謝海偉,方遠見,吳禮珠,王　芬

(蚌埠學院 生物與食品工程系,安徽蚌埠 233030)

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鱟素肽微膠囊的制備工藝及性能研究

謝海偉,方遠見,吳禮珠,王芬

(蚌埠學院 生物與食品工程系,安徽蚌埠 233030)

本文以合成鱟素肽為芯材,以海藻酸鈉和殼聚糖為復合壁材,采用復凝聚法對鱟素肽進行微膠囊化,探討壁材濃度、壁芯材比例、成囊溫度、成囊pH等因素對鱟素肽微膠囊制備工藝的影響,通過單因素實驗和正交實驗對包埋率和粒徑分布進行考察,得到最佳制備工藝參數。并研究微膠囊的形貌特征和粒徑大小分布特征;同時研究鱟素肽微膠囊在模擬胃液、模擬腸液中的緩釋性能,以及微囊化鱟素肽的抗菌活性、蛋白酶環(huán)境下的穩(wěn)定性。結果表明,最佳的工藝條件為:壁材濃度1.5%,壁芯比8∶1,成囊溫度45 ℃,成囊pH5.0;在最佳工藝條件下,鱟素肽微膠囊的包埋率可達84.56%,鱟素肽微膠囊呈規(guī)整圓球形,粒徑主要分布在40～100 μm區(qū)域,平均粒徑大小為76.58 μm;鱟素肽微膠囊在模擬胃液中釋放率為38.54%,在模擬腸液中的釋放率為80.68%,微囊化鱟素肽的抗菌活力是未包埋鱟素肽的80.6%,微囊化鱟素肽比未包埋鱟素肽具有強的蛋白酶耐受性。

鱟素肽,微膠囊,制備工藝,緩釋性能

鱟素肽具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抑制腫瘤細胞增殖和誘導癌細胞分化等生物活性,具有巨大應用價值[1]。鱟素肽和其他抗菌肽相比,分子量更小、抗菌譜更廣、選擇性更高、副作用更低、抗菌效率更強,被看作是一種可替代抗生素類的新型藥物。

然而鱟素肽作為小分子活性肽在體內存在半衰期短、穩(wěn)定性較差、易被體內酶系降解等問題,這使得鱟素肽在口服給藥體系中受到極大的限制,大大降低其臨床應用價值[2]。采用小分子活性肽微膠囊技術,提高多肽類藥物在體內的穩(wěn)定性,實現鱟素肽藥物的緩釋效果,可以提高鱟素的臨床應用價值。以殼聚糖-海藻酸鈉為復合壁材是制備蛋白質類藥物微膠囊常采用的一種方法,殼聚糖和海藻酸鈉均為天然的高分子材料,具有無毒、可降解、相容性好和成膜性好等特點,適于包埋敏感的蛋白、多肽類藥物[3]。海藻酸鈉溶液和殼聚糖稀酸溶液混合后,通過靜電作用力形成聚電解質膜,靜電作用力不需要高溫的熱交聯(lián)過程和化學交聯(lián)中共價鍵的形成,對蛋白質和肽類等半衰期短、穩(wěn)定性差的藥物是一種良好的載體[4]。目前制備微膠囊的方法很多,但在保持蛋白類藥物生物活性的基礎上,能夠有效地減小微膠囊的粒徑、提高對藥物的負載能力、并對藥物進行控釋或緩釋,仍是蛋白質給藥系統(tǒng)應用的瓶頸問題。

本文以合成的鱟素肽為實驗原料,選擇海藻酸鈉和殼聚糖為復合壁材對鱟素肽進行微膠囊處理,優(yōu)化微膠囊制備工藝,并對微膠囊的表征性能進行分析,為其開發(fā)成臨床藥物奠定堅實的基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鱟素肽氨基酸序列NH2-K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-CONH2由上海黙悉生物科技有限公司合成,純度95%,采用Fmoc多肽固相合成法合成,合成的鱟素肽樣品用反相高效液相色譜純化,利用質譜確定分子量,通過與理論分子量的比較判斷合成效果。殼聚糖,海藻酸鈉,無水氯化鈣,醋酸均購自于上海生工,均為分析純。

