何海燕， 陳　靜， 晉芙麗， 李　凌， 杜永平△， 張月萍*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科腦發(fā)育研究室，西安　710032； 2陜西省安康市婦幼保健院新生兒科；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍中醫(yī)內(nèi)科中心；*通訊作者，E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn; △共同通訊作者，E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)

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琥珀酸對幼齡大鼠小腦谷氨酸能突觸傳遞的抑制作用

何海燕1,2， 陳靜3， 晉芙麗1， 李凌1， 杜永平3△， 張月萍1*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科腦發(fā)育研究室，西安710032；2陜西省安康市婦幼保健院新生兒科；3第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍中醫(yī)內(nèi)科中心；*通訊作者，E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;△共同通訊作者，E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)

目的探討琥珀酸(succinic acid，SA)對幼齡大鼠小腦谷氨酸能突觸傳遞的影響。方法采用全細(xì)胞膜片鉗記錄法，在矢狀位小腦腦片上記錄浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)自發(fā)性微小興奮性突觸后電流(miniture excitatory postsynaptic current，mEPSC)和刺激平行纖維(parallel fibre，PF)誘發(fā)的PCs興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)，比較琥珀酸處理前后mEPSC和PF-PC EPSP的變化。結(jié)果琥珀酸處理后,幼鼠小腦PCs的自發(fā)性mEPSCs幅值顯著減小，由給藥前的(24.85±2.78)pA減小至給藥后的(13.14±0.84)pA，頻率也由給藥前的(5.04±1.07)Hz降至給藥后的(2.77±0.79)Hz，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；琥珀酸顯著抑制了PF-PC EPSPs的幅值，使其降低至用藥前的(37.76±1.10)%(P<0.01)，并使EPSP雙脈沖(paired-pulse facilitation，PPF)增強(qiáng)的比率較用藥前增加了(40.26±2.9)%(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 琥珀酸對幼齡大鼠小腦谷氨酸能突觸傳遞有顯著的抑制作用。

琥珀酸；浦肯野細(xì)胞；谷氨酸；自發(fā)性微小興奮性突觸后電流；興奮性突觸后電位

驚厥是新生兒常見的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。出生后早期即使是單次驚厥，也有可能引起腦內(nèi)谷氨酸能突觸傳遞的持久性改變[2]。越來越多的研究顯示出生后早期使用傳統(tǒng)抗驚厥藥如苯巴比妥、地西泮、苯妥英鈉等對未發(fā)育腦可能造成遠(yuǎn)期的功能損害[3]。因此，如何權(quán)衡驚厥后果和藥物傷害是新生兒科醫(yī)生面臨的艱難抉擇，研發(fā)具有神經(jīng)保護(hù)作用的抗驚厥藥有重要的臨床意義。

琥珀是傳統(tǒng)的鎮(zhèn)驚安神類中藥，自古以來用于治療驚厥。琥珀酸(succinic acid，SA)是琥珀的主要成分。動物實驗研究表明，腹腔注射10-12 mmol/L SA可對抗多種方法造成的動物驚厥[4]。SA位于三羧酸循環(huán)和腦內(nèi)特有的谷氨酸-γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)-SA代謝旁路的樞紐地位，不僅在腦的能量代謝中具有特殊地位，而且有利于維持腦內(nèi)突觸傳遞的興奮-抑制平衡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，SA能抑制GABA和琥珀酸半醛之間的互變反應(yīng)，升高驚厥動物腦內(nèi)的GABA水平，增強(qiáng)中樞抑制，也可增加腦內(nèi)谷氨酸脫羧酶活性，降低谷氨酸水平，抑制中樞興奮[6]。然而，與SA通過增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制性突觸傳遞發(fā)揮中樞抑制作用的研究相比，較少有人關(guān)注SA對谷氨酸能突觸傳遞的影響。

