馮玉枚,肖玲玲,郭金玲,呂育財,余華順,姚　鵑,龔大春,*

(1.三峽大學(xué)艾倫麥克德爾米德再生能源研究所,湖北宜昌 443002;2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖北宜昌 443002;3.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002)

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β-葡萄糖苷酶粗酶液的超濾條件研究

馮玉枚1,肖玲玲2,郭金玲1,呂育財1,余華順3,姚鵑3,龔大春1,*

(1.三峽大學(xué)艾倫麥克德爾米德再生能源研究所,湖北宜昌 443002;2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖北宜昌 443002;3.安琪酵母股份有限公司酵母功能湖北省重點實驗室,湖北宜昌 443002)

采用超濾技術(shù)分離純化β-葡萄糖苷酶粗酶液,以膜通量、回收率和比酶活為綜合評價指標(biāo),篩選出合適的截留分子量的膜材料,并進(jìn)一步考察了進(jìn)口壓力、回流壓力、粗酶液固形物含量、膜過濾時間等因素對β-葡萄糖苷酶粗酶液超濾濃縮的影響。結(jié)果表明,β-葡萄糖苷酶粗酶液最佳超濾工藝條件為:選用50 ku的超濾膜,對0.9%的料液濃度在進(jìn)口壓0.12 MPa、回流壓0.08 MPa條件下超濾20 min,濃縮倍數(shù)達(dá)3倍,β-葡萄糖苷酶回收率達(dá)95.05%,比酶活提高1.24倍,平均膜通量達(dá)96.0 L/(m2·h)。用超濾膜濃縮β-葡萄糖苷酶具有工藝簡單、能耗低、綠色環(huán)保、β-葡萄糖苷酶活性損失小等優(yōu)點,為β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)放大奠定基礎(chǔ)。

β-葡萄糖苷酶,超濾,濃縮,比酶活

木質(zhì)纖維素是自然界中最豐富的可再生資源,利用酶法水解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇和其他生物化工產(chǎn)品是緩解能源短缺、推進(jìn)生態(tài)環(huán)保最具潛力的技術(shù)手段之一[1]。β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)是纖維素酶的關(guān)鍵成分之一,作用于纖維二糖或纖維寡糖,使纖維素最終水解為葡萄糖分子[2]。目前,β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在菌種選育、發(fā)酵工藝及酶學(xué)性質(zhì)的研究。蘇香萍等[3]以黑曲霉為出發(fā)菌株,通過紫外誘變獲得一株高產(chǎn)纖維素酶菌株,其β-葡萄糖苷酶活力達(dá)47.33 U/mL。此外,利用基因工程手段構(gòu)建工程菌和通過蛋白質(zhì)工程手段改造酶蛋白為β-葡萄糖苷酶工業(yè)化生產(chǎn)提供了新途徑[4-5]。劉敏,歐陽嘉等[6]研究了培養(yǎng)條件對黑曲霉液體發(fā)酵制備β-葡萄糖苷酶的影響及β-葡萄糖苷酶的表觀酶學(xué)性質(zhì)。閆會平,陳士華等[7]介紹了近年來黑曲霉β-葡萄糖苷酶的酶解特征、酶學(xué)性質(zhì)、催化機(jī)制、活性中心、生物學(xué)功能及應(yīng)用技術(shù)等方面的研究進(jìn)展。但是對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液下游分離純化工藝的研究較少。本文采用聚砜醚類樹脂作為膜材料對β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵液進(jìn)行超濾工藝條件的研究,為濃縮酶和固態(tài)酶的工業(yè)化生產(chǎn)放大奠定良好基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