S-3700掃描電子顯微鏡日本日立公司;MS2000激光粒度分析儀英國馬爾文公司;Waters 600E高效液相色譜、Waters ZQ2000質譜儀美國Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1復凝聚法制備鱟素肽微膠囊的工藝優(yōu)化將殼聚糖溶于1%醋酸溶液,使殼聚糖濃度為1%,加入無水氯化鈣攪拌均勻。另配制3%的海藻酸鈉水溶液,使復合壁材殼聚糖與海藻酸鈉比例為3∶1,在海藻酸鈉水溶液中加入鱟素肽,使其終濃度為40 mg/L,將含鱟素肽的海藻酸鈉溶液緩慢滴加到等體積的殼聚糖氯化鈣溶液中,45 ℃水浴,并用醋酸調到pH5.0,不斷攪拌,20 min后移開水浴,3000 r/min離心15 min,洗滌數次,將沉淀物于45 ℃烘箱中干燥即得微囊粉末[5]。

1.2.1.1單因素實驗選取復合壁材濃度、壁材芯材質量比、成囊溫度、成囊pH四個因素。采用復合壁材濃度為(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%);壁材芯材質量比(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1);成囊溫度(30、35、40、45、50、55 ℃);成囊pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)進行單因素實驗,分析各因素對鱟素肽微膠囊包埋率的影響。

鱟素肽微膠囊包埋率(%)=最初加入鱟素肽的量-上清液中鱟素肽的量/最初加入鱟素肽的量×100

1.2.1.2正交實驗設計為了優(yōu)化制備工藝,根據以上單因素實驗統(tǒng)計分析結果,確定以復合壁材濃度%(A)、壁材∶芯材質量比(B)、成囊溫度(C)、成囊pH(D)為影響因素,每個因素選取3個水平,以微囊的包埋率為優(yōu)化指標,用正交實驗設計L9(34)(見表1)。

表1　L9(34)正交實驗設計表Table 1　Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2鱟素肽微膠囊的表征

1.2.2.1掃描電子顯微鏡對微膠囊形貌觀察將正交優(yōu)化實驗制備的鱟素肽微膠囊樣品放在95%乙醇中,在功率100 W超聲分散器中分散30 min,吸取樣品到蓋玻片上,待乙醇揮發(fā)后,在40 ℃進行真空干燥12 h,制作分散好的微膠囊的樣品[6]。再對樣品進行噴金,隨后將樣品放到S-3700的掃描電鏡下觀察,并在放大倍數為1000倍進行拍攝得到電鏡圖片。

1.2.2.2微膠囊微粒粒徑分析將正交優(yōu)化實驗制備的微膠囊樣品,100 W的超聲分散器中分散60 min,再以水為分散劑,25 ℃條件下,具體參照文獻[7]方法,通過MS2000激光粒度分析儀測得微膠囊的粒徑平均值以及粒徑分布狀況。

1.2.3鱟素肽微膠囊體外釋放實驗人工模擬胃液、腸液參照中國藥典(2010版)的方法配制;然后進行鱟素微膠囊在人工模擬消化環(huán)境中的釋放實驗。稱取干燥的微膠囊500 mg裝入錐形瓶,加入新配制的人工胃液100 mL,37 ℃下混合均勻,每隔1 h取樣處理,在280 nm波長處測定吸光度,檢測鱟素肽含量的變化。計算釋放率,繪制釋放曲線[8]。采用上述同樣的方法測定鱟素肽在模擬腸液中的釋放率。釋放率和載藥率的計算如下:

釋放率(%)=模擬胃(腸)液中釋放的總肽量(g)/加入微膠囊的重量(g)×載藥率×100

載藥率(%)=最初加入鱟素肽的量-上清液中鱟素肽的量/微膠囊的量×100

1.2.4鱟素微膠囊生物活性研究

1.2.4.1鱟素肽微膠囊抗菌特性實驗分別配制濃度80 mg/L的未包埋鱟素和微膠囊化鱟素溶液為母液,經2倍稀釋后,分別對大腸桿菌K88進行抑菌實驗,采用瓊脂糖孔穴擴散法[9]測定抗菌活力,以未包埋鱟素肽的抗菌活力定為100,微膠囊化鱟素肽的抗菌活力與其作對照,測得微膠囊鱟素肽的相對抗菌活力,分析未包埋鱟素肽和微膠囊鱟素肽的抗菌活力的變化。