本課題組以前的研究表明，腹腔注射琥珀酸可逆轉(zhuǎn)驚厥SD大鼠幼鼠小腦浦肯野細(xì)胞(Purkinje cells，PCs)興奮性突觸后電流的近遠(yuǎn)期的長時程抑制(long term depression，LTD)強(qiáng)化現(xiàn)象[7]，提示琥珀酸在有效抗驚厥的同時，對驚厥造成的發(fā)育腦的谷氨酸能突觸可塑性異常有對抗作用。本研究在幼齡大鼠小腦組織切片上給藥，探討琥珀酸對平行纖維(parallel fibre，PF)-PC之間谷氨酸能突觸傳遞的直接影響，為闡明琥珀酸的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制提高實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物及主要儀器

14-16日齡SPF級Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。滲透壓測定儀(Model 210，F(xiàn)ISKE ASSOCIATE，USA)，玻璃微電極拉制儀(P-97，Sutter Instrument，USA)，振動切片機(jī)(VT1000S，Leica)，正置顯微鏡(Zeiss，Axopatch，German)，放大器(Axon 700A，Axon Instrument，USA)，微電極操縱儀(Model 285，Sutter Instrument，USA)，模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(Digidata1322A，Axon Instruments，USA)，刺激器(PG4000A，CYGNUS)，恒流泵(HL-2，上海瀘西儀器廠)。

1.2主要試劑及溶液配制

NaCl、KC1、NaH2PO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaHCO3、葡萄糖(glucose)、葡萄糖酸鉀(K-gluconate)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、磷酸肌酸二鈉(phosphoreatine disodium)、三磷酸腺苷二鈉(Na2ATP)、三磷酸鳥苷酸鈉(Na3GTP)、KOH、河豚毒素(TTX)、荷包牡丹堿(Bicuculline)、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)和琥珀酸(SA)，均購自Sigma公司。

人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)成分：NaCl 126.0 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，NaH2PO4·H2O 1.25 mmol/L，MgSO4·7H2O 2.0 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.0 mmol/L，NaHCO326.0 mmol/L，Glucose 10.0 mmol/L，pH 7.35-7.45，滲透壓310-320 mOsm/L。電極內(nèi)液成分：K-gluconate 120.0 mmol/L，KCl 5.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，EGTA 5.0 mmol/L，CaCl2·2H2O 0.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 2.0 mmol/L，phosphoreatine disodium 2.0 mmol/L，Na2ATP 4.0 mmol/L和Na3GTP 0.3 mmol/L，用濃度為0.5 mol/L的KOH調(diào)pH為7.35-7.45，滲透壓280-290 mOsm/L。

1.3腦片制備

SD幼齡大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30-40 mg/kg)麻醉后快速斷頭取腦，迅速置于充95%O2+5%CO2混合氣的0 ℃ ACSF中，1 min取出，將小腦組織塊修整后移入切片槽內(nèi)固定，用振動切片機(jī)切出300-400 μm厚的矢狀位腦片，立即轉(zhuǎn)移至32 ℃的ACSF中孵育30 min，然后移至室溫下繼續(xù)孵育，以備記錄。整個過程通以95%O2+5%CO2混合氣體。實驗操作及內(nèi)容符合西京醫(yī)院實驗動物保護(hù)和使用委員會的規(guī)定。

1.4全細(xì)胞膜片鉗記錄和藥物干預(yù)

將腦片移至記錄浴槽內(nèi)，先在低倍鏡下確定小腦皮層的細(xì)胞層，然后在高倍鏡下選擇表面光滑、輪廓清晰、立體感強(qiáng)的PCs進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。當(dāng)電極尖端靠近PC時，給予合適的負(fù)壓，形成1 GΩ以上高阻抗封接，繼續(xù)施加吸破細(xì)胞膜，形成PC全細(xì)胞記錄模式(見圖1A)。玻璃微電極充灌內(nèi)液后電阻為5-8 MΩ。記錄過程中使用恒流泵持續(xù)向記錄浴槽內(nèi)灌注含95%O2+5%CO2混合氣體的ACSF灌流液，流速為2 ml/min。

記錄PCs微小突觸后電流時，在電壓鉗狀態(tài)下，鉗制膜電位-70 mV，于ACSF灌流液中加入鈉通道阻斷劑河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)(1 μmol/L)阻斷突觸前細(xì)胞動作電位發(fā)放引起的微小突觸后電流，同時加入GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline，Bic)(10 μmol/L)阻斷微小抑制性突觸后電流，即可記錄到PCs自發(fā)性微小興奮性突觸后電流(miniture excitatory postsynaptic current，mEPSC)。穩(wěn)定記錄自發(fā)性mEPSC 5 min，轉(zhuǎn)換為含有琥珀酸(0.1 μmol/L)的ACSF灌流5 min，然后轉(zhuǎn)換為不含琥珀酸的ACSF灌流液，持續(xù)記錄20 min。

