(P<0.01), and the vessel density of the ischemia 2 weeks group was highest.The VEGF mRNA expression of the ischemia groups was higher than that in the sham-operated group(P<0.05),and the VEGF mRNA expression in the ischemia 2,4 weeks groups were decreased compared with that in the ischemia 1 week group(P<0.05).The Evans Blue concentrations of the ischemia groups were increased in comparison with that in the sham-operated group(P<0.05), and the Evans Blue concentrations in the ischemia 2,4 weeks groups were higher than that in the ischemia 1 week group(P<0.05).Conclusion:Chronic cerebral hypoperfusion can induce angiogenesis which may contribute to BBB disruption in white matter areas.

brain ischemia;blood-brain barrier;angiogenesis;white matter impairment

R741;R741.05

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.003

廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430070

2015-07-02

林瑯

plexor@163.com