β-葡萄糖苷酶粗酶液實驗室自備。黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后,用醋酸-醋酸鹽緩沖溶液浸提,過濾后于4 ℃冰箱保存。Sartocon Slice超濾設(shè)備德國賽多利斯;電子天平上海岳平科學(xué)儀器有限公司;尤尼柯uv-2000紫外分光光度計上海儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱BPC-250F上海一恒科技有限公司;電冰箱GSAZG青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1超濾裝置超濾實驗裝置如圖1所示,料液經(jīng)進(jìn)料泵加壓至膜組件進(jìn)行濃縮,通過調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速及回流閥閥門控制進(jìn)口壓力和回流壓力。超濾實驗采用濃縮方式進(jìn)行,測定相應(yīng)時間下的膜通量、濃縮液的酶活、蛋白含量及固含量和透析液酶活。實驗過程料液固含量控制范圍為0.3%～1.5%,操作溫度范圍為10～20 ℃,操作壓力范圍為0.04～0.18 MPa。

圖1　裝置示意圖Fig.1　Schematic diagram of ultrafiltration device

1.2.2超濾實驗

1.2.2.1超濾膜截留分子量的選擇在進(jìn)口壓力0.1 MPa,回流壓力0.05 MPa條件下,分別用截留分子質(zhì)量為100、50、30、10、5 ku的超濾膜對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮,濃縮3倍后分別測定β-葡萄糖苷酶的回收率、平均膜通量及比酶活。

1.2.2.2超濾進(jìn)口壓力對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液濃縮效果的影響設(shè)定超濾進(jìn)口壓力分別為0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 MPa,回流壓力0.05 MPa的條件下采用50 ku的超濾膜對β-葡萄糖苷酶粗酶液進(jìn)行超濾,濃縮3倍后,分別測定β-葡萄糖苷酶的回收率和膜通量及比酶活。

1.2.2.3超濾回流壓力對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液濃縮效果的影響設(shè)定超濾回流壓力分別為0.04、0.06、0.08、0.1 MPa,進(jìn)口壓力0.12 MPa的條件下采用50 ku的超濾膜對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液進(jìn)行超濾,濃縮3倍后,分別測定β-葡萄糖苷酶的回收率和膜通量及比酶活。

1.2.2.4料液濃度對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液濃縮效果的影響設(shè)定發(fā)酵液液中固形物含量分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%時,進(jìn)口壓力0.12 MPa,回流壓力0.08 MPa的條件下采用50 ku的超濾膜對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液進(jìn)行超濾,濃縮3倍后,分別測定β-葡萄糖苷酶的回收率和膜通量。

1.2.2.5恒壓模式超濾膜通量衰減曲線在進(jìn)口壓力0.12 MPa,回流壓力0.08 MPa的條件下采用50 ku的膜超濾粗酶液,考察β-葡萄糖苷酶粗酶液在恒壓模式超濾膜通量衰減曲線。

1.2.3檢測方法

1.2.3.1膜通量在一定的操作壓力下,單位時間內(nèi)透過單位膜表面積的液量,用符號Jv表示,單位為L/m2·h

V為透過液體積(L);Sm為超濾膜面積(m2);t為系統(tǒng)穩(wěn)定后超濾時間(h)。

1.2.3.2β-葡萄糖苷酶酶活采用紫外分光光度法[8]取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL,加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的水楊苷溶液(溶于pH4.8的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中),50 ℃水浴保溫30 min,加入3 mL DNS試劑,沸水浴10 min,冷卻后加水稀釋到25 mL,在540 nm測吸光度。以等量的酶液按照同樣方法處理作空白。

1.2.3.3β-葡萄糖苷酶回收率

1.2.3.4β-葡萄糖苷酶比酶活

1.2.3.5濃縮倍數(shù)的計算

式中n為體積濃縮倍數(shù),V1為原酶液體積L,V2為濃縮液體積L。

1.2.3.6料液固形物含量測定采用烘干法測定[9]:先將潔凈表面皿稱重,質(zhì)量為W,然后稱取W1樣品于表面皿中,120 ℃干燥至恒重,冷卻至室溫后稱重為W2。

