王　瑤， 楊　彪， 李　卓*

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安　710077； 2西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科； *通訊作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)

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蜂膠對大鼠實驗性脂肪肝的療效及其機制

王瑤1， 楊彪2， 李卓1*

(1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安710077；2西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨科；*通訊作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)

目的觀察蜂膠對大鼠實驗性脂肪肝的療效，并分析其作用原理。方法50只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、蜂膠低劑量組、高劑量組、易善復組。除正常組外，其余各組采用喂食高脂乳液(1 ml/100 g)+喂食含56%酒精的酒溶液(1 ml/100 g)+腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)的方法，使大鼠產生脂肪肝。所有大鼠于末次給藥后禁食16 h，股動脈取血，檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平；計算肝臟器系數(shù)，做肝組織病理學檢驗。結果利用喂食高脂乳液+喂食56%的酒溶液+腹腔注射CCl4菜籽油溶液的方法，可使大鼠產生脂肪肝，完成實驗模型建立。相對于模型組，蜂膠高劑量組的TG、AST、TC、ALT、FFA水平下降明顯(P<0.05)，且效果優(yōu)于低劑量組，與易善復組接近；與模型組比較，蜂膠高劑量組的血清炎癥因子水平(IL-6、IL-8、TNF-α)也明顯降低(P<0.05)；蜂膠高劑量組的肝臟器系數(shù)與模型組比較下降明顯(P<0.05)，病理結果也顯示肝細胞的水腫和壞死現(xiàn)象減輕，脂肪空泡減少。結論蜂膠對大鼠脂肪肝有明顯的療效,其作用機制可能與影響血清炎癥因子水平具有一定的關聯(lián)。

蜂膠；脂肪肝；炎癥因子；高脂乳液;大鼠

蜂膠具有多種藥理功效，例如：抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、降血糖、保護肝臟等[1]。近年來，國內外相關領域的專家學者對其保肝功效也展開了廣泛的研究，并取得了一定成果。然而，蜂膠在脂肪肝治療過程中的作用原理尚不明晰。Albukhari等[2]認為蜂膠中的咖啡酸苯乙酯能通過保護細胞膜的完整性，抑制脂質過氧化，增強抗氧化酶的方式保護肝臟。Kart等[3]發(fā)現(xiàn)蜂膠能通過降低活性氮和恢復谷胱甘肽水平的方式對抗癌藥物順鉑誘導的肝毒性，起到保肝作用。目前，關于脂肪肝誘發(fā)因素的研究越來越集中于細胞因子分泌異常這一熱點上[4-6]。因此，本研究觀察蜂膠對大鼠脂肪肝的治療作用及對血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 的影響研究，探討了蜂膠在脂肪肝中的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

50只雄性Wistar大鼠，SPF級，體重180-220 g，由西安交通大學醫(yī)學院提供，動物合格證號：SYXK(陜)2014-005。

1.2主要試劑和儀器

CCl4(成都科龍試劑廠，20141104)；易善復(北京賽諾菲安萬特制藥公司，20140812)；56°二鍋頭酒(北京二鍋頭酒業(yè)公司，XK16-030354)；羧甲基纖維素鈉(上海三浦化工，20140911)；膽固醇(成都科龍化工試劑廠，20150305)；吐溫-80(成都科龍化工試劑廠，20150402)；丙基硫嘧啶(上海復星朝暉藥業(yè)有限公司，141105)；丙二醇(天津市大茂化學試劑廠，20141128)；脫氧膽酸鈉(上海Solarbio公司，20140611)；磁力攪拌器(上海KEEZO公司，KMS-181E)；全自動生化儀(美國Beckman公司，AU5800)；酶標儀(美國Thermo公司，Multiskan FC)。1.3蜂膠的純化實驗

粗制蜂膠經冷凍后粉碎，用10倍量的75%乙醇攪拌提取24 h，過濾，濾液在-20 ℃冷凍10 h，300目濾布過濾除蠟，在-10 ℃重復3次冷凍除蠟工藝，然后加溫至60 ℃，加適量活化了的活性炭攪拌1 h脫鉛，真空濃縮脫水之后進行冷卻。得到的精制蜂膠含48%的蜂膠提取物，以及15%的黃酮，符合2009年《蜂膠國家標準》(標準編號為GB/T24283-2009)。使用時以生理鹽水10倍溶解。