1.2.4.2鱟素肽微膠囊對蛋白酶環(huán)境穩(wěn)定性實驗采用1.2.4.1的方法配制未包埋鱟素肽和微膠囊鱟素肽溶液樣品,待測樣品在不同蛋白酶溶液中的耐受性實驗參照文獻[10]的方法,以未包埋鱟素肽在水溶液的抗菌活力規(guī)定為100,未包埋鱟素肽和微膠囊化鱟素肽在蛋白酶溶液下的抗菌活力與其作對照。分析未包埋鱟素肽和微膠囊鱟素肽對蛋白酶耐受性的變化。

1.2.5數據處理實驗均做3次重復,數據用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理,數據以均數±標準差(X±s)表示,用Origin8.5作圖。

2　結果與討論

2.1復合壁材濃度對微膠囊性能的影響

從圖1可知,微膠囊的包埋率隨復合壁材濃度增加呈變化趨勢,當復合壁材濃度小于1.5%時,包埋率逐漸增加;當濃度達到1.5%時,包埋率達到最高值83.8%;當濃度大于1.5%時,包埋率反而下降。另外,隨著復合壁材濃度的增大,微囊平均粒徑也隨之逐漸增大,壁材濃度在0.5%～1.5%范圍粒徑增大明顯,當濃度1.5%～2.5%范圍粒徑增大緩慢,濃度到2.5%時,平均粒徑最大。低濃度殼聚糖和海藻酸鈉分子易充分、均勻接觸,從而在芯材周圍形成微膠囊壁,隨著濃度的增高,復合壁材中殼聚糖基質可阻止芯材從未固化的微滴擴散進入分散介質,從而使包埋率提高;但殼聚糖濃度過高,會使溶液黏度太大,海藻酸鈉和殼聚糖發(fā)生急劇的聚合反應,產生膠塊,使得壁材不能均勻分散在芯材周圍,導致包埋率下降[11]。造成這一結果的原因是殼聚糖和海藻酸鈉之間靜電相互作用的速度非?？?殼聚糖溶液滴加到海藻酸鈉溶液中,正負靜電作用迅速形成囊膜。

圖1　復合壁材濃度對微膠囊性能的影響Fig.1　The effect of microcapsules by capsule concentration

2.2壁芯材比例對微膠囊性能的影響

從圖2可以看出,壁芯材的比例直接影響到包埋率,壁材比例越大,包埋率越高,壁芯材比為12.0∶1時,包埋率達到最高80.5%。原則上是包埋率越高越好,但考慮到壁材比重太大,會使載藥量降低,因此選擇壁芯材比例為8.0∶1,此時包埋率已達75.2%,可以通過優(yōu)化其它包埋條件進一步提高包埋率。這可能是因為壁材的增加,被包埋的鱟素肽的量將會增加,從而導致微膠囊的包埋率逐漸增加。對于微囊粒徑,當壁芯材比例增大,微囊壁厚度增加,微囊的芯材鱟素肽的量將減少,微膠囊的平均粒徑先減小,后增大;剛開始時隨著海藻酸鈉和殼聚糖加入量的增加,使得海藻酸鈉和殼聚糖可以和芯材鱟素肽在靜電作用力下迅速形成較大的微囊,隨后微囊粒徑減小,當海藻酸鈉和殼聚糖量逐漸增加,微膠囊成囊的壁膜將越來越厚,使得微膠囊的整體粒徑增大。