2　結(jié)果與分析

2.1超濾膜截留分子量的選擇

超濾不但可以濃縮粗酶液,同時也可以去除粗酶液中的雜蛋白、無機(jī)鹽等小分子物質(zhì),從而實現(xiàn)分離純化。由圖2可知,隨著超濾膜截留分子量的增大,平均膜通量快速上升,但分子量達(dá)到100 ku時,回收率急劇下降,表明β-葡萄糖苷酶可以透過截留分子量為100 ku的膜。實驗表明,在膜截留分子量小于30 ku時,由于平均膜通量小,超濾時間長,導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶在濃縮過程中損失率較高;而在膜截留分子量大于30 ku時,隨著濾膜截留分子量的增大,大部分小分子蛋白質(zhì)、多肽等有機(jī)物可以透過超濾膜,從而實現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的純化。比酶活在膜截留分子量小于30 ku時,隨著膜截留分子量的增加而減小;在膜截留分子量大于30 ku時,隨著膜截留分子量的增加而增大。這可能與β-葡萄糖苷酶的空間結(jié)構(gòu)及膜的性質(zhì)有關(guān),當(dāng)膜截留分子量小時,隨著膜截留分子量的增加,β-葡萄糖苷酶在膜表面的機(jī)械截留、在膜孔中的阻塞及在膜表面及孔內(nèi)吸附增加,導(dǎo)致比酶活降低;當(dāng)膜截留分子量較大時,小分子多肽、雜蛋白等物質(zhì)更容易透過膜,使比酶活升高[10]。綜合考慮三方面因素,選用50 ku超濾膜濃縮β-葡萄糖苷酶粗酶液比較合適。

圖2　不同截留分子量 對β-葡萄糖苷酶超濾濃縮效果的影響Fig.2　Effect of different molecular weight cutoff on β-Glucosidase ultrafiltration and concentration

2.2超濾進(jìn)口壓力對β-葡萄糖苷酶回收率、膜通量和比酶活的影響

在超濾的過程,進(jìn)料泵提供的進(jìn)口壓力是料液濾過膜(通過膜材料)的驅(qū)動力,在一定的壓力范圍內(nèi),進(jìn)口壓力越大,溶質(zhì)就越容易通過超濾膜,但在濃縮過程中超濾膜存在著臨界壓力,低于臨界壓力時,膜通量均隨壓力的增加而上升,當(dāng)壓力超過臨界壓力時,膜通量隨壓力的增加而有所下降。主要是由于壓力超過臨界壓力后,膜孔的堵塞加劇,凝膠層變厚,致使膜通量下降[11-12]。由圖3可知,本實驗臨界壓力介于0.14～0.16 MPa之間,超過0.14 MPa后,膜通量有明顯下降。回收率隨著壓力升高先升高后降低,主要是壓力較低時,膜通量小,超濾時間越長,酶活損失越大,同時,隨著壓力上升,膜受壓后厚度、孔徑及表面電荷發(fā)生變化[13],導(dǎo)致小分子蛋白增加,比酶活上升。當(dāng)壓力大于0.1 MPa時,由于料液在膜內(nèi)的流速提高,料液在膜表面形成的剪切力明顯增大,導(dǎo)致蛋白的變性使回收率及比酶活下降顯明。為保證酶活性,縮短濃縮時間,提高生產(chǎn)效率,選擇0.12 MPa作為粗酶液在超濾過程中的進(jìn)口壓力。

圖3　進(jìn)口壓力對β-葡萄糖苷酶超濾濃縮效果的影響Fig.3　Effect of different inlet pressure on β-Glucosidase ultrafiltration and concentration

2.3超濾回流壓力對β-葡萄糖苷酶回收率和膜通量的影響

膜過濾是以膜兩側(cè)的壓力差(跨膜壓差)為驅(qū)動力的篩分過程,跨膜壓差計算公式為:

式中:Pin為膜進(jìn)口壓力,Pout為膜回流壓力,Pp為透析液出口壓力。

由于透析液出口與大氣相通,Pp=0,故在Pin相同的情況下,跨膜壓差隨Pout增大而增大,同時,因為Pout由回流閥控制,Pout越大表明回流速度越慢,膜表面的流速越小。由圖4可知,在進(jìn)口壓力不變情況下,隨著回流壓力升高,膜通量先升高后趨于平穩(wěn),比酶活呈上升趨勢,而回收率先升高后下降。隨著跨膜壓差的升高,膜通量隨之上升,但由于回流量的減小,膜表面回流速下降,剪切力下降,導(dǎo)致濃差極化現(xiàn)象明顯,膜污染嚴(yán)重,從而阻礙了膜通量的上升[14]。小分子蛋白、多肽等物質(zhì)隨著趨動力增加,更容易透過超濾膜,濃縮液中比酶活隨之升高。由于剪切力的下降和膜通量升高導(dǎo)致超濾時間縮短,回收率隨之上升,但壓力高于0.08 MPa后,由于溫度升高明顯,導(dǎo)致酶活損失增加。因此回流壓力選擇0.08 MPa。