1.4高脂乳液的制備

燒杯中放入20 g豬油，用磁力攪拌器進行加熱攪拌，升溫至100 ℃，投入膽固醇8 g，完全溶解后滴入吐溫-80 20 ml以及丙基硫嘧啶0.6 g，攪拌均勻呈油狀；另一燒杯中放入丙二醇20 ml、蒸餾水130 ml，加熱至60 ℃，投入脫氧膽酸鈉1.2 g，攪拌均勻呈水相。冷卻后將水相加入油相，攪拌混勻制成高脂乳液。其中豬油含量10%、膽固醇含量4%、膽酸鈉含量0.6%、丙硫氧嘧啶含量0.3%。

1.5脂肪肝大鼠模型的建立及治療

大鼠隨機分正常組、模型組、易善復組(250 mg/kg)、蜂膠高劑量組(250 mg/kg)、蜂膠低劑量組(125 mg/kg)，每組各10只。每日下午除正常組以外的其余大鼠都要喂食高脂乳液(1 ml/100 g)喂藥1 h后再對其喂食酒精含量為56%的酒溶液(1 ml/100 g)；另除正常組外，其余各組大鼠隔天腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)，正常組以等容積生理鹽水注射于相同部位[7]。每日上午大鼠進行灌胃給藥，周期為18 d。正常組和模型組以羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃，給藥體積為1 ml/100 g；易善復組給藥劑量為250 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g；蜂膠高劑量組給藥劑量為250 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g；蜂膠低劑量組給藥劑量為125 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g。

1.6血清生化指標檢測

末次給藥后大鼠禁食16 h，稱體重，股動脈取血，Beckman AU5800全自動生化儀對AST、ALT、TG、TC、FFA水平進行檢測，試劑均購自美國Beckman公司。AST和ALT的檢測方法為連續(xù)檢測法；TG、TC和FFA的檢測方法為酶法。

1.7血清炎癥因子水平檢測

Thermo酶標儀檢測IL-6、IL-8、TNF-α水平，試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。操作方法：準備試劑、樣品和標準品→加入準備好的樣品和標準品，37 ℃反應30 min→洗板5次，加入酶標試劑，37 ℃反應30 min→洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min→加入終止液→15 min之內450 nm測量OD值→計算。

摘除大鼠肝臟，稱重，計算肝臟器系數(shù)，肝臟器系數(shù)=肝質量/體質量×100%，截取一部分肝左葉用10%甲醛固定，HE染色觀察。

1.8統(tǒng)計學分析

用SPSS18.0軟件進行，正態(tài)計量資料以均數(shù)±標準差表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)經對數(shù)轉換后再行分析。利用單因素方差分析法進行組別之間的對比，如果方差齊則利用LSD-t檢驗法進行組別之間的對比，如果方差不齊則利用Tamhane’s T2檢驗法進行兩兩對比。所有結果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般情況

正常組大鼠飲食正常、體重增加、動作敏捷，其余各組在造模后逐漸出現(xiàn)不同程度的飲食減少、體重下降、不喜活動等現(xiàn)象。大多數(shù)大鼠在進行酒精喂食之后出現(xiàn)行走困難、動作遲鈍、精神不振等癥狀。在造模末期，大鼠偶見醉酒表現(xiàn)，開始對酒精產生耐受。

2.2生化指標變化

相較于正常組，模型組血清TG、ALT、TC、AST、FFA明顯增加(P<0.05)；相較于模型組，蜂膠高劑量和易善復能組的大鼠血樣各項指標得到明顯改善(P<0.05)；相較于易善復組，除FFA外其他指標蜂膠高劑量組并未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05，見表1)，這提示兩組之間具有相同的治療效果。

表1各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、FFA測定比較(n=10)

Table 1Comparison of serum AST, ALT, TG, TC and FFA among five groups(n=10)

組別 ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FFA(mmol/L)正常組93.9±11.3164.6±8.91.48±0.331.87±0.450.81±0.24模型組145.4±19.3#172.2±15.43.56±1.22#2.93±2.51#2.02±1.03#易善復組112.9±20.4#*162.6±54.6*2.12±0.71#*2.08±1.48#*1.24±0.98#*蜂膠低劑量組125.0±36.8*▲164.1±42.22.94±1.28▲2.17±1.501.65±0.52*▲蜂膠高劑量組111.1±41.0*159.4±58.5*2.31±0.65*1.96±1.14*1.52±0.79*▲

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復組比較，▲P<0.05

2.3相關炎癥因子改變

與模型組比較，蜂膠高劑量組和易善復組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中蜂膠高劑量組降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的效果優(yōu)于易善復組(P<0.05，見表2)，接近正常組。