圖2　壁芯材比例對微膠囊性能的影響Fig.2　The effect of microcapsules by wall core ratio

2.3成囊pH對微囊性能的影響

從圖3可以看出,成囊pH對微膠囊的性能也存在重要的影響。pH從2.0升至5.0時,包埋率呈增加趨勢。當pH5.0時達到最大值85.5%;當pH超過5.0后,包埋率開始下降,此時殼聚糖的成膜性能下降,與海藻酸鈉發(fā)生聚合反應后不能將鱟素肽很好的包裹,當pH提高到6.0時,殼聚糖呈片狀從溶液中析出,不能對芯材進行包埋。實驗得出pH5.0左右成囊效果最好。微膠囊平均粒徑也隨pH變化而改變,變化趨勢和pH對微膠囊包埋率影響類似。成囊體系pH對微囊的包埋率和粒徑大小方面的影響,一方面是因為不同pH下,壁材中殼聚糖的質子化程度不同,導致殼聚糖和海藻酸鈉的靜電相互作用程度不同而引起機械強度和包埋率等方面的差異。另一方面,殼聚糖-海藻酸鈉溶液的pH對所形成膜致密程度產生一定的影響。不同pH下形成的微囊表面可能會呈現致密光滑的結果,也可能形成蜂窩狀的多孔結構,從而對微囊的滲透性及芯材釋放性能產生影響[12]。

圖3　pH對微膠囊性能的影響Fig.3　The effect of microcapsules by pH

2.4成囊溫度對微囊包埋率的影響

從圖4可以看出,成囊溫度對包埋率也存在重要影響,在一定溫度范圍內,隨著溫度的升高,包埋率呈現先升高后降低的變化趨勢,成囊溫度45 ℃時,微膠囊的包埋率達到最大79.5%。適當提高溫度可以提高囊材的溶解性能,使其黏度降低,利于成囊;溫度升高,體系黏度降低,不利于成囊反應的發(fā)生。成囊溫度對微膠囊的平均粒徑也有一定的影響。低溫時,海藻酸鈉和殼聚糖容易形成凝膠,使得平均粒徑較大,隨著溫度的升高,海藻酸鈉和殼聚糖的凝膠不易形成,微膠囊的平均粒徑大大降低。當溫度繼續(xù)上升,可能使得形成的微膠囊囊壁受到破環(huán),使得包埋率有所下降。

圖4　成囊溫度對微囊性能的影響Fig.4　The effect of microcapsules by temperature

2.5正交實驗分析

通過表2的極差分析,影響鱟素肽微膠囊包埋率的四個因素順序為:A(復合壁材濃度)>D(成囊pH)>B(壁材∶芯材)>C(成囊溫度)。由表3方差分析表明,在α=0.05下方差分析得出4個因素對鱟素肽微囊包埋率均無顯著性影響。正交實驗設計得出的最佳制備工藝條件組合為:A2B2C2D2,即殼聚糖濃度1.5%,壁材與芯材的比為8.0∶1,成囊pH為5.0,成囊溫度45 ℃。在該優(yōu)化條件下平行實驗3次,鱟素肽微膠囊平均包埋率為84.56%。

表2　正交實驗設計與結果Table 2　The design and results of orthogonal experiment

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance for orthogonal experiment

2.6鱟素微膠囊形貌觀察

通過掃描電鏡對鱟素微囊進行表征,如圖5所示,優(yōu)化后制備的鱟素肽微膠囊,大多數微膠囊顆粒呈規(guī)則的圓球形,外觀形態(tài)均勻,表面較光滑,沒有空隙,也沒有裂痕,顆粒分散均勻,有少量聚集現象,粒徑的大小也比較均勻,形態(tài)完整、具有良好的球形度、個體間無聚集;少數微膠囊略有凹陷,表面出現褶皺,有裂紋,形狀不規(guī)則,個別出現團聚粘連現象?？赡艿脑蚴菑秃夏鄯ㄔ谥苽溥^程中,操作時間長,沉降凝聚形成微膠囊,粘度低,容易成形且不易破壞其均質結構。

圖5　最佳工藝制得鱟素肽微膠囊的SEM形貌圖(1000倍)Fig.5　Scanning electron micrograph of tachyplesin microcapsules at optimization process(×1000)

2.7微膠囊顆粒粒徑分布分析

采用最佳工藝制備的鱟素微膠囊,通過粒度分析儀測試其粒度的分布情況,結果從圖6可以看出:微膠囊的粒度主要分布集中在3～10 μm和60～100 μm兩個主要分布區(qū)域,其中顆粒粒徑3～10 μm區(qū)域累積分布較少,40～100 μm區(qū)域是主要的微膠囊粒徑分布區(qū),累積分布度較高,鱟素肽膠囊的粒度呈正態(tài)分布,其粒徑主要分布在70～80 μm左右,平均粒徑大小為76.58 μm。這表明鱟素微囊粒徑大小不均一,粒徑分布范圍較寬。