圖4　回流壓力對β-葡萄糖苷酶超濾濃縮效果的影響Fig.4　Effect of different outlet pressure on β-Glucosidase ultrafiltration and concentration

2.4酶液中固形物含量對β-葡萄糖苷酶回收率和膜通量的影響

由于β-葡萄糖苷酶的粗酶液是一種成分復(fù)雜的混合體系,其中所含的大分子雜質(zhì)和無機(jī)鹽,在超濾的過程中膜容易污染導(dǎo)致通量降低。超濾過程中,料液濃度對超濾的回收率和膜通量具有較為重要的影響。由圖5可知,在其它條件不變的情況下,料液濃度越大,膜通量越來越小,超濾時間越長,回收率越低。因為在較高的料液濃度下,容易使?jié)獠顦O化加劇并形成多層吸附[15],引起回收率和膜通量的下降。當(dāng)料液濃度較低時(固形物含量低于0.9%),膜通量下降較為平緩,因此對粗酶液的濃度應(yīng)控制在0.9%以下。工業(yè)生產(chǎn)中通過加強(qiáng)料液的預(yù)處理,降低料液中雜質(zhì)濃度是提高酶的回收率、降低生產(chǎn)成本的有效途徑。

圖5　固形物含量對β-葡萄糖苷酶超濾濃縮效果的影響Fig.5　Effect of different solid content on β-Glucosidase ultrafiltration and concentration

2.5恒壓模式下膜通量衰減曲線

如圖6所示,在恒壓模式超濾過程中,隨著超濾時間的延長,膜通量會逐漸下降。開始下降速度較快,因為濃差極化的加重,膜通量衰減迅速,隨后膜通量衰減速度減緩,是因為在錯流過濾過程中,在膜表面料液的剪切力作用下,抑制了濃差極化產(chǎn)生的凝膠層的形成。隨著超濾的進(jìn)行,料液濃度越來越高,濃差極化現(xiàn)象越來越明顯,導(dǎo)致膜通量持續(xù)下降。為提高生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本,超濾時間可控制在20 min左右,此時平均膜通量在108 L/(m2·h)以上。

圖6　恒壓模式下膜通量衰減曲線Fig.6　Flux decline curve in constant pressure ultrafiltration process

2.6超濾前后酶液成分變化及優(yōu)化效果

超濾前原酶液主要有緩沖液成分醋酸和醋酸鈉、發(fā)酵用無機(jī)鹽、菌體分泌的酶和雜蛋白質(zhì),其中鹽含量為1.45%,蛋白含量為0.5%。利用SDS-PAGE方法測定蛋白分子量,由電泳圖譜可知,所分離的酶中至少有五種蛋白,按分子量從大到小依次編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,分子量分別為97.4、64、53、28、15 ku。通過酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),I具有β-葡萄糖苷酶酶活,是要重點關(guān)注的酶,Ⅱ、Ⅲ分別具有纖維素內(nèi)切酶和外切酶酶活;Ⅳ、Ⅴ均不具有上述三種酶活,是發(fā)酵過程中的雜蛋白,可以去除。在酶的實際應(yīng)用中由于需要纖維素內(nèi)切酶和外切酶,因此在酶的分離純化中沒有進(jìn)一步去除。