2.4大鼠肝質量及臟器系數(shù)變化

與正常組比較，模型組大鼠的肝質量及肝臟器系數(shù)顯著增高(P<0.05)，表明模型組大鼠肝臟明顯腫大，提示造模成功。相較于模型組，在肝臟器系數(shù)的抑制效果上來說，蜂膠高劑量組和易善復組兩組大鼠具有明顯的優(yōu)勢，并且這兩個組之間沒有明顯的差異(P>0.05，見表3)。

表2各組大鼠IL-6,IL-8,TNF-α比較(n=10)

Table 2Comparison of IL-6,IL-8 and TNF-α among five groups(n=10)

組別 IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(ng/ml)正常組1.48±0.752.16±0.9234.48±10.33模型組2.75±0.82#4.21±1.54#52.56±4.25#易善復組2.02±0.96#*2.66±1.06*38.12±12.71*蜂膠低劑量組1.97±0.88*3.52±2.01▲41.94±13.28*蜂膠高劑量組1.81±0.69*▲3.23±1.25*▲32.31±14.65*▲

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復組比較，▲P<0.05

表3各組大鼠肝重及臟器系數(shù)測定比較(n=10)

Table 3Comparison of liver weight and liver organ coefficient among five groups(n=10)

組別體質量(g)肝質量(g)肝臟器系數(shù)正常組 300±3910.36±2.033.43±0.39模型組 225±33#11.62±1.74#5.19±0.57#易善復組230±3210.10±2.03*4.39±0.68*#蜂膠低劑量組222±2711.22±1.66▲5.07±0.67▲蜂膠高劑量組223±2810.76±2.034.73±0.73*

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復

組比較，▲P<0.05

2.5大鼠肝臟病理改變

正常組大鼠的肝細胞是多角形的，圓形的細胞核處于細胞中央，胞質著色嗜酸性。以中央靜脈為中心肝細胞呈現(xiàn)出放射形的整齊排列，并未發(fā)現(xiàn)較為嚴重的脂肪沉淀(見圖1A)。模型組大鼠的肝細胞則發(fā)生了彌漫性的中度脂肪變性，在胞質中出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡，在胞質的一側出現(xiàn)了較大的空泡，細胞核的周圍則密密麻麻的分布著眾多小空泡，在匯管區(qū)能夠辨識到炎性的細胞浸潤，細胞出現(xiàn)水腫和壞死現(xiàn)象(見圖1B)。易善復組大鼠的脂肪空泡明顯變少，但是，在匯管區(qū)仍然能夠觀察到炎性的細胞浸潤(見圖1C)。蜂膠高劑量組和蜂膠低劑量組可見輕度的細胞水腫，脂肪空泡減少，匯管區(qū)未見明顯的炎性細胞浸潤(見圖1D、1E)。

A.正常組　　　　　　B.模型組　　　　　C.易善復組　　　　D.蜂膠高劑量組　　　E.蜂膠低劑量組 圖1　大鼠肝臟病理學改變 (HE,×200)Figure 1　Pathological changes of liver in rats in different groups (HE,×200)

3　討論

脂肪肝是指由多病因誘發(fā)的肝細胞脂肪過量沉積或者血脂的代謝功能出現(xiàn)異常等一系列的病變[8]。脂肪肝是引發(fā)動脈硬化、冠心病以及腦溢血等疾病的重要因素，其治療以防治結合最為重要[9]。到目前為止，尚無治療脂肪肝的特效藥，西醫(yī)多用降脂藥物來代替治療。一些調脂藥物雖然對脂肪肝治療有效，但卻存在潛在的肝毒性，會加重肝臟損傷[10]。因此，如果能夠找到一種既有調脂功能又有保肝功能的藥物，將會為廣大的脂肪肝患者帶來福音。

蜂膠中含有有機酸類、烯萜類化合物、黃酮、芳香揮發(fā)油等豐富的營養(yǎng)成分，具有廣泛的生理和藥理作用，能起到保護肝臟的效果，為一種防治脂肪肝的首選良藥[11]。但目前國內外對蜂膠在脂肪肝中調節(jié)機制的相關報道較少。因此，本研究建立了復合型脂肪肝的動物模型，并用蜂膠提取物進行治療。結果發(fā)現(xiàn)：蜂膠在降低血清TC、ALT、TG、AST指標以及肝細胞脂肪空泡方面具有明顯效果，并且可以抑制FFA的產生，與此同時，實驗還發(fā)現(xiàn)蜂膠在消炎方面也具有一定的功效，能夠有效抑制血清中炎癥因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的作用。蜂膠中有可能具有某種活性成分，能對已破壞的肝細胞膜進行生理性修復，減少氧激酶與脂質的過氧化，從而更好地降低了炎癥反應。