記錄PC興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)時，將充有ACSF的玻璃微電極置于小腦腦片的分子層(見圖1B)，通過刺激器給予方波刺激(波寬0.1 ms，強(qiáng)度20-50 μA)，在電流鉗狀態(tài)下，可在PC上記錄到PF興奮引起的EPSPs。在正常ACSF灌流液灌流下穩(wěn)定記錄EPSP 10 min，用含有0.1 μmol/L琥珀酸的ACSF灌流5 min，再轉(zhuǎn)換為正常ACSF灌流液，繼續(xù)記錄EPSPs 30 min以上。所有記錄在室溫(20-25 ℃)下進(jìn)行。

圖1　高倍鏡下幼齡大鼠小腦腦片上的PC (×40)Figure 1　The PCs in the cerebellar slices of neonatal rats at high magnification (×40)

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1琥珀酸對大鼠小腦PC自發(fā)性微小興奮性突觸后電流的影響

在電壓鉗模式下，鉗制PCs膜電位為-70 mV。在TTX(1 μmol/L)和Bic(10 μmol/L)存在時，在小腦PC記錄到的微小突觸后電流即為自發(fā)性mEPSC。1個PC 自發(fā)性mEPSC對琥珀酸作用的典型反應(yīng)，可見琥珀酸對PCs自發(fā)性mEPSC有明顯的抑制作用(見圖2)。在比較mEPSC幅值和頻率的均值時，取SA灌流前的記錄(5 min)為給藥前對照，取SA灌流后15-20 min的記錄作為給藥后數(shù)據(jù)。在11個PCs上記錄的結(jié)果顯示，給藥后自發(fā)性mEPSC的幅值及頻率均明顯降低，與給藥前相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)，表明琥珀酸顯著抑制了PCs的自發(fā)性mEPSC。

2.2琥珀酸對大鼠小腦PF-PC突觸傳遞的影響

電流鉗狀態(tài)下，給予PCs細(xì)胞內(nèi)輸入微小的超極化電流，使其膜電位保持在-70 mV，記錄PF興奮誘發(fā)的 EPSPs，這種EPSPs可以被谷氨酸α-氨基-3-羧基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA)受體阻斷劑CNQX(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，CNQX)(10 μmol/L)阻斷(見圖3A上)，說明這種突觸后反應(yīng)是由AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電位，以連續(xù)2個脈沖(間隔50 ms)刺激PF時，可見EPSP的雙脈沖增強(qiáng)(paired-pulse facilita-tion，PPF)現(xiàn)象(見圖3A下)。

給予琥珀酸5 min后，自發(fā)性mEPSC的頻率和幅值均逐漸減小，a和b分別采自給予琥珀酸前后的mEPSC記錄圖2　琥珀酸抑制大鼠小腦PC自發(fā)性mEPSCFigure 2　Succinic acid inhibits spontaneous mEPSC on cerebellar PC of neonatal rats

組別幅值(pA,n=11)頻率(Hz,n=11)對照組24.85±2.785.04±1.07琥珀酸組13.14±0.842.77±0.79 P<0.01<0.01

當(dāng)用含琥珀酸的ACSF液灌流時，EPSPs的幅值迅速衰減，約于SA灌流后20 min，EPSPs幅值降低到最低點。停止琥珀酸灌流后觀察40 min，EPSPs幅值仍未恢復(fù)，呈現(xiàn)為長時程抑制(見圖3B、C)。比較EPSPs幅值時，取SA灌流前的記錄為對照(10 min)數(shù)據(jù)，SA灌流后20-50 min期間記錄給藥后數(shù)據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，琥珀酸使PCs EPSP的幅值降低到用藥前的(37.76±1.10)%(n=13，P<0.01，見表1)。同時，EPSPs的PPF比率較用藥前增加了(40.26±2.9)%(n=8，P<0.01，見表2)。此結(jié)果表明琥珀酸顯著抑制了PF興奮誘發(fā)的PC EPSP，并使EPSP的PPF顯著增強(qiáng)。