綜合考慮膜材料的孔徑條件、料液濃度、進(jìn)口壓力和出口壓力,在50 ku超濾膜,小于0.9%的料液濃度,在超濾的進(jìn)口壓力0.12 MPa,回流壓力0.08 MPa,超濾時間20 min的條件下,β-葡萄糖苷酶回收率達(dá)95.05%,比酶活提高1.24倍,此過程的平均膜通量為96.0 L/(m2·h)。分析表明,經(jīng)過50 ku超濾后,酶液中小分子鹽類僅含有0.32%,除掉了絕大部分小分子鹽類物質(zhì)和雜蛋白,截住了大部分所需要的酶。圖7中的1、2分別是利用50 ku、30 ku膜材料過濾濃縮后蛋白質(zhì)電泳圖。研究表明:超濾單元操作達(dá)到了濃縮分離β-葡萄糖苷酶的目的。

圖7　超濾前后酶液電泳圖Fig.7　Eelectrophoresis of Enzyme Liquid after ultrafiltration

3　結(jié)論

本研究以黑曲霉固態(tài)發(fā)酵得到β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液,采用超濾技術(shù)濃縮粗酶液,實驗探討了不同截留分子量的超濾膜、進(jìn)口壓力、回流壓力、料液固形物含量、超濾時間對β-葡萄糖苷酶發(fā)酵液濃縮過程后的回收率、膜通量及比酶活的影響。得到優(yōu)化的超濾條件,即采用50 ku超濾膜,小于0.9%的料液濃度,在超濾的進(jìn)口壓力0.12 MPa,回流壓力0.08 MPa,超濾時間20 min的條件下,β-葡萄糖苷酶回收率達(dá)95.05%,比酶活提高1.24倍,平均膜通量達(dá)96.0 L/(m2·h)。通過對比粗酶液和濃縮后酶液的主要成分比較表明,β-葡萄糖苷酶固態(tài)發(fā)酵萃取液可以通過超濾單元操作有效濾去小分子鹽類物質(zhì)和雜蛋白,實現(xiàn)β-葡萄糖苷酶的濃縮和純化,為中試放大提供了科學(xué)依據(jù)。

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Study on ultrafiltration conditions forβ-glucosidase crude enzyme liquid

FENG Yu-mei1,XIAO Ling-ling2,GUO Jin-ling1,LV Yu-cai1,YU Hua-shun3,YAO Juan3,GONG Da-chun1,*

(1.Alan G.Macdiamid Institute of Renewable Energy,China Three Gorges University,Yichang 443002,China;2.Hubei Three Gorges Polytechnic,Yichang 443002,China;3.Angel Yeast Co.,Ltd,Yeast Function of Hubei Key Lab,Yichang 443002,China)

β-Glucosidase crude enzyme liquid by ultrafiltration was purified.The appropriate molecular weight cutoff of the ultrafiltration membrane was screened by taking the membrane flux,recovery and specific activity as comprehensive indexes.Then the effects of inlet pressure,outlet pressure,crude enzyme liquid solid content onβ-glucosidase ultrafiltration were studied.The results showed the optimal conditions were as follows:under these conditions of molecular weight cutoff of ultrafiltration membrane 50 ku,0.9% feed concentration of crude enzyme solution,inlet pressure 0.12 MPa,outlet pressure 0.08 MPa,operate time 20 min,β-glucosidase crude enzyme liquid was concentrated by three times,the specific activity ofβ-glucosidase was increased by 1.24 times with 95.05% total recovery,and the average membrane flux can reach 96.0 L/(m2·h).Ultrafiltration membrane process for purificationβ-glucosidase was simple and the purifiedβ-glucosidase can remain high activity,thus this method was suitable for industrial production with many advantages of good economic and social benefits and low energy consumption,low cost and no environmental pollution.

β-glucosidase;ultrafiltration;concentration;specific activity

2015-11-02

馮玉枚(1986-),在讀碩士研究生,從事生物催化與生物能源的研究工作,E-mail:631034158@qq.com。

龔大春(1967-),博士,教授,從事生物催化與生物化工方面的教學(xué)與研究,E-mail:185195061@qq.com。

國家自然基金面上項目(21076114);宜昌市科技攻關(guān)項目(A15-101)。

TS205.4

A

1002-0306(2016)09-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.024