近幾年，相關領域的研究專家將更多的精力傾注于細胞因子與肝病的關聯(lián)性研究上，在肝細胞脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化的病史發(fā)展中，細胞因子起到了決定性的因素[12-15]。

肝臟在脂肪變性初次打擊后，由于自然殺傷T細胞的耗盡，使具有抗炎作用的Th-2細胞因子相對不足，進而使肝臟長期處于炎癥反應環(huán)境中，NF-κB被激活，多種炎癥因子如TNF-α、IL-8、IL-6產生增加，使肝細胞氧化應激、凋亡，并引起大量炎癥細胞浸潤。當肝臟不能拮抗上述過程時，最終導致脂肪性肝炎的發(fā)生。在肝臟，TNF-α由枯否細胞分泌，是肝臟損害過程中出現(xiàn)最早的炎癥因子，在單純性脂肪肝進展為脂肪性肝炎中扮演著重要角色[16]。

IL-6參與肝臟炎癥損害、肝臟脂肪氧化和三酰甘油的清除。而高胰島素血癥可以引起肝臟脂肪酸聚集，形成肝脂舫變性。臨床上用抑制IL-6活性的方法，提高機體對胰島素的敏感性，進而防治脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[17]。Yamaguchi等[18]用托珠單抗(Tocilizumab，IL-6受體的特異性抗體)干預脂肪肝小鼠，發(fā)現(xiàn)肝IL-6信號的嚴重抑制可能促進脂肪肝的進展。Kroy等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6/糖蛋白130信號傳導缺陷的小鼠更易發(fā)生肝脂肪變性及損傷，促進脂肪肝的進展。

目前有關 IL-8在NAFLD中作用及其可能機制的研究較少[20]。肝臟脂肪變性可使IL-8產生增加，IL-8活化并趨化中性粒細胞，參與肝細胞的炎癥損傷[17]。此外，F(xiàn)FA與炎癥因子的相互調節(jié)在脂肪肝中也有非常重要的意義[21]，當發(fā)生脂肪肝病變時，血樣檢測往往會呈現(xiàn)出血清FFA指標上升的現(xiàn)象。

脂肪肝的發(fā)病機制在國際上一直存在較多的爭議，炎癥因子在其中所占的比例尚不完全清楚。此次試驗表明，雖然蜂膠在抑制炎癥因子(FFA、IL-6、IL-8、TNF-α)的影響上具有一定的功效，改善肝臟的炎性損傷和脂肪變性程度，有助于肝細胞的結構和功能恢復正常，但蜂膠中具體哪些活性成分起到主要作用，控制了炎癥因子是否就可以預防脂肪肝的發(fā)生等問題還有待大規(guī)模的實驗研究。

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Research on efficacy of propolis in rats with fatty liver and its mechanism

WANG Yao1，YANG Biao2，LI Zhuo1*

(1DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Lizhuo721@163.com)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of prololis on fatty liver in rats and its mechanism.MethodsFifty rats were randomly divided into normal group, model group, polyene phosphatidylcholine group, high dose of propolis group, low dose of propolis group(n=10 in each group). The fatty liver model was induced by feeding high fat emulsion and 56% alcohol and injecting carbon tetrachloride in abdominal cavity. After the last administration and fasting for 16 h, the blood was collected from the femoral artery to detect the level of aspertate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), triglyceride(TG), cholesterol(TC),free fatty acids(FFA), interleukin-6(IL-6), interleukin-8(IL-8) and tumor necrosis factor α(TNF-α). The liver was removed to calculate the liver organ coefficient and observe the pathological changes.ResultsThe fatty liver rat model was established successfully. Compared with model group, the blood levels of AST, ALT, TG, TC, FFA in high dose group reduced significantly(P<0.05).The effect was better in high dose group than in low dose group, but close to that in polyene phosphatidylcholine group. Compared with model group, the blood levels of IL-6, IL-8 and TNF-α in high dose group decreased significantly(P<0.05). The liver organ coefficient in high dose group was lower than in model group(P<0.05). The edema and necrosis in hepatic cells were rare in high dose group, and the fat vacuoles decreased.ConclusionPropolis has obvious therapeutic effect on fatty liver in rats, which may be related to the changes of serum levels of inflammatory factors.

propolis;fatty liver;inflammatory factor;high fat emulsion;rats

陜西省教育廳專項科研計劃資助項目(2010JK803)

王瑤，女，1984-04生，碩士，主管技師，講師，E-mail：95244556@qq.com

2016-05-29

R575

A

1007-6611(2016)08-0693-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.004