圖3　琥珀酸對幼鼠小腦PF-PC EPSP的影響Figure 3　The effect of succinic acid on PF-PC EPSP on the cerebellum of neonatal rats

組別標(biāo)準(zhǔn)化幅值(%,n=13)PPF(%,n=8)對照組100.00±1.97155.25±14.80琥珀酸組37.76±1.10195.51±17.70 P<0.01<0.01

3　討論

琥珀酸不僅存在于琥珀中，也存在于植物藥如七葉蓮和海洋生物如水藻中。琥珀酸作為一種抑制性神經(jīng)活性物質(zhì)，毒性小、來源廣、價格低廉，不僅有良好的抗驚厥作用，還能改善大腦認(rèn)知功能，這些優(yōu)點恰好是化學(xué)合成的抗癲癇藥所不具備的。因此，琥珀酸具有作為內(nèi)源性抗驚厥、抗癲癇新藥的潛在價值。

小腦一向被認(rèn)為是皮層下的一個運(yùn)動控制中樞，參與軀體平衡、運(yùn)動協(xié)調(diào)和技巧動作的獲得。而近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)脊椎動物的小腦也參與內(nèi)臟功能調(diào)節(jié)和高級認(rèn)知功能的形成[8,9]。因此，小腦是研究發(fā)育中的腦的一個重要腦區(qū)。小腦結(jié)構(gòu)規(guī)整，環(huán)路清楚，小腦主神經(jīng)元PC不僅接受來自平行纖維和攀纖維的強(qiáng)大的谷氨酸能興奮性輸入，同時也接受來自中間神經(jīng)元的豐富的GABA能抑制性輸入。所以，小腦也是研究突觸活動的理想腦區(qū)[9]。

本研究首次在小腦腦片上觀察了SA對幼齡大鼠小腦環(huán)路中最重要的谷氨酸能突觸PF-PC之間突觸傳遞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SA可顯著抑制PCs自發(fā)性mEPSCs和PF興奮誘發(fā)的PC EPSP。mEPSC是在動作電位被阻斷后，突觸之間自發(fā)釋放遞質(zhì)所形成的微小的興奮性突觸后電位。mEPSC其幅度及頻率變化反應(yīng)了突觸后膜受體數(shù)目及突觸前遞質(zhì)釋放速度的改變[10]。SA對PCs自發(fā)性mEPSCs的幅值和頻率均有顯著的抑制，說明其抑制作用不僅涉及突觸后谷氨酸受體的活性，也涉及突觸前谷氨酸的釋放速度。

PC PPF是指給予PF兩次短暫間隔的脈沖刺激時，第二次刺激在PC上引發(fā)的EPSP幅值大于第一次刺激在PC上引發(fā)的EPSP幅值的現(xiàn)象，其主要原因是由于前一個脈沖刺激的易化，使后一個刺激引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加。所以PPF比率的變化反應(yīng)突觸前神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)的可能性。本研究結(jié)果顯示SA在抑制AMPA受體介導(dǎo)的PF-PC EPSP的同時，增強(qiáng)了EPSP的PPF，說明SA對PF誘發(fā)的PC EPSP的抑制作用也涉及突觸后和突觸前機(jī)制。

本課題組以前的研究發(fā)現(xiàn)，在驚厥幼鼠小腦腦片上，低頻刺激誘導(dǎo)的PF-PC LTD增強(qiáng)，而在腹腔注射琥珀酸的驚厥幼鼠腦片上，低頻刺激誘導(dǎo)的PF-PC LTD接近正常，表明琥珀酸可對抗驚厥后小鼠PF-PC之間谷氨酸能突觸傳遞的顯著衰減[7]，這一結(jié)果與本研究中琥珀酸抑制PF-PC之間谷氨酸能突觸傳遞的結(jié)果共同表明，琥珀酸對幼齡大鼠小腦PF-PC谷氨酸能突觸傳遞的調(diào)節(jié)是雙向的。