微膠囊微粒粒徑大小分布和微膠囊的制備工藝條件密切相關,可以通過優(yōu)化工藝條件,改善微囊粒徑大小分布。成囊溫度、成囊pH、壁材濃度、CaCl2濃度等因素都能影響成囊微粒的外貌特征和粒徑大小[13]。微膠囊粒徑的分布度是衡量粒度分布范圍的重要參數,從粒度分布度可以看出微膠囊的粒徑分布的集中程度。因此可以根據微膠囊的應用領域對微膠囊的大小進行改造,以適合鱟素微膠囊的生產應用。

圖6　正交實驗所得微膠囊的粒徑分布Fig.6　Particle diameter distributinon of tachyplesin microcapsules at optimization process

2.8鱟素微膠囊體外緩釋和抗菌活性研究

2.8.1體外模擬消化環(huán)境的緩釋實驗鱟素肽微囊在模擬胃液、腸液中的體外釋藥實驗結果見圖7。復凝聚法制備的鱟素肽微囊,開始時有稍微的突釋現象,隨后的各時間段的釋放量都較穩(wěn)定。12 h內,在胃液中的釋放率在25%～39%之間;在模擬腸液中的釋放率在42%～81%之間。

鱟素微囊在模擬胃液和模擬腸液中的釋放存在差異,在模擬胃液中的釋放率比在模擬腸液中慢得多,這是由于溶液pH直接影響微囊溶脹的結果,微囊具有在低pH環(huán)境收縮、高pH溶脹的響應行為[14]。在酸性條件下,微膠囊的復合壁材遭到破壞,導致鱟素肽的釋放,在酸性溶液中停留時間越長,微膠囊表面破壞越嚴重,對被包埋的擴散限制作用越差,進而導致微膠囊在模擬胃液中的控釋能力降低,鱟素肽微膠囊在模擬胃液中釋放率為38.54%,在模擬腸液中12 h后鱟素肽微膠囊釋放率為80.68%,說明鱟素肽微膠囊在人工腸液中具有較好的緩釋效果。

微膠囊的制備工藝、粒徑大小、壁材的性質和壁材的厚度等因素都會影響鱟素微囊緩釋性能。微囊從內到外依次為海藻酸鈣膠核、海藻酸鈉與殼聚糖復合層、殼聚糖沉淀層三層結構,在稀酸中,殼聚糖沉淀層可完全溶解,海藻酸鈉與殼聚糖復合層可部分溶解[15]。由于微囊具有較大的表面積,鱟素肽以游離或者結合方式分布在海藻酸鈉與殼聚糖復合層和殼聚糖沉淀層中,可以在短時間內迅速釋放出來。但在酸性條件下,海藻酸鈉不溶于酸,表現出收縮的性質,導致水分難以進入海藻酸鈣膠核內部而停留在殼聚糖-海藻酸鈉復合層,海藻酸鈣膠核內部的鱟素肽難以被釋放出來。通過復凝聚法制備的微囊可以使鱟素肽在模擬胃液中得到適當保護,在腸液中進行繼續(xù)釋放,避免了頻繁給藥的麻煩。

圖7　鱟素微膠囊在體外模擬消化液釋放曲線Fig.7　Release curve of tachyplesin microcapsules in different media

2.8.2鱟素肽微膠囊生物活性變化從圖8可以看出,復凝聚法制備的微囊對鱟素肽活性具有較好的保護,微囊化的鱟素肽抑制大腸桿菌的抗菌能力比未包埋的鱟素肽抑制效果低,微囊化鱟素肽相對抗菌活力降低為80.6%,抗菌活性有一定損失,但不是很大。而未包埋鱟素肽與微膠囊鱟素肽對蛋白酶環(huán)境耐受性對照實驗表明:未包埋鱟素肽經蛋白酶處理后抗菌活力大大降低至原來活性的38%,微囊化鱟素肽抗菌活力仍然達到原抗菌活力的75%,表明膠囊化鱟素肽在蛋白酶消化液環(huán)境中具有較好的穩(wěn)定性。

圖8　未包埋鱟素和微膠囊鱟素生物活性對照Fig.8　Bioactivity comparison of microcapsules or not

抗菌活性降低可以從以下幾個原因進行解釋:其一就是對包埋后的肽進行活性測定時,是按理論載藥量溶解成和未包埋的肽同一濃度的待測液,而肽含量實際值可能比理論值稍低。另一方面可能是溶解液以及包埋材料會對其抗菌活性及穩(wěn)定性產生略微的影響[16]。但總的看來,微膠囊化鱟素對其的抗菌活性起到了一定抑制作用,但影響較小,而對鱟素肽耐受蛋白酶降解起到保護的作用,增強了鱟素肽的操作條件穩(wěn)定性。微囊化鱟素肽在模擬胃液和腸液中都有較好的緩釋作用,有效的提高多肽類藥物的生物活性及其利用率。

3　結論

本實驗采用復凝聚法對小分子活性肽鱟素微膠囊的制備進行了研究。通過正交實驗確定最優(yōu)的工藝條件為復合壁材濃度為1.5%,壁材芯材比例為8∶1,成囊溫度為45 ℃,成囊pH為5.0,在此條件下,鱟素肽微膠囊的平均包埋率可達84.56%。在最優(yōu)工藝條件下所制得的微膠囊大多數呈規(guī)整球形,粒徑大小合適。微膠囊的平均粒徑76.58 μm,絕大部分的顆粒分布在40～100 μm之間區(qū)域。在模擬胃液中釋放緩慢,而在模擬腸液中得以充分釋放,鱟素肽微膠囊在模擬胃液中釋放率為38.54%,在模擬腸液中的釋放率為80.68%。微膠囊化對鱟素肽的抗菌活性起到了一定抑制作用,微囊化鱟素肽的抗菌活力是未包埋的80.6%,微囊化鱟素肽比未包埋鱟素肽具有強的蛋白酶耐受性,增強了鱟素肽的操作條件穩(wěn)定性。

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Preparation and characterization of microencapsulation of tachyplesin

XIE Hai-wei,FANG Yuan-jian,WU Li-zhu,WANG Fen

(Department of Food and Bioengineering,Bengbu College,Bengbu 233030,China)

In this study,the synthetic tachyplesin peptides were used as core material.Microcapsules containing tachyplesin were prepared by a complex coacervation method with chitosan and sodium alginate as wall material. The wall material concentration,the ratio of wall to core material,the capsule temperature,pH and other factors were investigated to optimize the preparation process of tachyplesin microcapsules.Embedding ratio and particle size distribution were studied using single factor and orthogonal experiments to determine optimal conditions. Morphology and particle size distribution of microcapsules were studied in the optimization process.At the same time,the sustained release effect of tachyplesin microcapsules was studied in simulated gastric and simulated intestinal fluid,and the comparison of antimicrobial activity and stability of the microcapsules with the non encapsulated peptide were also studied in protease environment. The best technological conditions were chitosan and sodium alginate concentration of 1.5%,wall/core material ratio of 8∶1,the capsule temperature of 45 ℃ and the encysted pH of 5.0. Under these optimized conditions,encapsulation efficiency was 84.56%. Tachyplesin microcapsules were regularly spherical,and the particle size was mainly distributed in the 40～100 μm region,the average particle diameter was 76.58 μm. The release rate of tachyplesin peptide microcapsules reached 38.54% in simulated gastric fluid,and 80.68% in simulated intestinal fluid.The antimicrobial activity of the tachyplesin microcapsules was 80.6% of the non-embedded peptide.Microencapsulated tachyplesin with protease tolerance were more stable than non encapsulated tachyplesin.

tachyplesin peptide;microencapsulation;preparation process;sustained release performance

2015-12-18

謝海偉(1978-)，男，博士，副教授，從事酶工程、活性多肽方面研究，E-mail：xiehaiwei324@163.com。

安徽省高等學校自然科學研究重點項目(KJ2015A154)；安徽省大學生創(chuàng)新訓練項目(AH201311305079)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016362)；蚌埠學院學術技術帶頭人后備人選項目。

TS253.1

B

1002-0306(2016)09-0112-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.014