許多研究顯示琥珀酸的抗驚厥作用是多方面的，如琥珀酸可通過增強(qiáng)突觸前膜GABA的自發(fā)性釋放，對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生超極化作用，從而抑制癲癇發(fā)作[11]。劉艷霞[11]等觀察到琥珀酸可增加腦內(nèi)谷氨酸脫羧酶活性，升高腦內(nèi)GABA水平[12]。琥珀酸也可通過減少Ca2+內(nèi)流，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載觸發(fā)的胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮抗驚厥和神經(jīng)保護(hù)作用的[13]。本研究及我們以前的研究提示，琥珀酸對谷氨酸能突觸傳遞的雙向調(diào)節(jié)作用可能也是抗驚厥和神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

在小腦環(huán)路中，PC對其靶細(xì)胞(主要是小腦傳出細(xì)胞)的抑制受PF興奮性輸入的調(diào)節(jié)：如果PF-PC的興奮性突觸傳遞增強(qiáng)，PC對其靶細(xì)胞的GABA能抑制也將增強(qiáng)；而PF-PC的興奮性突觸傳遞減弱，PC對其靶細(xì)胞的GABA能抑制也將減弱。如果PC的抑制性輸出顯著減弱，那么小腦傳出細(xì)胞的興奮性傳出信號可能會顯著增強(qiáng)。亦即：小腦PF-PC興奮性突觸傳遞的過度抑制可能會導(dǎo)致小腦傳出細(xì)胞的軸突所到達(dá)腦區(qū)的過度興奮。而琥珀酸對幼鼠小腦PF-PC谷氨酸能突觸傳遞的雙向調(diào)節(jié)，可能有利于維持小腦環(huán)路(PF-PC-小腦傳出細(xì)胞)和小腦以外區(qū)域(小腦傳出細(xì)胞-靶細(xì)胞)的興奮/抑制平衡，這一猜測有待于進(jìn)一步實驗證實。

綜上所述，本研究表明琥珀酸對幼鼠小腦PF-PC谷氨酸能突觸傳遞有顯著的抑制作用，突觸前和突觸后機(jī)制共同介導(dǎo)了這種興奮性突觸傳遞的抑制，這可能是琥珀酸抗驚厥和神經(jīng)保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

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Inhibition of succinic acid on cerebellar glutamatergic synaptic transmission in neonatal rats

HE Haiyan1, 2, CHEN Jing3, JIN Fuli1, LI Ling1, DU Yongping3△, ZHANG Yueping1*

(1LaboratoryofBrianDevelopment,DepartmentofPediatrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2NeonatalUnit,AnkangMaternalandChildHealthHospitalinShannxiProvince;3DepartmentofTraditionalChineseMedicine;XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:ypzhang@fmmu.edu.cn;△Co-correspondingauthor,E-mail:ddyypp@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of succinic acid(SA) on the glutamatergic synaptic transmission in the neonatal rat cerebellum.MethodsThe whole-cell patch-clamp technique was carried out in Purkinje cells(PCs) of sagittal cerebellar slices to record the spontaneous miniture excitatory postsynaptic current(mEPSC) and the excitatory postsynaptic potential(EPSP) induced by parallel fiber(PF) stimulation. The changes of the mEPSC and the PF-PC EPSP upon SA were analyzed before and after SA perfusion.ResultsSA significantly reduced the amplitude[from(24.85±2.78)pA to(13.14±0.84)pA,P<0.01]and the frequency[from(5.04±1.07)Hz to (2.77±0.79)Hz,P<0.01] of the spontaneous mEPSCs. SA also significantly inhibited PF-PC EPSPs amplitude to (37.76±1.10)% of the control(P<0.01) and enhanced the EPSP paired-pulse facilitation(PPF) by(40.26±2.9)%(P<0.01).ConclusionSA may provide an inhibitory effect on cerebellar glutamatergic synaptic transmission in neonatal rats.

succinic acid;Purkinje cells;glutamic acid;miniture excitatory postsynaptic current;excitatory postsynaptic potential

何海燕，女，1983-10生，在讀碩士，主治醫(yī)師，E-mail:283348291@qq.com

2016-05-16

R748

A

1007-6611(2016)08-0698-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.005